文摘
这项研究旨在评估主要人工培养的内皮细胞的治疗是否与本机低密度脂蛋白(nLDL)可以诱导衰老和发现的一些假定的机制。为此,人类脐静脉内皮细胞亚文化(通过传代形成细胞和/或不断培养与nLDL (0、2、5、10μg蛋白/毫升),9天。结果表明,nLDL抑制扩散HUVECs逮捕细胞周期G1期。G1-arrested细胞胞质senescence-associated——显示增加β牛乳糖(SA -β加)活动,细胞衰老的生物标志物。细胞衰老的致病因素是nLDL本身而不是氧化低密度脂蛋白(oxLDL),因为阻止低密度脂蛋白受体(LDLR) anti-LDLR抗体反对nLDL-induced增加SA -β加活动和减少细胞增殖。此外,nLDL-induced细胞衰老,抑制复审委员会(G1逮捕)的磷酸化通过p53以及p16信号转导途径。G1期逮捕nLDL清除衰老细胞没有克服的培养基。此外,nLDL-treated细胞产生活性氧(ROS)的剂量和时间。这些结果显示,第一次,长期治疗nLDL可能诱发内皮细胞过早衰老。
1。介绍
老化是心血管疾病的主要危险因素之一。老龄化与血管内皮功能障碍的发展(1,2和动脉粥样硬化3- - - - - -5]。据最新研究表明,血管内皮细胞的衰老,即血管老化,可能是一个开发心血管疾病的根本原因6- - - - - -10]。然而,血管衰老的分子机制仍不清楚。
细胞衰老是一种应激反应现象,导致(a)一个永久脱离细胞周期和(b)的外观不同的形态和功能变化与受损的细胞内稳态(6]。细胞衰老可以分为两种类型根据存在或缺乏端粒的缩短(11,12]。细胞衰老导致的重复细胞复制被称为“复制衰老”(13,14]。在这种类型的衰老,端粒的缩短,end-replication问题,和他们的最终障碍被认为是衰老的基本机制归纳。另一种类型的细胞衰老的结果急性衰老应对各种压力条件,如细胞内氧化应激或持久的促有丝分裂的刺激。第二种类型的细胞衰老是称为“压力诱导过早衰老”并不是伴随着端粒缩短(15- - - - - -17]。这两种类型的细胞衰老可以发生在生物体和与疾病和衰老相关的个人(18- - - - - -20.]。
氧化低密度脂蛋白(oxLDL)可以产生各种不利影响血管内皮细胞,如内皮一氧化氮形成的障碍(21),诱导内皮细胞粘附分子的表达(22),诱导的超氧化物阴离子形成维管组织(23),和诱导细胞凋亡24和衰老25内皮细胞。尽管oxLDL扮演着一个重要的角色在细胞衰老,oxLDL水平在健康成年人的血,衡量一个与特定的抗体ELISA试验,约0.12 ~ 0.13 ng /μg LDL载脂蛋白B,这是<总额的0.02%的低密度脂蛋白(26,27]。
实际上,本地的低密度脂蛋白(nLDL),低密度脂蛋白粒子引起的无任何修改任何代理在血液内,几乎没有氧化是由于活动循环抗氧化剂;此外,枯氏细胞和正弦内皮细胞在肝脏迅速移除oxLDL已经生产(28,29日]。血管壁内循环nLDL最可能氧化和扩散进入血液30.,31日]。这些数据也暗示了一个微不足道的贡献oxLDL体内动脉粥样硬化的发展和细胞衰老在缺乏病理条件下,如高脂血症或糖尿病。
原生低密度脂蛋白可能促进单核细胞(招聘32和细胞粘附分子的表达33,34)的令人不安的内皮细胞膜的脂质动态。这些nLDL对血管内皮细胞的影响可能会导致动脉粥样硬化的发展(35]。然而,目前尚不清楚nLDL可能导致细胞衰老的发展。
本机LDL-induced内皮功能障碍和细胞粘附分子的表达内皮细胞的表型血管老化,也就是说,内皮细胞衰老(18,36]。因此,最有可能的是,nLDL可以诱导内皮细胞的衰老。因此,我们决定nLDL能否诱导的衰老主要培养人类内皮细胞(HUVECs)。
2。材料和方法
2.1。材料
HUVECs(目录MC1133数量)从现代细胞和组织技术购买(首尔,韩国)和微血管内皮细胞medium-2 (EGM-2)从Cambrex购买(美国,新泽西东卢瑟福)。里帕裂解缓冲和蛋白酶抑制剂的鸡尾酒是购自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国)。West-ZOL®(+)从基因内区购买生物技术(凭借、韩国)。EZ-Cytox®细胞生存能力分析工具从Daeil实验室购买服务(首尔,韩国)。半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl -β-D-galactoside)从Amersham购买(英国白金汉郡)。Propidium碘(π)从英杰公司购买(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。β巯基乙醇从默克公司购买(达姆施塔特,德国)。核糖核酸酶的购买试剂盒(希尔登,德国)。低密度脂蛋白、胰岛素/ EDTA溶液,4-methylumbelliferyl -β-D-galactopyranoside(杯),3 -(3-cholamidopropyl) dimethylammonio} 1-propanesulfonate水合物(家伙),phenylmethanesulfonyl氟化物(PMSF), PVDF膜,和所有其他试剂购自σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。
不同的抗体被用于这项研究。反复审委员会和反phospho-pRb (pS807 / pS811)单克隆抗体购自BD生物科学(美国加利福尼亚州圣何塞)。多克隆抗体p16-INK4A、细胞周期蛋白E2和p53单克隆抗体对细胞周期蛋白D1和p21-CIP1从细胞信号技术购买(丹弗斯、马、美国)。单克隆抗体的低密度脂蛋白受体(LDLR), CDK2,到购买从圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国)。Anti-actin多克隆抗体和HRP-conjugated anti-rabbit或anti-mouse二级抗体购自σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。
2.2。细胞培养
HUVECs培养在EGM-2介质37°C下湿大气和5%的公司2。细胞被亚文化或培养不断在培养皿中9天。年轻HUVECs[人口翻番水平(PDL), 12 ~ 15)接种于培养皿,一夜之间稳定的孵化,然后处理各种nLDL浓度(0、2、5、10μg蛋白/毫升)。媒体交流与nLDL治疗进行与此同时每隔3天。对于每个亚文化,相同数量的细胞reinoculated同样大小的培养皿。nLDL治疗3天后,细胞被洗了三次PBS和0.25%胰蛋白酶/ EDTA处理解决方案3分钟。分离的细胞是收获,与PBS洗了三次,用于各种化验。
我们培养细胞的亚文化系统默认。这里使用文化系统都有缺点。虽然亚文化系统是常用的,收获的细胞是有压力,每3天接种。连续文化系统造成压力的另一个类型的细胞接种的结果与一个较小的细胞的数量。消除可能发生的变量从每个文化系统中,我们使用一个亚文化系统和连续的文化系统的一些关键的化验。
2.3。测定细胞增殖
的细胞增殖HUVECs分析通过使用WST-1(水溶性四唑盐1)基于细胞生存能力分析工具包(EZ-Cytox) [37]。nLDL-treated细胞(1.0毫升)收获了胰蛋白酶/ EDTA,混合着100人μL /毫升EZ-Cytox解决方案,和孵化为2小时37°C。混合1分钟和200年动摇了μL的混合物被转移到96微型板块。这些样品的吸光度与微型板块在450 nm读者(美国时代,Winooski VT)。
这个试验是进行细胞连续培养或亚文化。亚文化的细胞培养皿中(细胞;ϕ两次,35毫米盘)亚文化与nLDL治疗。细胞增殖是化验的最后一天,每个亚文化,并表示的相对吸光度的变化nLDL-treated nLDL-untreated细胞的细胞对同一文化的持续时间。连续培养,细胞培养皿中(细胞;ϕ,35毫米盘)对同一道菜的培养9天nLDL治疗和媒体交流。细胞增殖是每天化验,表示为每组细胞的相对吸光度的变化,第一天接种细胞没有nLDL治疗。
2.4。测定细胞衰老
2.4.1。SA -β加活动分析
HUVECs的衰老是定量评估的SA -β加试验使用细胞提取物(38]。SA -β加活动的产生率量化衡量4-methylumbelliferone (4-MU),荧光水解杯子的产物。年轻HUVECs (PDL 12 ~ 15)在培养皿中(细胞;ϕ,10厘米)亚文化和处理各种nLDL浓度(0、2、5、10μg蛋白/毫升)9天。每个亚文化的最后一天,这些细胞被洗了6次与PBS去除残余生长介质蛋白可能干扰后续的细胞蛋白的决心。细胞在450年被细胞溶解μL 1×裂解缓冲(5毫米皮套裤,40毫米柠檬酸、磷酸钠40毫米,0.5毫米苯甲脒,PMSF和0.25毫米,pH值6.0)。溶菌产物刮,转移到一个超小型电子管,涡大力,离心机在12000 g×5分钟在4°C。将浮在表面的冰,直到进一步的使用。反应缓冲2×强度(40毫米柠檬酸、40毫米磷酸钠,300毫米氯化钠,10毫米β巯基乙醇和MgCl 4毫米2(pH值6.0))混合杯(SA - 1.7毫米β加底物)立即使用它之前。反应缓冲区包含杯(45μL)混合澄清溶解产物(30μL)和1×裂解缓冲(15μL)。孵化持续了1小时,在37°C水浴。潜伏期后,反应混合物被添加到400毫米碳酸钠停止解决方案(900μL)和存储在4°C到荧光测量。的整除carbonate-stopped反应混合物被转移到一个96孔板(150μL /)和荧光读了荧光标(VersaMax、分子设备公司,费城,宾夕法尼亚州,美国)在360 nm和发射在465 nm)与激励。SA -β加活动是基于荧光强度4-MU /计算μg蛋白和表达的相对活动nLDL-treated组治疗组相同的亚文化持续时间。
2.4.2。SA -β加染色
细胞衰老也评估了SA -β加activity-staining试验(39]。使用相同的亚文化条件中描述的部分2.4。1,在适当的时候,这些细胞被固定为3% (v / v)甲醛在PBS 3 ~ 5分钟,用PBS清洗三次。SA -洗细胞被染色β半乳糖苷加染色解决方案[1毫克/毫升、40毫米40毫米的柠檬酸钠磷酸盐缓冲剂(pH值6.0),5毫米铁氰化钾,5毫米亚铁氰化钾,150毫米氯化钠,MgCl和2毫米2在37°C) 16光保护人力资源。染色细胞被洗两次与PBS和涂上70%甘油在PBS。相差显微镜下观察到的细胞被(TS100F、尼康、东京、日本)。
2.5。细胞周期分析
分析了细胞周期的nLDL-treated HUVECs根据流cytofluorometric化验使用PI染色[40]。简单地说,细胞培养皿中(细胞;ϕ,10厘米)亚文化和nLDL处理(0、2、5、10μg蛋白/毫升)9天。在适当的时候,细胞与胰蛋白酶/ EDTA、收获与PBS洗了三次,并于300年暂停μPBS的L。的细胞被固定在冰冷的70%乙醇洗1 ~ 2小时,洗了三次离心法在700 g×5分钟冷PBS。固定细胞治疗50 ~ 100μL核糖核酸酶(100μg / mL) 15分钟,然后到100年μL(π(50μg / mL)在光的保护下15分钟。细胞周期分析与FACSCalibur®流式细胞分析仪(美国BD生物科学,圣何塞,CA)激发在535 nm,排放在617海里。
2.6。免疫印迹分析
2.6.1。阻塞LDLR的抗体
阻止LDLR,细胞培养皿中(细胞;,35毫米盘)使用anti-LDLR抗体(20μg蛋白/毫升)1小时在4°C。随后,细胞治疗nLDL (10μg蛋白/毫升)和培养6天。分析了衰老感应SA -β加活动分析亚文化四唑盐染色细胞和细胞增殖的不断培养细胞每3天。
2.6.2。分析细胞Cycle-Regulating蛋白质
细胞蛋白质cycle-regulating HUVECs被免疫印迹分析。节中描述2.6.1,细胞6天,细胞溶解的亚文化里帕裂解缓冲(50毫米Tris-HCl, 150毫米氯化钠,NP-40 1%, 0.5%钠脱氧胆酸盐,0.1% SDS、叠氮化钠和0.004%)包含PMSF 1毫米,0.5毫米原钒酸钠,蛋白酶抑制剂鸡尾酒(10 ~ 20μL每1毫升裂解缓冲)。的混合物在4°C孵化30分钟和离心机在12000 g×15分钟在4°C。上层清液被储存在−80°C,直到进一步的使用。
细胞溶解产物(40μg蛋白)是由8 ~ 15%梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和转移到PVDF膜。5%脱脂奶的膜被TBS-T缓冲区(三羟甲基氨基甲烷缓冲液saline-Tween-20缓冲区;2.7毫米137毫米氯化钠,氯化钾,0.1%在25毫米Tween-20 Tris-base缓冲区,pH值7.4)在室温1小时和孵化隔夜主要抗体在4°C。洗涤三次后TBS-T缓冲区,污点是二级抗体孵育[HRP-conjugated anti-rabbit(1: 2000)或anti-mouse(1: 5000)]在室温下2小时。使用West-ZOL antibody-specific蛋白质检测(+)免疫印迹检测系统(内含生物技术,凭借、韩国)。主要的抗体被用于以下稀释:anti-p53 (1: 1000), anti-p21-CIP1 (1: 1000), anti-p16-INK4A (1: 1000), anti-CDK2 (1: 1000), anti-CDK4 (1: 1000), anti-cyclin E2 (1: 1000), anti-cyclin D1 (1: 1000), anti-pRb(1: 250),反pS807 / pS811-pRb(1: 250),和anti-actin (1: 2500)。
2.7。测量细胞内的活性氧
分析了ROS生成的nLDL-treated HUVECs罗亚尔和Ischiropoulos的方法41)来评估是否参与细胞内ROS过早衰老的细胞。年轻HUVECs培养皿(细胞;ϕ,10厘米)亚文化和处理各种nLDL浓度(0、2、5、10μg蛋白/毫升)9天。在适当的时候,这些细胞被洗两次与哈佛商学院和孵化在37°C反应混合物中1小时11μM DCF-DA 10毫米玫瑰,pH值7.4,酚红自由EGM-2媒介。孵化后,哈佛商学院的细胞被洗两次,补充1.5毫升的声波降解法缓冲区(50毫米磷酸钾缓冲,pH值7.0,0.1毫米EDTA,和0.1%的家伙),并通过刮收获。细胞被声波降解法细胞溶解(频率、24赫兹;持续时间,10秒/周期;重复6周期;时间间隔10秒)。上层清液的整除(200μ信用证)被转移到一个96孔板和荧光测量荧光标在502纳米激发和发射523海里。细胞内ROS的内容表示为相对荧光强度/μnLDL-treated集团的g蛋白治疗组相同文化的持续时间。
细胞内代ROS也在荧光显微镜下观察。DCF-DA-treated HUVECs与哈佛商学院洗两次,与一个倒置荧光显微镜观察(TE2000-U、尼康、日本)100 x放大。
2.8。蛋白质定量和统计分析
每个样本的蛋白质浓度是衡量BCA®蛋白质分析工具包(美国皮尔斯生物技术,罗克福德,IL)。牛血清白蛋白被用作蛋白质标准。
统计分析是由使用SPSS统计19(美国纽约阿蒙克的IBM公司)。组之间的剂量和时间差异分析重复测量方差分析分析和简单的区别分析的数据是独立的以及。被认为是具有统计学意义。数据被表示为平均值±标准偏差(SD)。
3所示。结果
3.1。本机LDL抑制HUVECs扩散
细胞增殖测定的影响进行了评估nLDL低浓度(0、2、5、10μg蛋白/毫升)的增殖培养HUVECs(图1)。分析了nLDL治疗对细胞增殖的影响在两种亚文化系统(图1(一)(图)和一个连续的文化体系1 (b))。原生低密度脂蛋白治疗显著地抑制细胞增殖的剂量和时间在两个文化系统()。细胞治疗nLDL 3天在亚文化系统显示无显著抑制细胞增殖,除了在10μg蛋白/毫升()。然而,细胞治疗nLDL 6或9天显示显著抑制细胞增殖(对所有测试浓度)。抑制细胞增殖发生nLDL治疗2天后在一个连续的文化系统。nLDL-treated细胞的台盼蓝试验表明,细胞死亡在这项研究是微不足道的(数据没有显示)。这些结果表明,浓度较低的治疗nLDL可以抑制增殖培养HUVECs剂量和时间。
(一)
(b)
3.2。本机LDL-Induced HUVECs衰老
接下来,我们评估的角色衰老的HUVECs nLDL-induced抑制细胞增殖。nLDL细胞处理低浓度(0、2、5、10μg蛋白/毫升)和细胞衰老被定量测定(图分析2(一个))以及染色(图2 (b))的SA -β加活动长达9天的亚文化系统。原生低密度脂蛋白酶活性显著增加剂量和时间的定量分析()。原生低密度脂蛋白酶活性也增加了染色。SA -β加活动的每个nLDL-treated组也与各自的nLDL-untreated组由独立以及。SA -β加活动显著增加在3、6和9天的浓度nLDL治疗()。增加了SA -β加活动前的细胞增殖减少nLDL浓度较低。这些结果表明,nLDL-induced抑制细胞增殖可能至少部分是由于细胞衰老。
(一)
(b)
3.3。本机LDL-Induced衰老细胞在细胞周期G1期被逮捕
在接下来的实验中,我们分析了细胞周期分布的变化阶段的nLDL-induced衰老HUVECs,亚文化系统(0、2、5、10μg蛋白/毫升)9天(图3)。PI染色后细胞周期与流式细胞术分析表明,G1期细胞的分布显著增加()和年代的分布和G2 / M期细胞明显减少(数据没有显示,剂量和时间的方式)。G1期细胞的分布在每个nLDL-treated集团也与各自的nLDL-untreated组由独立以及。G1期细胞的分布显著增加nLDL测试浓度()。这些结果表明,nLDL-induced衰老HUVECs被捕在细胞周期G1期。
3.4。本机LDL-Induced NLDL引起细胞衰老本身
在HUVECs确认nLDL-induced细胞衰老并非源于oxLDL产生nLDL体外孵化期间,我们进行预处理细胞单克隆抗体LDLR (anti-LDLR抗体)阻止细胞LDLR nLDL治疗前(10μg蛋白/毫升)。SA -β加活动试验(图4(一))在亚文化进行细胞和细胞增殖测定(图4 (b))是在不断培养细胞。同时化验进行细胞培养6天,因为10μg蛋白/毫升nLDL显示近6天(数字的影响最大1(一)和2(一个))。nLDL在细胞衰老的影响参数显著和负面调制anti-LDLR抗体在独立的预处理以及()以及重复测量方差分析试验()。这些结果表明HUVECs的nLDL-induced细胞衰老是由于nLDL本身,而不是oxLDL。
(一)
(b)
3.5。细胞衰老通过p53和p16-pRb NLDL是诱导信号通路
评价所涉及的信号转导通路与nLDL衰老感应(10μg蛋白/毫升),我们进行了一些细胞cycle-regulating蛋白免疫印迹分析每个亚文化(图的最后一天56天)。正如所料,p53的内容,p21和p16蛋白显著增加在nLDL-induced衰老细胞(b - 1)。两个细胞周期蛋白/ CDK复合物如CDK4/6-cyclin D和E CDK2-cyclin已知使磷酸化复审委员会克服G1被捕。这些复合物的蛋白质含量,CDK2、细胞周期蛋白E2,到,和细胞周期蛋白D1,显著降低衰老细胞(b - 2和酮);因此,磷酸化的复审委员会也显著抑制(B-4)。这些结果表明在HUVECs nLDL-induced细胞衰老的结果从复审委员会磷酸化的抑制(即。,G1 arrest of cell cycle) by the inhibition of the two cyclin/CDK complexes (CDK4/6-cyclin D and CDK2-cyclin E) via both the p53 and p16 signal transduction pathways. Pretreatment with anti-LDLR antibody restored in varying degrees the changes in the levels of the cell cycle-regulating proteins induced by nLDL treatment (Figure5)。这些结果证实了图的结果4预处理的anti-LDLR抗体预防衰老HUVECs感应。
3.6。本机LDL-Induced衰老细胞永久在G1期被逮捕
虽然G1-arrested年轻细胞可以激活增殖细胞通过与血清或其他促有丝分裂的药物,治疗衰老细胞理论上无法克服G1检查站。符合这一点,我们试图确定nLDL-induced G1期逮捕HUVECs是暂时的还是永久的现象。的方便,我们想展示的不可逆性细胞衰老(即。G1逮捕)诱导nLDL的最低浓度。如果细胞衰老引起的最低浓度nLDL (2μg / mL)没有逆转,由更高浓度的细胞衰老nLDL将是不可逆转的。诱导细胞衰老后nLDL治疗(2μg蛋白/毫升)亚文化长达9天(亚文化的第一个周期),这些细胞被洗两次与EGM-2介质和亚文化又在同一介质没有nLDL 6天(第二周期的亚文化)。我们认为亚文化为6天足以显示细胞增殖趋势在体外培养条件。流仪细胞周期分析与π随后进行。
第一个周期的亚文化nLDL治疗增加了G1期细胞的分布,而nLDL-untreated细胞(图3)。nLDL洗涤后,第二个周期的亚文化6天未能返回细胞原有的增殖状态(;表1)。HUVECs诱导的G1-arrest nLDL(2的最低浓度μg蛋白/毫升)不是由洗涤nLDL从细胞逆转。这个结果表明,nLDL-induced培养的内皮细胞的衰老是一个不可逆转的变化。
3.7。细胞内ROS生成NLDL-Induced细胞衰老有牵连
在这个实验中,我们确定了ROS的HUVECs nLDL-induced衰老的作用。细胞治疗与nLDL (0、2、5、10μg蛋白/毫升)与媒体交流在亚文化系统9天。ROS生成nLDL-treated细胞测量的荧光光谱测定法(图6(一))和荧光显微镜(图6 (b))与DCF-DA化学探测器。细胞内ROS生成nLDL-treated细胞显著增加的剂量和时间()。细胞治疗nLDL 3天在亚文化系统显示没有明显的ROS生成由独立以及。然而,细胞治疗nLDL 6或9天有显著提高ROS生成(或0.01)浓度测试。
(一)
(b)
4所示。讨论
在这项研究中,我们使用一个亚文化系统和连续的文化系统,消除变量可以从每个文化系统发生长达9天的文化。浓度较低的长期治疗nLDL (2 ~ 10μg蛋白/毫升)的增殖抑制HUVECs在两个文化系统。细胞增殖的抑制作用是显示nLDL治疗2天后,这表明nLDL的浓度非常低,放大在细胞所需的效果。结果引起的内皮细胞的衰老nLDL治疗之前他们减少扩散表明细胞衰老可能负责减少细胞增殖。我们第一次表明nLDL可以诱导培养细胞过早衰老。
G1期细胞分布是增加了nLDL治疗。nLDL-induced衰老细胞在细胞周期G1期被逮捕。此外,衰老细胞没有逃离G1-arrest即使在连续亚文化删除nLDL后6天。这些结果表明,nLDL-induced G1-arrest HUVECs是永久性的和不可逆转的。
nLDL本身的氧化状态是非常重要的在这项研究中,因为oxLDL可能诱导培养细胞过早衰老。血清nLDL孤立的氧化状态的健康男性被发现变量。可乐等。42)报道,低密度脂蛋白的脂质过氧化程度约为245 fmol丙二醛(MDA) /μ克LDL蛋白质(49.5 MDA pmol /毫克胆固醇)。然而,汉和Pak [43]报道更低程度的脂质过氧化(0.8 fmol MDA /μ克LDL蛋白质)。本研究中使用的脂质过氧化程度的nLDL 8.4 fmol MDA /μg LDL蛋白质。的氧化状态nLDL用于这项研究被可乐低于价值的大约30倍et al。42),但大约10倍的价值由汉族和Pak [43]。因此,在这项研究中使用的nLDL是正常范围内的氧化状态的健康男性。
此外,由于可以氧化nLDL oxLDL离体培养期间,我们需要确保衰老被诱导而不是oxLDL nLDL本身。为此,我们封锁了nLDL受体(LDLR) anti-LDLR抗体nLDL治疗前被艾伦et al。44),在此基础上oxLDL不绑定到LDLR [45]。Anti-LDLR抗体预处理抑制nLDL-induced HUVECs衰老。这个结果表明nLDL本身可能是内源性的培养内皮细胞诱导过早衰老的细胞。还有另一个小分支的低密度脂蛋白,最小修改LDL (mmLDL),足够修改化学nLDL区分开来。尽管它修改,mmLDL保留绑定到LDLR的能力(46]。到目前为止,这种不同寻常的人物mmLDL很难区分与mmLDL nLDL的效果。还需要进一步的研究来解决这个问题。
接下来,我们试图识别信号转导途径参与nLDL-induced内皮细胞衰老。增长逮捕衰老细胞是由p53和/或维护p16-pRb信号转导途径(47- - - - - -49]。因此,我们进行了免疫印迹分析的一些细胞cycle-regulating蛋白相关的这些信号转导途径和衰老细胞G1逮捕。p53的水平增加。此外,脱去磷酸的水平的提高,但在S807磷酸化复审委员会和S811 [P-pRb (pS807 / pS811)]是下降,表明抑制审查委员蛋白质的磷酸化是细胞衰老的原因归纳。CDK抑制剂如p21和p16的水平也略有增加,但细胞周期蛋白的水平/ CDK复杂蛋白质如Cdk2、到,细胞周期蛋白E2,细胞周期蛋白D1下降。这些变化在细胞的水平cycle-regulating nLDL-treated细胞的蛋白质建议nLDL-induced G1逮捕HUVECs可能是由于抑制复审委员会通过p53和p16-pRb磷酸化信号传导通路。
预处理的anti-LDLR抗体在不同程度上恢复细胞cycle-regulating蛋白水平的变化引起nLDL治疗。这个结果证实了图的结果4预处理的anti-LDLR抗体预防衰老nLDL-induced HUVECs感应。
我们还显示,长期治疗低浓度nLDL可以刺激HUVECs ROS的生成。这一结果表明,活性氧可能涉及培养内皮细胞过早衰老的nLDL治疗。
senescence-inducing通路可能由不同压力条件如端粒缩短,DNA损伤,癌基因激活,缺乏营养,或生长因子,氧化应激(47,49]。本机LDL据说可以产生超氧化物自由基()而不是没有在内皮细胞或组织,包括HUVECs、解偶联的以挪士(50- - - - - -53]。nLDL含量相对较高(2.4毫克胆固醇/毫升)被使用在这些研究中,展示的刺激效果nLDL HUVECs ROS的生成。在这里,我们表明,内皮细胞过早衰老的可能引起长期的治疗,在非常低的浓度nLDL (4.4 ~ 22.2μ胆固醇g / mL)。
总的来说,我们的研究结果表明,低浓度的长期治疗nLDL可以诱导体外培养的内皮细胞内过早衰老。本机的低密度脂蛋白是内源性的细胞通过LDLR,可能产生活性氧诱导细胞衰老通过p53和p16-pRb信号转导通路。
这项研究的结果并不适用于人类体内病理生理学,自体外抗氧化能力的文化条件是完全不同于体内的细胞环境。然而,衰老nLDL-induced培养HUVECs可以作为一个模型系统研究在体外老化条件下细胞过早衰老。包括循环系统,人体的自我平衡的防御系统,可以防止氧化应激。然而,当prooxidant稳态平衡和等离子体和内皮细胞的抗氧化系统是相对长期干扰,nLDL以及改性低密度脂蛋白,如oxLDL,可以诱导血管内皮细胞的过早衰老。
总的来说,这是第一个报告描述nLDL-induced血管内皮细胞衰老,至少部分在离体培养条件下通过氧化应激。血管内皮细胞的衰老nLDL-induced可以作为一个模型系统体外老化研究。这一发现还需要更进一步的研究来适用于人类体内病理生理学。
信息披露
本文包含一个学位论文的一部分“过早衰老的感应与原生低密度脂蛋白在人类血管内皮细胞通过胡恩公园Chonnam国立大学(医学博士),2012年。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
Sung-Tack哦,胡恩公园的贡献同样这项工作。
确认
本研究支持由Chonnam国立大学医院研究所(中国国际广播电台11024 - 1)和从Chonnam国立大学(2013 - 2591)。