文摘

的目标是。激活/成熟的树突细胞(dc)中起着重要的作用处理和适应性免疫反应的抗原(交叉)激活的T细胞。有正在进行的讨论的角色活性氧(ROS)在这些流程和目前研究中我们调查这个神秘的途径。方法和结果。DCs在小鼠的骨髓培养从前体(BM-DCs)和分析活性氧的形成,成熟,和T细胞刺激能力刺激与佛波醇酯(PDBu)和脂多糖(LPS)。LPS刺激引起的BM-DCs成熟适度的细胞内活性氧的形成,而PDBu治疗导致成熟显著ROS的形成。NADPH氧化酶抑制剂apocynin / VAS2870和遗传gp91phox删除两个减少ROS信号PDBu-stimulated BM-DCs而不影响成熟和T细胞刺激BM-DCs的能力。相比之下,蛋白激酶C抑制剂白屈菜赤碱/ Go6983 PDBu-stimulated减少ROS形成BM-DCs以及成熟。结论。显然Nox2-dependent ROS形成BM-DCs并不总是要求他们的成熟或T细胞刺激的潜力。PDBu / LPS-triggered BM-DC成熟,而依赖于磷酸化途径。我们的结果问题氧化应激的作用作为一个重要的“危险信号”BM-DC激活,尽管我们无法排除其他ROS贡献来源。

1。介绍

免疫细胞提供保护的生物入侵的微生物病原体。免疫系统与它的各种细胞类型可分为先天免疫系统(例如,中性粒细胞或NK细胞)和自适应免疫反应(如淋巴细胞)。树突状细胞(dc)作为信使之间的适应性和先天免疫反应(1]。自适应免疫反应的一个关键事件由启动或敏感的静止T细胞,这是一个任何antigen-induced细胞适应性免疫反应的先决条件。T细胞活化在很大程度上取决于有效的抗原片段抗原递呈细胞,如DCs。后者位于组织与外部环境密切接触像皮肤(朗格汉斯细胞)或肺部和肠道上皮细胞。DC-dependent激活T细胞也会导致动脉高血压的发展(2]。这突显出直流激活/成熟的临床相关性心血管疾病。众所周知,血小板活化过程中血管损伤或出血和后续CD40L发布提供了一个“危险信号”,激活DCs的血管损伤,从而促进当地的诱导T细胞介导的免疫反应。此外,其他“危险信号”,如细菌或真菌木糖醇(例如,脂多糖(LPS)或酵母聚糖),组织损伤标记(例如,尿酸,透明质酸),免疫激活(如CD40L、炎性细胞因子),甚至血管紧张素ⅱ造成强大的激活/ DC的成熟2,3]。因此,炎症和血栓形成的环境代表一个DC活化的主要触发,成熟,和渗透,随后的免疫反应导致血管atherothrombotic事件。

除了上述经典“危险信号”DCs也可能成为被氧化应激激活,通过直接免疫调节的行为ROS在免疫细胞中蛋白质或炎症介质(如oxLDL isoketals,和其他脂质过氧化反应产品)(4- - - - - -11]。在支持这一概念,表明氧化应激在骨髓移植肿瘤坏死因子α导致DCs的激活12),血管氧化应激导致直流激活,附着力,轮回13]。然而,香烟烟雾诱发氧化应激抑制关键细胞因子的生成通过成熟dc ERK-dependent通路的激活14]。反过来,ROS已经演示了在一个蛋白激酶激活NADPH氧化酶类C-dependent时尚(15)打开机会激活直流NADPH氧化酶(Nox2异构体)。一些出版物把Nox2-derived ROS在抗原处理的一个重要的角色和表示通过控制pH值的吞噬体(16- - - - - -18]。蛋白激酶C(同种型αNox2活动的)不仅是一个重要的催化剂,也调节细胞因子生产的DCs MyD88和toll样受体(TLR)依赖的方式(19]。

与目前的研究,我们试图探讨蛋白激酶C的作用和Nox2-derived ROS在DC的成熟和T细胞刺激能力。

2。材料和方法

2.1。动物和处理协议

BALB / cJ, C57BL / 6,gp91^phox基因敲除小鼠获得的转化动物研究中心在无菌条件下美因茨大学医学中心和维护标准的饮食。

半合老鼠(Nox2淘汰赛(# 2365),C57BL / 6背景,杰克逊实验室、巴尔港,我)生成如前所述[20.)和C57BL / 6小鼠作为相应的野生型控制。老鼠在异氟烷麻醉的情况下牺牲,为一代BM-DCs股骨和胫骨被恢复。动物治疗按照指南的实验室动物保健和使用采用和美国国立卫生研究院发布并经伦理委员会批准根据德国法律保护动物(Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz,科布伦茨,德国:# 23 177 - 07年/ G 10-1-054, # 23 170 - 07年/ G 07-1-023)。

2.2。来源于DCs的骨头

BM-DCs生成作为第一所描述的Scheicher et al。21和修改兄弟等。22]。不久,骨髓细胞(2×10⁶细胞/ 10毫升)中培养IMDM补充5% heat-inactivated FCS (Gibco,佩斯利,英国),2毫米谷酰胺(罗斯,卡尔斯鲁厄,德国),100 U /毫升青霉素,100μg / ml链霉素(PAA,派斯克、奥地利),50μ米β巯基乙醇(罗斯),5%来自X63 GM-CSF-containing细胞培养上清液。ag8 - 653骨髓瘤细胞稳定转染小鼠gm - csf表达式构造(23在细菌菜(他一一Bio-One, Frickenhausen,德国)。BM-DC培养基补充在每天3和6的文化。7天,不成熟BM-DCs收获,离心机,受移植者6-well nontissue文化板块(1×10⁶细胞/ 2毫升),培养24小时。

2.3。检测细胞外和细胞内ROS培养BM-DCs的形成

氧化的培养BM-DCs (24-well 1×10⁶细胞/第8天)是由佛波醇酯诱导dibutyrate (PDBu 10μ米)(Sigma-Aldrich Steinheim,德国)或有限合伙人(50μ使用l - g / ml) (Calbiochem) 012 - (100μM -)增强化学发光(ECL) PBS(1毫米Ca^{2 +}/毫克^{2 +}贝特)Centro板读者(技术、坏Wildbad,德国)。在一些实验中,NADPH氧化酶的抑制剂,apocynin(150年或300年μ米,Sigma-Aldrich)或VAS2870 (20μ米,Sigma-Aldrich)或蛋白激酶C抑制剂白屈菜赤碱(10、50和100μ0.1 M, Sigma-Aldrich)或Go6983 (, 1, 10μM, Sigma-Aldrich前20分钟)被添加到细胞的l - 012染料和刺激PDBu或有限合伙人。ROS生成BM-DCs (24-well 2×10⁵细胞/)也测试了dichlorofluorescein-diacetate (DCF-DA 20μ米)或dihydroethidium(她1μ使用密特拉神2米)荧光贝特DCF-DA (Techn荧光板读者。、坏Wildbad、德国;为激发过滤器:海里排放:海里)和荧光显微镜对她(Axiovert,蔡司)。DCF-DA添加抑制剂对细胞刺激前20分钟PDBu或有限合伙人。

2.4。通过流式细胞仪检测细胞内ROS生成(流式细胞仪)

8天的文化,一个整除的BM-DCs孵化与染料CM-DCF-DA (5μ米/ 1×10⁶/毫升)(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA) 30分钟,而另一个整除了未经处理的。细胞与LPS刺激(1.5μPDBu g / ml),各种浓度(0.1μM, 1μ米,或10μ米),PMA (50 ng / ml, Sigma-Aldrich),酵母聚糖(50μg / ml,生活技术),lipoteichoic酸(10μg / ml, Sigma-Aldrich),激活antiCD40 Ab (10μg / ml),鼠标重组可溶性CD40L (0.5μg / ml, ImmunoTools、Frisoythe、德国),TNF -α/ il - 1β(10 ng /毫克每ImmunoTools),或者如果保持控制的时间点。细胞收获和洗染色缓冲区(PBS / 2% FCS)。为了避免Fc受体介导的非特异性结合的抗体(Ab)、细胞培养15分钟与一只老鼠冰anti-mouse CD16 / CD32 Ab(从杂种细胞克隆2.4 g2,纯化上层清液)。细胞表面沾了藻红蛋白(PE)共轭Ab识别CD11c(克隆N418, Miltenyi研究,Bergisch-Gladbach,德国)和phycoerythrin-cyanine 5 - (PE-Cy5)共轭Ab识别MHCII(圣地亚哥克隆M5/114, eBioscience CA)。合适的同形像控制Abs。流式细胞仪使用流式细胞仪测量进行了第二章流式细胞分析仪(BD生物科学)和分析使用FlowJo软件。特别是,DCs通过的表达表面标记CD11c (CD11c命名⁺细胞),这些都是后来分成表达DCs和表达了DCs在增刊。图年代在网上https://doi.org/10.1155/2017/4157213。ROS生成亚种群进行了分析。

2.5。使用流式细胞仪检测成熟

刺激,如果BM-DCs收获和fc受体阻止了如上所述。细胞表面沾有以下Abs:异硫氰酸荧光素(FITC)——共轭anti-CD11c(克隆N418, Miltenyi研究),PE-conjugated anti-CD86(克隆GL1, eBioscience)和PE-Cy5-conjugated anti-MHCII(克隆M5/114, eBioscience)。细胞被固定为0.7%多聚甲醛(默克公司,达姆施塔特,德国)PBS和受到流式细胞仪分析如上所述。如上所述,DCs被定义为CD11c⁺细胞和表达和为这些细胞在生理成熟dc表示图年代。

2.6。同种异体T细胞刺激化验

脾BALB / cJ T细胞(3×10⁵丰富的尼龙毛坚持[描述24)与连续稀释cocultured C57BL / 6BM-DCs(开始浓度:5×10⁴200年在一式三份)μl培养基没有gm - csf在96 - 4天的平底盘子。扩散是通过测量评估的基因组整合³H]胸苷(0.25μCi /),这增加了对文化的最后16 h。细胞收获到玻璃纤维过滤器和保留放射性测量液体闪烁计数器(1205 Betaplate LKB Wallac, Turcu,芬兰)。

2.7。统计分析

数据表示为±SEM。统计上显著差异评估用单向方差分析比较组使用Holm-Sidak其次是成对的比较分析。值< 0.05被认为是统计学意义(,,)。为大多数数据分析使用SigmaPlot 12.3 (Systat软件,圣何塞,CA)和活性氧形成的化学发光和荧光数据采用棱镜6为Windows 6.05版本,GraphPad软件。

3所示。结果

3.1。有限合伙人和PKC-Activator PDBu促进BM-DC成熟,但只在BM-DCs PDBu增加细胞内活性氧的形成

在一组试验的实验中,我们观察到佛波醇酯PDBu诱导形成ROS浓度增加细胞,而增强了成熟的最低浓度PDBu边际进一步增加,只显示在更高浓度的PDBu(图1(一))。相比之下,内毒素LPS浓度采用增加了成熟的类似程度BM-DCs但导致不明显增加活性氧的形成率比PDBu(图1(一))。困惑的活性氧的形成和成熟之间明显的离解BM-DCs我们测试了一组不同的刺激器BM-DC成熟。我们发现,只有佛波醇酯诱导活性氧的形成和成熟,而所有其他古典刺激器诱导成熟没有显著的活性氧的形成(图1 (b))。为了排除人工ROS信号通过流式细胞仪分析,我们测试了其他活性氧检测方法。与荧光染料染色的培养BM-DCs dihydroethidium二乙酸(她)或dihydrodichlorofluorescein (DCF-DA)显示一个非常相似的细胞内ROS增加形成的刺激BM-DCs PDBu或有限合伙人(数字2(一个)和2 (b))。由于高本底信号,增加活性氧的形成在刺激与DCF-DA PDBu或有限合伙人不太明显但NADPH氧化酶抑制剂VAS2870显著抑制。使用鲁米诺模拟和化学发光染料l - 012年,我们建立了一个时间课程PDBu——和LPS-induced细胞外形成活性氧BM-DCs极大值在20和40分钟,分别(图2 (c))。最大ROS形成了l - 012 ECL大约是10倍更加明显与PDBu刺激而LPS-treated组。因此,整个ROS信号诱导两刺激器很大程度上取决于ROS的测量和染料。

更详细的流式细胞仪分析证实了这些最初的发现ROS BM-DCs的形成和成熟之间的分离。只有PDBu,但不是有限合伙人,导致显著增加活性氧的形成由BM-DCs 15岁和120分钟(数字3(一个)和3 (b)),而同时刺激增加了成熟后24 h刺激相似的程度(图3 (c))。此外,T细胞刺激BM-DCs容量增加了PDBu和有限合伙人(图3 (d))。

3.2。PDBu-Induced BM-DCs可以被PKC-Inhibition成熟和不依赖于Nox2-Derived ROS的形成

因为先前的研究发现NADPH氧化酶系统(主要是Nox2同种型)作为激活BM-DCs ROS的强有力的来源,我们测试了NADPH oxidase-derived ROS的药理抑制剂的影响形成,apocynin, ROS信号,BM-DCs的成熟。我们建立了一个浓度抑制BM-DC-derived细胞外ROS形成apocynin和已知Nox2抑制剂nebivolol [25,26)(图4(一))。同时,LPS-induced细胞外BM-DCs活性氧的形成是剂量依赖性的方式减少了apocynin(图4 (b))。相比之下,apocynin只引起轻微抑制成熟(图4 (c)),但更明显的损失(图T细胞刺激的能力4 (d))PDBu-stimulated BM-DCs。后者将兼容众多报告的作用Nox2抗原在演讲中BM-DCs基于pH值调制的吞噬体(16- - - - - -18]。

apocynin以来,特别是在较高的浓度,直接抗氧化性能27),我们还测试了Nox2亚基的基因删除gp91phox为了描述Nox2-derived ROS的角色BM-DC成熟和T细胞刺激能力。虽然我们观察到显著降低ROS形成由PDBu-stimulated BM-DCs gp91phox-deficient与控制老鼠(数据相比5(一个)和5 (b)),既不成熟也不T细胞刺激能力明显受损gp91phox-deficient动物PDBu刺激(数据5 (c)和5 (d))。然而,由于PDBu-induced活性氧的形成并不是完全没有BM-DCs没有gp91phox,我们不能排除其他活性氧的来源的贡献(例如,线粒体或其他Nox亚型)BM-DC成熟和T细胞刺激的能力。

Nox2主要由PKC激活(28报道),进而从本质上导致DC细胞因子的生产(19]。因此我们测试的效果PKC抑制剂白屈菜赤碱BM-DC-derived ROS形成和成熟。白屈菜赤碱诱导浓度抑制PDBu——LPS-induced BM-DC-derived细胞外形成活性氧(数字6(一)和6 (b))。还PDBu-induced细胞内ROS形成由BM-DCs(以流式细胞仪分析)是剂量依赖性的方式减少了白屈菜赤碱(图6 (c))。LPS-triggered活性氧的形成显然PDBu-treated组相比明显更少。PDBu-triggered BM-DC成熟完全被白屈菜赤碱(图6 (d))。在一个独立的实验中,我们表明,Nox2抑制剂VAS2870以及替代PKC抑制剂Go6983抑制BM-DCs PDBu或LPS-stimulated细胞外ROS信号(数字7(一)和7 (b))。如图所示为白屈菜赤碱,也Go6983减少PDBu-triggered BM-DC成熟(图7 (c))。

4所示。讨论

本研究的结果表明,佛波醇酯PDBu有限合伙人,古典刺激器在中性粒细胞氧化破裂,引发BM-DC成熟和T细胞刺激能力。我们旨在确定氧化应激的作用BM-DC成熟,发现PDBu小程度上也在BM-DCs LPS诱导细胞内活性氧的形成。有趣的是,抑制由apocynin NADPH-oxidase VAS2870或Nox2亚基的基因淘汰赛gp91phox只有轻微或没有影响BM-DC成熟和T细胞刺激能力。然而,抑制蛋白激酶C的白屈菜赤碱或Go6983抑制PDBu-induced成熟和活性氧的形成。综上所述,我们在这里提供证据的重要作用胞内Nox2-derived ROS形成BM-DC成熟PDBu和有限合伙人。

吞噬细胞NADPH氧化酶Nox2著名球员在宿主防御的先天免疫系统,并且有越来越多的证据显示Nox2在适应性免疫中的作用[29日- - - - - -31日]。患有慢性肉芽肿性疾病(CGD)有更高的敏感性,自身免疫性疾病,如红斑狼疮或类风湿性关节炎32,33]。成熟的DCs是自身免疫性疾病的发病机理的一部分(34]。Nox2-deficient老鼠穿越到一个lupus-prone遗传背景()开发较高的抗体效价和更严重的临床疾病比控制老鼠的照片(35]。此外,Nox2由BM-DCs参与抗原表示,基于pH值调制的吞噬体(16- - - - - -18]。

然而,Nox2-derived ROS在自身免疫性疾病中的作用还不清楚直到现在和文献数据反映出相当矛盾的照片ROS形成DC成熟的角色。结果表明:ROS-low DCs显示更明显反应toll样受体激动剂如有限合伙人和酵母聚糖,其次是加速成熟和T细胞刺激能力与ROS-high DCs相比,显示增加MAPK信号传导,附着力和过氧化氢释放来显示他们的角色直接目标微生物(36]。相比之下,liposome-driven ROS生成细胞因子和趋化因子(ERK-dependent) / (MAPK-dependent)生产都是由非特定的抗氧化剂预防(节奏和ebselen)的抑制剂flavin-dependent氧化还原酶包括NADPH氧化酶类(二苯基碘鎓)和MAPK抑制剂(SB203580) [37]。尽管代表一个未指明的方法,香烟烟雾提取物诱导活性氧的形成,生产的趋化因子CCL3和CXCL2, NFκB TLR-dependent方式活化,阻止了所有的抗氧化剂防治作用[38]。另一个未指明的方法是基于LPS-triggered ROS形成由DCs及其激活(成熟、细胞因子的生产和T细胞刺激潜在的),所有这一切被抗氧化剂防止ebselen [39),然而,要记住这种化合物是一种非特定的thiol-dependent酶抑制剂(40]。同时,与谷胱甘肽酯治疗成功阻止LPS-induced线粒体活性氧的形成(由电子自旋共振光谱测量)和细胞因子的生产41]。线粒体ROS生成被证明是一个重要的贡献者DC分化从复杂我抑制剂鱼藤酮还过氧化氢酶的培养基降低DC-derived ROS水平和分化的标志,指向一个重要的角色在这一过程中线粒体的过氧化氢(41]。这是符合观察线粒体活性氧可以触发低氧诱导因子1-dependent重组并切换到糖酵解在各种细胞类型包括直流42,43]。

以前这是表明NADPH oxidase-derived ROS并未导致DC分化,成熟,细胞因子的生产,和诱导T细胞增殖,因为直流产生慢性肉芽肿性疾病患者(CGD)显示正常功能(44]。同样,与活性氧清除剂治疗也没有影响这些作者之手。相比之下,NADPH氧化酶激活DC-mediated杀死的细胞内至关重要大肠杆菌(44),它是由各种情况下指示加剧炎症反应在细菌感染CGD患者(45]。符合这个以前的观测,我们的数据显示一个小角色BM-DC Nox2-derived ROS生成的成熟和T细胞刺激能力在激活PDBu或有限合伙人。不过,因为无论是PDBu-induced还是LPS-induced ROS生成在BM-DCs没有gp91phox,完全没有可能猜测是否其他活性氧的来源(例如,线粒体或其他氮氧化物亚型)导致BM-DC成熟和T细胞刺激能力。也,见多个实验研究脓毒症(内毒素)LPS-dependent激活免疫细胞ROS水平可观的形成有关,而最可能来源于线粒体和NADPH氧化酶类(46,47]。一般来说,它也是众所周知,ROS在免疫细胞生产导致细胞功能障碍和不良/不受监管的免疫反应和结束器官损伤(48- - - - - -51),虽然在一些罕见疾病也不足ROS生产可能导致控制炎症条件(52]。在大多数情况下,这意味着即使在LPS模型ROS可能发挥作用在免疫细胞的激活以及解决炎症,如图所示为线粒体ROS LPS-primed骨骨髓来源的巨噬细胞(53]。支持这几个实验脓毒症模型所示,LPS-induced ROS生成减少和提高生存endotoxemic gp91phox基因敲除小鼠或通过预处理apocynin [54- - - - - -56]。相反,在人类遗传gp91phox不足(如CGD患者)甚至恶化LPS-induced炎症报道(45]。

总之,我们提供的证据的重要作用的蛋白激酶C BM-DC成熟,因为白屈菜赤碱或Go6983抑制PKC封锁PDBu-dependent BM-DC成熟。只有少数报告PKC对BM-DC成熟刺激的影响,但从本质上说,据报道,导致DC细胞因子的生产(19]。

5。限制

主要问题的比较不同研究DC-dependent ROS生产及其对成熟可能会影响测量的具体时间点。只要没有ROS生成动力学很难分配提供一定来源的活性氧的信号。流式细胞仪分析这一事实也局限于测量细胞内ROS形成代表之前的研究的一个主要限制ROS对DC成熟和T细胞刺激的影响能力。

此外,体内激活和成熟的直流是多因素疾病和特定抗原/疾病(3,57]。值得注意的是,其他来源的活性氧(例如,线粒体)以及氧化产品所产生的ROS(例如,oxLDL、反应性醛和isoketals)是已知的导致直流激活和成熟6,9- - - - - -11]。同样,从外部Nox2 ROS来源(例如,其他激活免疫细胞)可能引发BM-DC体内成熟。这些“外部”因素可能缺失在我们BM-DC细胞培养模型。事实上,我们目前的数据表明,并不是所有DC活化和成熟需要ROS但可能完全取决于toll样受体活化和细胞信号通路如PKC。

识别特定的PKC同种型(s),造成这一ROS独立的信号通过未来实验提供重要的分子在DCs的激活机制的见解。

6。结论和临床意义

我们的发现问题的概念Nox2-dependent ROS形成BM-DCs需要成熟或T细胞刺激潜在的(基于gp91phox缺乏或没有任何影响NADPH氧化酶抑制剂apocynin)。观察到佛波醇ester-triggered BM-DC成熟似乎比Nox2-derived ROS形成依赖的磷酸化途径(基于观察PKC抑制剂白屈菜赤碱和Go6983)影响。然而,我们不能排除其他来源的活性氧DCs(例如,线粒体)或ROS来自外部Nox2源(例如,其他免疫细胞)或直流ROS-generated氧化催化剂,如脂质氧化产品有助于BM-DC成熟和T细胞刺激潜在的体内。因为DCs提供必不可少的适应性和先天免疫反应之间的联系,带来的启动或致敏休息T细胞,这是一个先决条件任何antigen-induced细胞适应性免疫反应,激活代表一个基本机制的各种自身免疫性疾病的免疫反应也进展和低度炎症引发心血管、代谢、神经退行性疾病。我们的结果问题氧化应激的作用作为一个重要的“危险信号”BM-DC激活。

相互竞争的利益

作者没有金融冲突要申报的东西。

作者的贡献

朱迪斯•斯坦塞巴斯蒂安·史蒂文,Angelika Reske-Kunz,安德烈亚斯Daiber贡献同样也应该被认为是共同第一作者和高级。

确认

作者承认Jorg称,伊芙琳Montermann优秀的技术援助。这项工作是由联邦教育部基金和研究(BMBF 01 eo1003, TRP A3和Virchow奖学金)Andreas Daiber和塞巴斯蒂安·史蒂文和斯蒂芬Grabbe。

补充材料