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氧化医学与细胞寿命
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氧化医学与细胞寿命/2014年/文章
特刊

一氧化氮相关的氧化应激和氧化还原状态在健康和疾病

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体积 2014年 |文章的ID 212576 | https://doi.org/10.1155/2014/212576

Arne Trettin，AnkeBöhmer，Maria-Theresia，Irmelin Probst，Ulrich Saerk，Dirk O. Stichtonoth，JürgenC.Frölich，Dimitrios Tsikas， ＂对乙酰氨基酚对健康男性受试者、大鼠肝细胞和重组NOS、COX、CYP活性及氧化应激的影响"，氧化医学与细胞寿命， 卷。2014年， 文章的ID212576， 12 页面， 2014年。 https://doi.org/10.1155/2014/212576

对乙酰氨基酚对健康男性受试者、大鼠肝细胞和重组NOS、COX、CYP活性及氧化应激的影响

arne trettin.，1 Anke玻姆，1 Maria-Theresia苏奇，1 Irmelin普罗布斯特，2 斯塔克乌尔里希，1 德克·o·Stichtenoth，1 尤尔根·c·Frolich，1 和 Dimitrios Tsikas1

1汉诺威医学院临床药理学研究所，汉诺威30625，德国

2Georg-August大学生物化学和分子细胞生物学系，德国Goettingen 37073

学术编辑：丹妮拉Giustarini
已收到 2014年1月27日
接受 2014年2月26日
发表 2014年3月31日

抽象的

扑热息痛(对乙酰氨基酚)是一种应用广泛的止痛药物。它与包括细胞色素P450 (CYP)、环氧化酶(COX)和一氧化氮合酶(NOS)在内的各种酶家族相互作用，这种相互作用可能产生活性氧(ROS)。我们研究了对乙酰氨基酚对前列环素、血栓烷、一氧化氮(NO)和氧化应激的影响。血栓烷和前列环素的合成是通过测量它们的主要尿代谢物2,3-二血栓烷B来评估的22, 3-dinor-6-ketoprostaglandin F1α， 分别。通过测量血浆中的亚硝酸盐来评估内皮内没有合成。尿15（年代) 8 -iso-prostaglanding F2α以评估氧化应激。血浆氧化油酸(CIS.-EpOA)作为细胞色素P450活性的标记物。给药对乙酰氨基酚后，前列环素合成受到强烈抑制，而NO合成增加，血栓烷合成几乎保持不变。扑热息痛可能以血管扩张为代价改变cox依赖性血管舒张/血管收缩平衡。这种作用可能通过增加内皮NO合成被拮抗。大剂量的扑热息痛不会增加氧化应激。在药理学相关浓度下，对乙酰氨基酚对重组人内皮NOS或诱导大鼠肝细胞NOS合成/生物利用度没有影响。我们的结论是扑热息痛不会增加人体的氧化应激。

1.介绍

一氧化氮(NO)、前列腺素(PG2，即前列环素(PGI)2)和血栓素A2（TXA.2）是参与许多生理和病理过程是重要的短命信号分子。因此，PGI2和NO是有效的血管扩张剂和血小板聚集抑制剂。相反,酸2是强的血管收缩剂和血小板聚集的电感器。NO由L-精氨酸（ARG）由组成型和诱导NO合酶（NOS）的同种型合成。前列腺素H合酶（PGHS）同种型，通常被称为环加氧酶（COX），花生四烯酸（AA）转化为统称为前列腺素。L-精氨酸/ NO途径被普遍接受与COX途径相互作用并调节其活性[1- - - - - -4]．例如，已显示诱导型NOS（INOS）同种型与诱导型COX同种型（COX-2）和至 - 硝基酸酯和活性COX-2 [2]．Kim最近更新了NO在前列腺素生物学中的作用[4]．直接NoS-Cox交叉谈的潜在机制可包括（1）核心血红素基的铁原子的（1）与亚硝基阳离子的反应的铁原子（没有+)与COX半胱氨酸(Cys)基团巯基(SH)形成 -NITROSO-COX，和（3）过氧尿苷的反应（ONOO−)，即NO自由基(∙NO），超氧化物阴离子自由基（ ）由NOS本身或由其他酶，包括COX和CYP [产生任3.]，其中Cys残基的SH基团或COX的酪氨酸(Tyr)残基参与催化过程[2]． COX-Cys部分的亚硝基化由NO的高氧化物，特别是三氧化二氮(N2O3.)和ONOO−和 由低分子质量COX-半胱氨酸部分的-transnitrosylation -nitrosothiols已被证明既增强和抑制COX的活性。位于COX的催化结构域的Tyr残基的硝化被假定为抑制COX的活性[2，4- - - - - -6]．另一方面，Onoo−据报道，可能通过增加COX过氧化物酶活性所需的过氧化物浓度来增强COX活性[7]．

对乙酰氨基酚(acetaminophen, APAP)是世界上应用最频繁的药物之一，在治疗剂量上通常被认为是一种安全的镇痛和退热药物，但缺乏明显的抗炎和抗血小板活性[10]．的对乙酰氨基酚的止痛和退热作用的机制尚未完全确定，但通过在不同细胞和组织类型扑热息痛抑制PGHS活性的一般假定为对乙酰氨基酚的止痛和退热作用的主要模式。PGHS具有过氧化物酶和环氧化酶活性。与大多数非甾体抗炎药（NSAIDs）和PGHS2抑制剂不同，寄生乙醇抑制PGHS的过氧化物酶催化位点。体外，扑热息痛是内皮细胞中前列腺合成的更强烈的抑制剂，而不是血小板。特别是，扑热息痛是TXA的弱抑制剂2血小板中的合成。扑热息痛的抑制性效力也与PGHS浓度与pGHS浓度相反（进行审查，见[10])。这些具体的特征区分的NSAID包括乙酰水杨酸（ASA）对乙酰氨基酚。

体外，通过测量各种前列腺的生产率，例如PGE，可以评估PGHS活性2，PGI2，和txa2。因为PGI具有显著的化学不稳定性2和txa2，它们稳定的水解产物，即6- keto-pgf1α和txb.2，而不是PGI2和txa2［11]．在体内，PGE的测量2, 6-keto-PGF1α，和txb.2与采血时人工合成前列腺素有关，可能导致有关PGHS活性的错误结论[12]．这尤其适用于血栓素2在活化的血小板中大量产生13]．PGE的测量2尿中反映肾PGE2合成。到目前为止，更可靠的方法是测量前列腺素的主要尿代谢物，如2,3-dinor- txb2用于血栓素2，2,3-dinor-6-keto-pgf1α对于PGI2，是PGE的主要尿代谢物2(PGE- mum)用于系统性PGE2生产(11]．这可以通过具有高灵敏度和高选择性的分析技术来实现，如气相色谱-质谱(GC-MS)和气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)。11])。

最近，Sudano和他的同事[9]报道了对乙酰氨基酚(1 g TID，在标准心血管治疗的基础上持续2周)使冠心病患者的动态平均收缩压和舒张压分别升高约3和2 mmHg，而不改变内皮和血小板功能。Sudano等人[9结论，特别是在患者以增加的心血管风险增加，寄生酵母的使用应作为传统的NSAID和选择性COX2抑制剂进行严格评估。在那种研究中，血浆和尿液2以及血浆TxB2服用扑热息痛后没有改变[9]．但是，如上所述，PGE的测量2和txb.2在等离子体容易出现假象前列腺素类合成[12，13]，而PGE的测量2在尿中没有提供关于两个拮抗剂为TxA的PGHS-催化合成信息2和pgi2［11]．

In humans, oral administration of paracetamol (500 mg) has been reported not to result in decreased excretion rate of 2,3-dinor-TxB2，不像阿司匹林(500毫克)或消炎痛(50毫克)，由气相色谱-质谱法测定[14]．Also, in contrast to aspirin (3 g for 2 days), oral administration of paracetamol (3 g for 2 days) has been reported not to reduce urinary excretion of PGE2但是弱削弱了PGE-Mum排泄，表明系统覆盖的抑制作用2合成 [15]．另一方面，单次口服500mg扑热息痛可降低尿液中2,3-dinor-6-keto- pgf的排泄率1αfor 6–8 h by maximally 60% (i.e., inhibition of PGI2合成），而不会降低2,3- DINOR-TXB的尿中排泄率2(即对TxA无抑制作用2合成)[16]．这些人体体内研究的结果表明，口服扑热氨，单次剂量500mg或累积剂量3000mg / d，对TxA没有明显抑制作用2合成，但也可以暂时禁止PGI2合成。

过去，NOS和COX途径之间的分支经常被研究(在[4]），但结果不一致。例如，在鼠巨噬细胞，扑热息痛，在药理学相关的血浆浓度下（60-120 μM)，据报道不会影响iNOS的活性[17]．据报道，在上文化培训浓度（2,5和10mm）中，帕拉基莫醇抑制了原始264.7细胞巨噬细胞中的Inos基因表达和Inos活性[18]．相比之下，据报道，扑热息痛（最多10毫米）不影响大鼠小脑和HUVECS中的神经元NOS（NNO）和INOS活性[19]．有人报告说对乙酰氨基酚（100 μM)通过放射性标记l -瓜氨酸测定，不影响小脑的NOS活性，但抑制小鼠脊髓切片的NOS活性[20.]．扑热息痛在人体内的作用尚不明确。

因为扑热息痛，当在药理剂量上施用时，抑制血管大常和抗凝固性PGI的合成2强得多和可持续比血管收缩形成血栓和血栓素的合成2在人类中，我们想知道扑热胺醇诱导的血管舒张间/血管收缩性和血管收缩/血栓形成COX相关性稳态的平衡的转移可能会诱导导致血管大胆/抗凝血剂的合成的过程，从而抵消血压下降和血小板活化。本集团的初步调查表明，扑热息痛，治疗剂量以健康人体（最多10毫克/千克），没有改变全身没有合成（未显示数据），表明扑热息索对NOS活动的潜在影响很可能需要更高，审议药物的审慎服用剂量。考虑到高扑热息痛剂量的毒理效力，我们研究了在四个健康志愿者中的单一口服3g剂量的影响。据我们所知，这种高唯一口服剂量扑热息痛对PGI的影响2,酸2，和NO的合成在人类还没有到目前为止调查。因为在人研究中使用的高剂量，对乙酰氨基酚可诱导的氧化应激，降低的生物利用度NO [21]．因此，我们测量了氧化应激生物标志物15（年代) 8 -iso-PGF.2α［22在血浆和尿液中。血浆中的亚硝酸盐作为NO合成和生物利用度的生物标志物被测定(在[23])。此外，我们还对大鼠肝细胞内重组内皮型NOS (eNOS)和诱导型NOS (iNOS)进行了体外研究，以检测扑热息痛对NO合成和生物利用度的潜在影响。

2。材料和方法

2.1。科目和学习表现

四名健康不吸烟的成年男性(年龄39、40、44和64岁)参与了这项研究，并对这项研究给予了知情同意。志愿者一次口服6片500mg的扑热息痛片(Ratiopharm)。志愿者A和志愿者B的剂量分别为29 mg/kg，志愿者C的剂量为37 mg/kg，志愿者d的剂量为52 mg/kg。志愿者没有禁食，但在给药后的前3小时内没有进食。在给药前和给药后，每隔30和60分钟收集静脉血和尿液，观察6小时，分析生化参数如下。静脉血(8 mL)用9 mL EDTA真空器(德国Sarstedt)抽取，立即离心(800 ×g, 4℃，5 min)。将血浆滗出，根据每个生化参数的要求，分成0.1和1.0 mL等量血浆，在−80°C冷冻保存直至分析。自动排尿的尿液收集在45 mL聚丙烯管中，根据单个生化参数的要求，分成0.1和1.0 mL两份，在−20°C下保存直到分析。

2.2。人类研究中的生化指标分析

这项研究的所有样本在收集后10天进行分析。在GC-MS和GC-MS / MS方法，据报道在相应的参考以下引用稳定同位素标记的类似物被用作内部标准。We found that paracetamol added to pooled human plasma at concentrations of 10, 25, 50, 75, and 100 mg/L did not interfere with the analysis of the biochemical parameters measured in the study plasma samples (data not shown). Data from this study are reported as mean ± standard error of the mean (SEM).

2.2.1。测量的扑热息痛

等离子体扑热胺浓度通过反相HPLC测定（250×4mm I.D.，5 μM粒径）具有等离子洗脱（流动相：45mM硫酸铵 - 乙腈，10：1，V / V;流速：1ml / min），具有紫外光度检测在236nm。

2.2.2。前列腺素和肌酐进行测量

PGI.2和txa2通过GC-MS / MS通过测量1mL尿液等分试样来评估合成，相应的主要尿代谢物[11，即2,3-dinor-6-keto- pgf1α和2,3- DINOR-TXB2，与别处所描述的完全一样[24]．p2和自由非共轭的15( ) 8 -iso-PGF.2αin urine (1 mL) and free 15(年代) 8 -iso-PGF.2α免疫亲和柱层析提取后，用GC-MS/MS测定血浆中(1 mL)的含量[25]．根据肌酐排泄校正二十烷类化合物尿排泄率[11]，在nmol前列腺素/mol肌酐中表达。测定尿肌酐10μ大号尿等分试样通过GC-MS如别处报道26]．

2.2.3。l -精氨酸/NO途径分析

亚硝酸盐和硝酸盐同时测定μL用GC-MS测定血浆或尿液的等量[27]．尿中亚硝酸盐和硝酸盐排泄率也校正肌酐排泄。用GC-MS和GC-MS/MS分别测定100个样品中的精氨酸和内源性NOS活性抑制剂不对称二甲基精氨酸(ADMA)μ根据先前报道的方法[通过离心从血浆中获得超滤液升份数8]．

2.2.4。额外的分析

用市售荧光偏振免疫分析法(FPIA)测定血浆(0.1 mL)中的总同型半胱氨酸(hcy)。体内CYP活性[28]通过测定氧化油酸(CIS.-EpOA)在1ml等量血浆中，如别处所述[29]．

2.2.5。质量控制

质量控制(QC)样品与研究样品一起分析所有生化参数。QC样品的准确度和精密度均在一般接受范围内;也就是说，偏差和不精确水平低于20%。

2.3。扑热息痛对重组人烯活性的影响

对乙酰氨基酚对体外一氧化氮合酶活性的影响通过使用市售(ALEXIS, Grünberg，德国)重组人内皮一氧化氮合酶(heNOS)和同时测量[15N]亚硝酸盐和[15从L - N]硝酸胍-15N2]精氨酸由GC-MS测定的手段[30.]．37℃，50 mM磷酸钾缓冲液(1000μL，pH7）含有HENOS（50 μg / mL), L - (胍-15N2]精氨酸（20 μM，Cambridge Isotope Lab，Andover，Ma，USA）和所有NOS Cofactors（所有来自Sigma-Aldrich，Steinheim，德国）和假肢（10 μ四氢生物蝶呤,800μM NADPH, 5μM时尚,5μm对于fmn，500 nm钙调蛋白和500 μM CaCl2(默克公司,达姆施塔特,德国))。加400终止反应μ样品经GC-MS分析[15N]亚硝酸盐和[15n]硝酸盐。未标记的亚硝酸盐和硝酸盐用作内部标准的[15N]亚硝酸盐和[15分别硝酸N]。数据以两个独立实验的平均值±标准差(SD)表示。

2.4。对乙酰氨基酚对iNOS活性在培养大鼠肝细胞增殖体外

对乙酰氨基酚的对iNOS活性的影响在原代大鼠肝细胞在体外的增殖进行了研究，通过测量地层的最近描述[15N]亚硝酸盐和[15N]硝酸盐气相色谱-质谱联用[31]．In some experiments, LiCl (10 mM) was used to enhance expression of iNOS-mRNA and cell growth [31]．孵育在37℃，5 mM L-[胍-15N2-精氨酸在-22 h时加入。加400终止反应μ冰冷的丙酮L的等份试样中，样品的GC-MS分析进行处理[15N]亚硝酸盐和[15n]硝酸盐。数据显示为来自三个独立实验的平均值±SD。

2.5。统计分析

由于在一些在四个受试者测量的生化参数的基线浓度相当大的差异，改变和统计显着性由各自的基线水平设置为100％来计算。统计学意义 （ )采用未配对法进行评价 -在比较百分比变化时，将不同时间获得的数据与基线值或0.5 h值进行比较。

3.结果

３．１．大剂量对乙酰氨基酚对人COX、NOS、CYP活性及氧化应激的影响

平均最大扑热息痛血药浓度( )为30.2 mg/L (200μmol / l）（图1）.该值与a一致 在2000mg扑热息痛的口服给药后达到约20mg / L的值[32]．在尿液样本中，我们用反相高效液相色谱法和紫外吸收检测法测定了对乙酰氨基酚葡萄糖醛酸酯和硫酸盐代谢物的可比肌酐校正排泄率(数据未显示)。


图1
之前和之后施用对乙酰氨基酚的血浆浓度对乙酰氨基酚的单次口服3克剂量至四个男性受试者（时间零点是由虚线箭头表示）。数据显示为平均值±SEM。

在摄入3 g扑热息痛后，肌酸酐校正的2,3-dinor-6-keto- pgf显著且持续下降1α排泄率，提示PGI较强2对乙酰氨基酚抑制(图2(一个)）.最大和统计学意义的pgi2inhibition of about 60 to 70% was reached 1 h, 1.5 h, and 2.5 h after paracetamol administration. The extent of the decrease seen in the 2,3-dinor-6-keto-PGF1α本研究中的排泄率与500mg口服扑热息痛剂量的排泄率相当[14]．对乙酰氨基酚引起2,3- DINOR-TXB只能算是中等，统计显着下降2排泄在四名志愿者（图2 (b)）.四分之三的志愿者，TxA达到最大值2在给药后1.5 h，抑制率达到70%左右2抑制时间相对较短(未显示)。数字2（c）显示了PGI2/酸2给予扑热息痛后，摩尔比降低了2 - 3倍，但在1.5小时内( ) and 2.5 h ( ）扑热息痛摄入后。扑热息痛似乎减少了PGE的排泄2在尿液（图2（d）），这表明即使3克立刻采取对乙酰氨基酚是不能抑制PGE的肾合成2在四名志愿者参与研究。

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图2.
2 1α 1α 2 2 2 2 2 2 1α 2 2 2 Effect of a single oral 3 g dose of paracetamol on systemic prostacyclin and thromboxane synthesis and on renal synthesis of PGE在四个健康的志愿者（时间零和基线值用虚线箭头表示）。（a）肌酸酐矫正尿排泄2,3- inor-6-keto-prostaglandin f（2,3-DN-6K-PGF)来衡量全身PGI合成。（b）肌酸酐矫正尿排尿2,3-末唑键B（2,3-DN-TXB）作为系统性TXA的衡量标准合成。（c）PGI/酸由2,3-DN-6K-PGF计算的摩尔比2，3.-dn-TxB排泄率分别如(a)和(b)所示。(d)肌酐纠正的PGE尿排泄肾PGE的措施合成。(a)中的星号表示有统计学意义()与基本值比较。数据显示为平均值±SEM。

扑热息痛引起的全身前列环素合成的变化并没有伴随血浆总hcy浓度的显著变化(图)3（a））或在自由排泄率15（年代) 8 -iso-PGF.2α(图3（b）），这表明在高剂量的对乙酰氨基酚给药没有仰角或减少氧化应激。

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图3.
年代 iso 2α iso 2α 在4名健康志愿者中，单次口服3 g对乙酰氨基酚对氧化应激的影响(时间零点和基线值用虚线箭头表示)。(a)血浆总同型半胱氨酸(hcy)浓度和(b)肌酐校正尿排泄率为15() 8 -前列腺素˚F（15（) 8 --PGF.）作为氧化应激的量度。数据显示为平均值±SEM。

因为在四个主题测量的基线血浆亚硝酸盐和硝酸盐浓度相当大的差异，在血浆亚硝酸盐和硝酸盐的变化进行计算并表示为相应的基线水平的百分比。数字4（a）显示血浆亚硝酸盐浓度的适度增加，当与0.5小时值进行比较时，血浆亚硝酸盐浓度统计学显着更高。血浆硝酸盐浓度的变化（图4（b）)和尿亚硝酸盐(图4（c））和尿液（图4（d））排泄并没有统计学显着不同。最后，血浆Arg和Adma浓度在扑热息痛摄入时没有改变（图4（e））.

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图4.
μ μ Effect of a 3 g single oral dose of paracetamol on plasma (a) and urine (c) nitrite, plasma (b) and urine (d) nitrate, and plasma arginine (Arg) and asymmetric dimethylarginine (ADMA) (e) in four healthy volunteers (time zero and baseline values are indicated by dashed lines). Data in plasma are shown as percentage changes of the baseline plasma nitrite concentrations (1.26, 3.04, 3.76, and 4.05 M)和基线血浆硝酸盐浓度(37.3、42.5、26.8和52.9分别。数据显示为平均值±SEM。星号表示统计学意义（)，与0.5 h值比较。

以前，我们表明，通过测量自由的浓度，可以评估CYP同种型的全身活性，即无敏化油酸氧化物CIS.-等离子体中的epoa [28]．数字5示出了在平均血浆的突然增加CIS.-EpOA concentration 2.5 h after paracetamol administration followed by an abrupt fall to baseline level 1 h later. This finding may suggest a very short-term paracetamol-induced elevation of CYP activity. However, we also found a very similar change in the plasma concentration of free 15( ) 8 -iso-PGF.2α(图5）.以前，我们观察到，除了磷脂酶A的2(中国人民解放军2）对人血清平行增加自由浓度CIS.-EpOA和免费15( ) 8 -iso-PGF.2α［25]．因此，在临时短时增加CIS.-EpOA和15 (年代) 8 -iso-PGF.2α扑热氨基醇给药后的2.5小时可能是由于大概的肝PLA释放而导致的2进入血液。


图5.
CIS. CIS. iso 2α CIS. Effect of a 3 g single oral dose of paracetamol on serum-epoxyoctadecanoic酸(-EpOA）和15（) 8 --PGF.四个健康志愿者(时间零点和基线值用虚线表示)。数据显示为平均值±SEM。注意上面的对数刻度设在。只有2.5 h的浓度-EpOA差异有统计学意义(）相比基线。
３．２．扑热息痛对大鼠肝细胞重组heNOS活性及iNOS的影响

在治疗相关的浓度100μM(即15 mg/L)时，对乙酰氨基酚对15N]亚硝酸盐和[15n]硝酸盐在重组梭藻的培养混合物中（图6）.[浓度之间分析线性回归15N]亚硝酸盐和[15N]对乙酰氨基酚与15N]亚硝酸盐和[15N]在不存在对乙酰氨基酚的硝酸盐揭示的0.834的斜率值（图6 (b)）.这一发现表明扑热息痛抑制了henos催化15没有形成（即，[15N]亚硝酸盐和[15从L - N]硝酸)胍-15N2-精氨酸的平均含量为16.6%，尤其当孵育时间大于10 min时。在体外不含LiCl的成年大鼠肝细胞增殖实验中，也可以看到扑热息痛对iNOS的类似小作用(图)7）.众所周知，过氧亚硝酸能将扑热息痛硝基硝化成3-硝基扑热息痛[33]．在重组heNOS和大鼠肝细胞iNOS的含有扑热息痛的样品中，no 3-[15通过高于定量限（约1nm）的GC-MS / MS检测N]硝基乙酰氨基检测到，表明不形成过氧腈（数据未显示）。

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图6.
μ 15 15 15 15 对乙酰氨基酚的效果（APAP）在100 M (15 mg/L)对形成[N]亚硝酸盐和[N]在重组构建heNOS的在温育时间（a）中的孵育混合物和硝酸盐之间的线性回归分析[N]亚硝酸盐和[(一)中的数据显示为两个独立实验的平均值±SD;没有进行统计分析。
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图7.
μ 15 14 15 14 胍 15 2 8 μ 对乙酰氨基酚的效果（APAP）在100 M (15 mg/L)对M /z 47的峰面积比[N]亚硝酸盐到m/z 46 for [N]亚硝酸盐（a）和上M / Z 63为峰面积比[N]硝酸盐到m/z 62为[N]硝酸盐（b）与L- [成年大鼠肝细胞的孵育时-N]-arginine (5 mM) in the absence and in the presence of LiCl (1 mM) for the indicated times at 37°C as described elsewhere []．加400终止反应冰冷的丙酮L的等分试样，并样品GC-MS分析进行进一步处理。数据显示为来自三个独立实验的平均值±SD;没有进行统计分析。

4.讨论

4．1.研究的一般说明和目的

扑热息痛通常被认为会增加氧化应激，因此通常用于氧化应激动物模型，在该模型中，扑热息痛被给予过高的剂量[21]．是否对乙酰氨基酚，当在治疗剂量给药，也可以作为助氧化剂是未知的。对乙酰氨基酚是已知的相互作用与许多酶如CYP，COX和NOS，其本身是公知的促进氧化应激，例如，通过产生超氧自由基阴离子。而对乙酰氨基酚的前列环素的合成在体内在人类中的抑制效果是公认[16[还对其对血栓素和NO合成的影响以及CYP活性的影响是不完全理解的。当该药物以治疗剂量施用时，例如通过口服施用500mg扑异戊酰胺片剂时，这可能是由于细胞内扑热酰胺浓度不足。本作本作的目的是在健康的人体内调查高剂律的扑热胺（即3g）对COX，NO和CYP的活性以及氧化应激的影响。鉴于帕拉基莫醇的众所周知的肝毒性，只注册了人类研究的4个健康受试者。通过使用预计为准相当一段的单3克口服剂量对人类的给药后时间对乙酰氨基酚的浓度，我们调查扑热息痛的效果在suprapharmacological浓度在体外对2种NOS异构体的活性，即，上在大鼠肝细胞中重组人烯醇和inos。

4.2。扑热息痛对环加氧基酶途径的影响

考虑到平均分数（口服生物利用度， )对乙酰氨基酚的值为88% [32]，其平均分布体积( )在本文描述的人类研究的志愿者中估计为88 L。这一数值几乎是估计志愿者血浆容量的25倍，表明扑热息痛浓度可能高达5000左右μM在除红细胞外的其他体内腔室。这样的高浓度足以抑制前列环素(PGI)2）和血栓素（TXA2)分别在内皮细胞和血小板中合成[10]．

Indeed, paracetamol, at the high single oral dose of 3 g, potently inhibited PGHS-catalyzed synthesis of PGI2是一种有效的血管扩张剂和血小板聚集抑制剂。相比之下，TxA的合成2扑热息痛是一种有效的血管收缩剂和血小板激活剂，在四名受试者中发现扑热息痛没有明显的抑制作用。药物对PGI的相对作用2和txa2合成通常是用类前列腺素的摩尔比来估计的[34]．在我们的研究中，单次口服3 g扑热息痛剂量可降低PGI的平均水平2/酸2摩尔比从给药前的约0.6到给药后的0.4到0.2之间，从而改变了血管扩张(PGI)2) / vasoconstrictory(酸2)平衡以血管扩张为代价。这种转变的后果可能是血压升高。确实，Sudano和他的同事发现，慢性给冠心病患者服用较低剂量的扑热息痛(1克TID，持续2周)，会导致血压小幅升高[9]．值得一提的是，在Sudano等人的研究中[9与我们在研究中测量的血浆中对乙酰氨基酚浓度相比，已经达到了相当低的水平。为证实先前的研究[9，15，我们发现PGE的排泄2提示即使高剂量3 g对乙酰氨基酚也没有显著改变肾脏PGE2生产在志愿者中。

4．3．扑热息痛对l -精氨酸/NO通路的影响

几个组研究了扑热息酰胺对NOS表达和活性的影响。然而，观察结果是矛盾的[17- - - - - -20.]．在我们的人体研究中，扑热息痛暂时增加了血浆中亚硝酸盐的浓度。由于循环中的亚硝酸盐的主要部分可能来自内皮细胞产生的NO [23[我们的体内结果可能表明亚乙酰氨基醇在给药后增加eNOS活性和/或eNOS表达2.5至3.5小时。然而，例如扑热胺醇诱导的硝酸盐对亚硝酸盐的替代方式也可能在志愿者中增加血浆亚硝酸盐浓度。扑热息痛不改变L-精氨酸/无途径的另外两种主要参数的血浆浓度，即L-精氨酸和ADMA。体外，扑热息痛对体外增殖的成年大鼠肝细胞中的分离的重组雌性和InOS中仅具有非常弱的抑制作用。众所周知的LiCl诱导大鼠肝细胞中Inos的表达和活性[31[inos活动增加，但没有改变生物利用度。因此，亚乙酰氨基酚和LiCl在大鼠肝细胞中影响了与昔昔氨酸相关的氧化应激。

4.4。扑热息痛对细胞色素P450通路的影响

对乙酰氨基酚被CYP家族氧化为NAPQI ( 乙酰- -苯醌亚胺)，扑热息痛的有毒中间体。不饱和脂肪酸包括花生四烯酸和油酸是CYP酶的底物[28，35]而且一些花生酸环氧化物是血管活性化合物[35]．在高浓度时(如，1000μM)，扑热息痛可能抑制CYP亚型的活性。在我们的人体研究中，扑热息痛暂时增加了血中油酸氧化物的浓度CIS.-epoa。作为CIS.-EpOA是人类CYP活性的标志[28[本发现可能表明扑热息痛是否增加了CYP活动的很短的时间。另一种解释等离子体中非常短持久的增加CIS.-EpOA浓度可能是细胞外磷脂酶A的活性2(中国人民解放军2）活动或肝解放军释放2通过扑热息痛进入血流，因为相当大的一部分CIS.-epoA被发现酯化到人血清脂质[28]．后一种解释得到了血浆中游离15( ) 8 -iso-PGF.2α显示了类似的课程，包括最大的最大值CIS.-EpOA在目前的人类研究中15 . It is worth值得一提的是年代) 8 -iso-PGF.2α和CIS.-EpOA并行孵育时与PLA释放从血脂2［28]．目前对扑热息痛对PLA的作用知之甚少2活动和/或表达式。与吲哚美辛相反，扑热息痛(1000μm）被发现不抑制细胞外PLA2活性使用放射性标记的油酸测量酯化大肠杆菌膜[36.]．In mice, hepatotoxicity induced by paracetamol at a dose of 400 mg/kg, that is, about 10 times higher than in our human study, was found to be associated with a time-dependent mode with increased secretion of hepatic PLA2在没有肝脏COX-2的情况下加剧了这一点[37.]．因此，暂时增加了CIS.-EpOA和15 (年代) 8 -iso-PGF.2α在我们的研究中观察到的可能是由于对乙酰氨基酚在健康受试者中引起的短期肝毒性。

4.5。氧化应激对乙酰氨基酚的影响。

In the human study, paracetamol (3 g) did not increase oxidative stress as assessed by measuring urinary excretion of the oxidative stress biomarker 15( ) 8 -iso-PGF.2α［21，22]．如上所述，在的免费15的血浆浓度的急剧并短时增加讨论（ ) 8 -iso-PGF.2α可能是由于解放军暂时释放2来自肝脏和/或由于细胞外PLA的激活2。在这样高的剂量下，对乙酰氨基酚并没有增加，这通常被假定为与氧化应激相关的血浆总hCys。鉴于对乙酰氨基酚的ROS清除酚部分（ 乙酰- -氨基酚)，扑热息痛没有增强氧化应激似乎是合理的。F2-isoprostane 15 ( ) 8 -iso-PGF.2α是由AA通过COX的催化作用产生的[38.]．与乙酰水杨酸、吲哚美辛和塞来昔布相比[25，39.], our study indicates that paracetamol (3 g) does not inhibit COX-dependent formation of 15( ) 8 -iso-PGF.2α在人类身上。

结论

我们研究了镇痛解热酚类药物paracetamol对L-Arg/NO、AA/COX、CYP生化途径和氧化应激的体内外影响。在高单次口服剂量3 g时，扑热氨酚没有改变体内氧化应激。在超药理学浓度下，paracetamol也没有改变体外氧化应激，这是通过在重组heNOS孵育混合物和表达iNOS的成年大鼠肝细胞中测定的不变的亚硝酸盐-硝酸盐摩尔比得出的。的PGI2在本研究的健康受试者中，高剂律扑热息醇的抑制表明，其他人在CAD患者中看到的血压相对较小的增加[9很可能是由于涉及血管扩张剂增强形成的代偿机制。可能的候选物质是NO和环氧二十碳三烯酸(EETs)。在循环过程中，l -精氨酸可以通过eNOS和/或亚硝酸盐/硝酸盐的催化作用产生NO。et是由花生四烯酸在CYP家族的催化作用下产生的[34]．我们的结果表明，在健康受试者中，NO可以补偿高剂量扑热息痛引起的血管舒张和抗聚集性前列环素的损失(图)8）.另外，扑热息痛即使在超药理学剂量的情况下也不会增加氧化应激。我们假设在健康人中扑热息痛诱导PGI的变化2/酸2平衡是通过在循环的NO产生伴随增加抵消。基本的机制仍不清楚。可能促成机制可能包括在内皮NO的仰角和硝酸盐转化为亚硝酸盐和其连续还原为NO。在从心血管疾病，即与内皮机能障碍的患者中，对乙酰氨基酚仅部分地抵消通过NO其不利的血管舒张/血管收缩作用。

(一)＂name=
(一)
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(b)
图8.
2 2 ∙ 2 ∙ 2 2 ∙ ∙ 9 ≈ 简化方案显示没有在健康和疾病对乙酰氨基酚（扑热息痛）的（a）和与（二）管理的三大酶途径的血管收缩，血管扩张，并在血管聚集所提出的贡献。在血小板中，花生四烯酸（AA）是通过COX-1转化为血管收缩剂和聚合器为TxA。在内皮细胞中，AA是由COX-2转换为PGI，L-Arg通过NOS氧化没有;PGI.和NO既是血管扩张剂又是抗聚集剂。AA被CYP环氧合酶(CYP)转化为血管扩张剂环氧二十碳三烯酸(EETs)。(a)在没有包括扑热息痛在内的COX抑制剂的情况下，在健康情况下，生产TxA，PGI，NO，并且保证的EET血管收缩/聚集和血管扩张/抗凝之间的平衡。（b）中对乙酰氨基酚和其他COX抑制剂移位赞成COX依赖性血管收缩/聚集的这种平衡。响应于该移位，不增加任何EETS形成，以补偿不平衡。在健康中，这种补偿成功，血压和血小板聚集不会改变。在内皮功能障碍相关的疾病中，如冠状动脉疾病（CAD），这种补偿不足，导致血压的中等增加[]．-、+和平均抑制，激活，无显着的变化。箭头的厚度是定量的，但不适合衡量单个途径和扑热息痛的贡献。

缩写

AA: 花生四烯酸
ADMA： 不对称dimethylarginine
APAP： 对乙酰氨基酚（即，对乙酰氨基酚）
arg： 精氨酸
作为一个： 乙酰水杨酸
CAD： 冠状动脉疾病
CYP： 细胞色素P450
考克斯: 环氧合酶
的EET： Epoxyeicosatrienoic酸
FPIA: 荧光偏振免疫分析
气相: 气相色谱分析-质谱法
gc - MS / MS: 气相色谱 - 串联质谱
HUVECS： 人脐静脉内皮细胞
tHyc： 总同型半胱氨酸
不： 一氧化氮
nos： 一氧化氮合成酶
以挪士: 内皮型一氧化氮合酶
构建heNOS： 人内皮型一氧化氮合酶
伊诺: 诱导型一氧化氮合酶
nNOS: 神经元一氧化氮合酶
非甾体抗炎药: 非甾体抗炎药
PG： 前列腺素
p2： 前列腺素E.2
PGE-MUM： 前列腺素e大尿代谢物
PGHS: H前列腺素合成酶
PGI.2： 环前列腺素
pl2： 磷脂酶A.2
质量控制: 质量控制
ROS： 反应性氧气
SD: 标准偏差
SEM： 均值的标准误差
TID： 一日三次
氨甲环酸2： 血栓素一个2。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

迪米特里奥斯Tsikas构思和设计在论文中描述的所有实验。阿恩Trettin和安克BÖHMER在重组酶和肝细胞体外实验进行，进行生物化学分析，并写在纸张的部分。玛利亚-泰勒莎的Suchy执行在人研究中获得的样品的生化分析。Irmelin普罗布斯特管理和监督对肝细胞的实验。所有作者阅读并认可的文件的最终版本。

致谢

该研究部分得到了德国科学基金会(Grant TS 60/4-1)的支持。作者感谢B. Beckmann和A. Mitschke出色的实验室协助和f . m。用于GC-MS和GC-MS/MS分析。

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