OMCL 氧化医学与细胞寿命 1942-0994. 1942-0900 印度发布公司 212576 10.1155 / 2014/212576 212576 研究文章 对乙酰氨基酚对健康男性受试者、大鼠肝细胞和重组NOS、COX、CYP活性及氧化应激的影响 特雷廷 arne 1 Böhmer Anke 1 这款酒店 玛丽亚 - Theresia 1 probst. Irmelin 2 Staerk 乌尔里希 1 Stichtenoth Dirk O. 1 Frolich 尤尔根C。 1 http://orcid.org/0000-0001-6320-0956 Tsikas. DIMITRIOS. 1 Giustarini 丹妮拉 1 临床药理学研究所 汉诺威医学院 30625年汉诺威 德国 mh-hannover.de 2 生物化学与分子细胞生物学系 Georg-August大学 37073戈廷根 德国 uni-gooettingen.de. 2014 31 3. 2014 2014 27 01. 2014 26 02. 2014 31 3. 2014 2014 版权所有©2014 Arne Trettin等。 这是在Creative Commons归因许可下分发的开放式访问文章，其允许在任何介质中不受限制地使用，分发和再现，只要正确引用了原始工作。

扑热息痛（对乙酰氨基酚）是一种广泛使用的止痛药。它与各种酶家族包括细胞色素P450（CYP），环加氧酶（COX），和一氧化氮合酶（NOS）相互作用，并且该相互作用可能会产生反应性氧物质（ROS）。We investigated the effects of paracetamol on prostacyclin, thromboxane, nitric oxide (NO), and oxidative stress in four male subjects who received a single 3 g oral dose of paracetamol. Thromboxane and prostacyclin synthesis was assessed by measuring their major urinary metabolites 2,3-dinor-thromboxane B22, 3-dinor-6-ketoprostaglandin F1 α， 分别。通过测量血浆中的亚硝酸盐来评估内皮内没有合成。尿15（ 年代)-8- iso-prostaglanding F2 α以评估氧化应激。血浆氧化油酸( 独联体-EpOA）作为细胞色素P450活性的标志物进行测量。服用扑热息痛后，前列环素合成受到强烈抑制，而NO合成增加，血栓素合成几乎保持不变。扑热息痛可能以血管扩张为代价改变COX依赖性血管扩张/血管收缩平衡。这种效应可能是可通过增加内皮NO合成来拮抗。高剂量对乙酰氨基酚不会增加氧化应激。在药理学相关浓度下，对乙酰氨基酚不会影响重组人内皮NOS或诱导型NOS在大鼠肝细胞中的NO合成/生物利用度。我们得出结论，对乙酰氨基酚不会增加氧化应激ress在人类中存在。

 1.介绍

一氧化氮(NO)、前列腺素(PG2，即前列腺素（PGI2)和血栓素A2（TXA.2)是重要的短命信号分子，参与许多生理和病理过程。因此,PGI2和NO是有效的血管扩张剂和血小板聚集的抑制剂。相反，血栓素2是一种强血管收缩剂和血小板聚集诱导剂。NO是由l -精氨酸(Arg)通过组成型和诱导型NO合酶(NOS)亚型合成的。前列腺素H合成酶(PGHS)亚型，通常称为环加氧酶(COX)，将花生四烯酸(AA)转化为统称为前列腺素。l -精氨酸/NO途径通常被认为与COX途径相互作用并调节其活性[ 1- - - - - - 4]．例如，可诱导的NOS (iNOS)亚型已被证明与可诱导的COX亚型(COX-2)结合并与 年代 - 硝基酸酯和活性COX-2 [ 2]．Kim最近更新了NO在前列腺素生物学中的作用[ 4]．直接NoS-Cox交叉谈的潜在机制可包括（1）核心血红素基的铁原子的（1）与亚硝基阳离子的反应的铁原子（没有+)与COX的半胱氨酸（Cys）部分的巯基（SH）基团形成 年代 -NITROSO-COX，和（3）过氧尿苷的反应（ONOO-)，即NO自由基( ∙NO)和超氧自由基阴离子( O 2 ∙ - )，由NOS本身或其他酶(包括COX和CYP)产生[ 3.]，SH群Cys残留物或酪氨酸（Tyr）的酪氨酸（Tyr）残留在催化过程中参与[ 2]． 年代 COX-Cys部分的亚硝基化由NO的高氧化物，特别是三氧化二氮(N2O3.)和ONOO-和 年代 COX-Cys基的低分子亚硝基化 年代 已经显示出硝基噻唑醇，既增强和抑制COX活性。假设位于COx催化结构域中的Tyr残基的硝化物抑制COX活性[ 2， 4- - - - - - 6]．在另一方面，亚硝酸阴离子-据报道，可能通过增加COX过氧化物酶活性所需的过氧化物浓度来增强COX活性[ 7]．

乙酰氨基酚（乙酰氨基酚，APAP）是全球最常见的应用药物之一，其含量在治疗剂量中是一种安全的镇痛药和解热药物，但缺乏明显的抗炎和抗血小板活性[ 10.]．扑热息痛镇痛解热作用机制尚未完全确定，但一般认为扑热息痛通过抑制不同细胞和组织类型的PGHS活性是扑热息痛镇痛解热作用的主要方式。PGHS具有过氧化物酶和环氧合酶活性。扑热息痛被认为可以抑制PGHS的过氧化物酶催化位点，这与大多数非甾体抗炎药(NSAIDs)和PGHS2抑制剂不同。在体外，对乙酰氨基酚是内皮细胞中比血小板中更强的前列腺素合成抑制剂。特别是扑热息痛是TxA的弱抑制剂2血小板中的合成。扑热息痛的抑制性效力也与PGHS浓度与pGHS浓度相反（进行审查，见[ 10.]）。这些特殊特征区分扑热酰胺来自包括乙酰丙烯酸（ASA）的NSAID。

在体外，PGHS的活性可以通过测量各种原代前列腺素的产生率来评估，如PGE2，pgi.2，和酸2．因为PGI具有显著的化学不稳定性2和酸2，它们稳定的水解产物，即6- keto-pgf1 α和TxB2分别被测量PGI代替2和酸2［ 11.]．在体内，PGE的测量2，6-酮 - 前列腺素F1 α，和TxB2与采血时人工合成前列腺素有关，可能导致有关PGHS活性的错误结论[ 12.]．这尤其适用于TXA2在活化的血小板中大量产生 13.]．PGE的测量2在尿液中反映了肾脏的PGE2合成。到目前为止，更可靠的方法是测量前列腺素的主要尿代谢产物，如2,3-二硝基-TxB2对于TXA.22 3-dinor-6-keto-PGF1 α对于PGI.2，以及PGE的主要尿代谢产物2(PGE- mum)用于系统性PGE2生产( 11.]．这可以通过具有高灵敏度和高选择性的分析技术来实现，如气相色谱-质谱(GC-MS)和气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)。 11.]）。

最近，Sudano和他的同事[ 9] reported that paracetamol (1 g TID for 2 weeks on top of standard cardiovascular therapy) increased ambulatory mean systolic and diastolic blood pressure by about 3 and 2 mmHg, respectively, without changing endothelium and platelet function in patients with coronary artery disease (CAD). Sudano et al. [ 9]的结论，特别是在心血管风险增加的患者，使用扑热息痛应像传统的非甾体抗炎药和选择性COX2抑制剂一样严格评估。在那项研究中，血浆和尿液中的PGE2以及血浆TxB2服用扑热息痛后没有改变[ 9]．然而，如上所述，PGE的测量2和TxB2在血浆中易于人工合成前列腺素[ 12.， 13.]，而PGE的测量2在尿液中不能提供pghs催化合成两种拮抗剂TxA的信息2和PGI2［ 11.]．

在人类中，口服扑热息痛(500mg)并没有导致2,3-dinor- txb的排泄率下降2，不像阿司匹林(500毫克)或消炎痛(50毫克)，由气相色谱-质谱法测定[ 14.]．此外，与阿司匹林（3g 2天）相反，据报道，口服扑热氨基醇（3g 2天）并不减少PGE的尿排泄2但至弱减少PGE-MUM排泄指示全身PGE的抑制2合成( 15.]．另一方面，已显示单个口服剂量为500mg扑热酰胺，以降低2,3- in-6-keto-pgf的尿液排泄率1 α以最大60％的6-8小时（即，抑制PGI2而不降低尿中2,3-dinor- txb的排泄率2(即对TxA无抑制作用2合成） [ 16.]．这些在人类受试者的体内研究中的结果表明口服扑热息醇，单剂量为500毫克或每天3000毫克的累积剂量，不会显着抑制TXA2合成，但可能暂时抑制PGI2合成。

过去，NOS和COX途径之间的分支经常被研究(在[ 4]），但结果不一致。例如，在鼠巨噬细胞，扑热息痛，在药理学相关的血浆浓度下（60-120  μM)，据报道不会影响iNOS的活性[ 17.]．据报道，在上文化培训浓度（2,5和10mm）中，帕拉基莫醇抑制了原始264.7细胞巨噬细胞中的Inos基因表达和Inos活性[ 18.]．相比之下，据报道，扑热息痛（最多10毫米）不影响大鼠小脑和HUVECS中的神经元NOS（NNO）和INOS活性[ 19.]．其他人报告过扑热息痛（100  μM)通过放射性标记l -瓜氨酸测定，不影响小脑的NOS活性，但抑制小鼠脊髓切片的NOS活性[ 20.]．扑热息痛在人体内的作用尚不明确。

因为对乙酰氨基酚，当在药理剂量施加，抑制vasodilatatory和抗凝集PGI的合成2比血管收缩和血栓形成的TxA的合成更强，更持久2在人类中，我们想知道vasodilatatory /抗凝集和血管收缩/血栓形成COX-相关稳态之间的平衡的对乙酰氨基酚诱导的是否移可诱导过程上，导致增强的vasodilatatory /抗凝集NO，从而抵消血压下降和血小板活化的合成。Preliminary investigations of our group showed that paracetamol, administered in therapeutic doses to healthy humans (up to 10 mg/kg), did not change whole body NO synthesis (data not shown), suggesting that a potential effect of paracetamol on NOS activity is likely to require much higher, suprapharmacological doses of this drug. In consideration of the toxicological potency of high paracetamol doses, we investigated the effects of a single oral 3 g dose in four healthy volunteers. To our knowledge, the effects of such a high single oral dose of paracetamol on PGI2，TXA2，和NO在人体内的合成目前还没有研究。由于在人体研究中使用了高剂量的扑热息痛，它可能会诱导氧化应激，降低NO的生物利用度[ 21]．因此，我们测量了氧化应激生物标志物15（ 年代)-8- iso-PGF.2 α［ 22在血浆和尿液中。血浆中的亚硝酸盐作为NO合成和生物利用度的生物标志物被测定(在[ 23]）。此外，我们在大鼠肝细胞中对重组内皮NOS（ENOS）和诱导型NOS（INOS）进行体外研究，以测试扑热酰胺对扑热酰胺的潜在影响无合成和生物利用度。

 2.材料和方法 2.1。科目和学习表现

四名健康不吸烟的成年男性(年龄39、40、44和64岁)参与了这项研究，并对这项研究给予了知情同意。志愿者一次口服6片500mg的扑热息痛片(Ratiopharm)。志愿者A和志愿者B的剂量分别为29 mg/kg，志愿者C的剂量为37 mg/kg，志愿者d的剂量为52 mg/kg。志愿者没有禁食，但在给药后的前3小时内没有进食。在给药前和给药后，每隔30和60分钟收集静脉血和尿液，观察6小时，分析生化参数如下。静脉血(8 mL)用9 mL EDTA真空器(德国Sarstedt)抽取，立即离心(800 ×g, 4℃，5 min)。将血浆滗出，根据每个生化参数的要求，分成0.1和1.0 mL等量血浆，在−80°C冷冻保存直至分析。自动排尿的尿液收集在45 mL聚丙烯管中，根据单个生化参数的要求，分成0.1和1.0 mL两份，在−20°C下保存直到分析。

 2.2。人类研究中的生化参数分析

本研究的所有样本均在采集后10天内进行分析。在GC-MS和GC-MS/MS方法中，稳定同位素标记类似物作为内标，参考文献如下。我们发现，在混合血浆中添加浓度为10、25、50、75和100 mg/L的扑热息痛，不会干扰研究血浆样本中测定的生化参数的分析(数据未显示)。本研究的数据以均数±均数标准误差(SEM)报告。

2.2.1。测量的扑热息痛

等离子体扑热胺浓度通过反相HPLC测定（250×4mm I.D.，5  μM粒径）具有等离子洗脱（流动相：45mM硫酸铵 - 乙腈，10：1，V / V;流速：1ml / min），具有紫外光度检测在236nm。

 2.2.2. 前列腺素和肌酐的测定

PGI.2和酸2通过GC-MS / MS通过测量1mL尿液等分试样来评估合成，相应的主要尿代谢物[ 11.]，即2,3-二硝基-6-酮基-PGF1 α2, 3-dinor-TxB2，一如其他地方所述[ 24].PGE2和自由非共轭的15( 年代 )-8- iso-PGF.2 α尿液（1毫升）和免费15（ 年代)-8- iso-PGF.2 α免疫亲和柱层析提取后，用GC-MS/MS测定血浆中(1 mL)的含量[ 25]．类二十烷酸的尿排泄速率为肌酸酐排泄校正[ 11.]，在nmol前列腺素/mol肌酐中表达。测定尿肌酐10 μL其他地方报告的GC-MS法测定的尿液小份[ 26]．

 2.2.3。l -精氨酸/NO途径分析

在100中同时测量亚硝酸盐和硝酸盐  μl如其他地方所述的GC-MS等等离子体或尿液 27]．尿中亚硝酸盐和硝酸盐排泄率也校正肌酐排泄。用GC-MS和GC-MS/MS分别测定100个样品中的精氨酸和内源性NOS活性抑制剂不对称二甲基精氨酸(ADMA) μl根据先前报道的程序通过离心从等离子体获得的超滤液等分试样[ 8]．

 2.2.4。额外分析

用市售荧光偏振免疫分析法(FPIA)测定血浆(0.1 mL)中的总同型半胱氨酸(hcy)。体内CYP活性[ 28]通过测定氧化油酸( 独联体-EpOA)在1ml等量血浆中，如别处所述[ 29]．

 2.2.5。质量控制

质量控制(QC)样品与研究样品一起分析所有生化参数。QC样品的准确度和精密度均在一般接受范围内;也就是说，偏差和不精确水平低于20%。

 2.3。扑热息痛对重组人烯活性的影响

通过使用市售（ALEXIS，Grünberg，德国）重组人内皮NOS（heNOS）和同时测量NOS的形成，研究对乙酰氨基酚对体外NOS活性的影响[15.N] 亚硝酸盐和[15.N] 硝酸盐-[ 胍-15.N2]通过GC-MS测定的精氨酸[ 30.]．37℃，50 mM磷酸钾缓冲液(1000 μL，pH7）含有HENOS（50  μg / mL), L - ( 胍-15.N2精氨酸(20 μM，Cambridge Isotope Lab，Andover，Ma，USA）和所有NOS Cofactors（所有来自Sigma-Aldrich，Steinheim，德国）和假肢（10  μ四氢生物蝶呤,800 μM NADPH, 5 μM FAD，5  μm对于fmn，500 nm钙调蛋白和500  μ中号氯化钙2(默克公司,达姆施塔特,德国))。加400终止反应 μ处理L等份冰凉丙酮和样品，以进行气相色谱-质谱分析[15.N] 亚硝酸盐和[15.N]硝酸。未标记的亚硝酸盐和硝酸盐用作内部标准的[15.N] 亚硝酸盐和[15.分别硝酸N]。数据以两个独立实验的平均值±标准差(SD)表示。

 2.4。乙酰氨基酚对体外培养大鼠肝细胞InOS活性的影响

对乙酰氨基酚对体外增殖的原代大鼠肝细胞iNOS活性的影响进行了研究，最近通过测量iNOS的形成进行了描述[15.N] 亚硝酸盐和[15.N]硝酸盐气相色谱-质谱联用[ 31].在一些实验中，LiCl（10 mM）用于增强iNOS mRNA的表达和细胞生长[ 31].在37°C的温度下，在5 嗯-[ 胍-15.N2] -Arginine在时间-22小时加入。加400终止反应 μl等分试样的冰冷丙酮，并处理样品的GC-MS分析[15.N] 亚硝酸盐和[15.N]硝酸。数据显示为三个独立实验的平均值±SD。

 2．5．统计分析

由于在四个受试者中测量的一些生化参数的基线浓度存在相当大的差异，我们将各自的基线水平设置为100%来计算变化和统计学意义。统计学意义( P < ０．０５ )采用未配对法进行评价 t -test并且当百分比变化进行比较的比较在不同时间获得的基线值或到0.5小时的值的数据。

 3.结果 3.1。高剂量扑热息醇对人COX，NO和CYP活性及对人体氧化应激的影响

平均最大扑热息痛血药浓度( C 最大限度 ⁡ ）是30.2 mg / L（200  μmol / L)(图 1)．该值与a一致 C 最大限度 ⁡ 口服2000毫克扑热息痛后所达到的约20毫克/升的剂量[ 32]．在尿液样本中，我们用反相高效液相色谱法和紫外吸收检测法测定了对乙酰氨基酚葡萄糖醛酸酯和硫酸盐代谢物的可比肌酐校正排泄率(数据未显示)。

在给药前后扑热氨基酚的血浆浓度（时间归零由划箭头表示的亚乙酰氨基醇和四个男性受试者的亚乙酰氨基酚。数据显示为平均值±SEM。

在摄入3 g扑热息痛后，肌酸酐校正的2,3-dinor-6-keto- pgf显著且持续下降1 α排泄率，提示PGI较强2对乙酰氨基酚抑制(图 2(一个))．最大且有统计学意义的PGI2对乙酰氨基酚给药后1 h、1.5 h和2.5 h的抑制作用约为60 ~ 70%。2,3-dinor-6-keto-PGF下降程度明显1 α本研究中的排泄率与施用500毫克口服扑热蛋白剂量时可比相当[ 14.]．扑热息痛仅导致2,3-丁- txb中度、无统计学意义的下降2四名志愿者的排泄量(图 2 (b))．四分之三的志愿者，TxA达到最大值2inhibition of about 70% was reached 1.5 h after administration, but the duration of TxA2抑制时间相对较短（未显示）。图 2 (c)显示PGI2/酸2扑热氨基酚给药后摩尔比下降2至3倍，尽管统计显着性失败的头发1.5小时（ P ＝ 0.069 )和2.5 h( P ＝ 0.056 ）扑热息痛摄入后。扑热息痛似乎减少了PGE的排泄2在尿液（图 2 (d))，提示即使一次性服用3 g对乙酰氨基酚也不能抑制肾脏PGE的合成2在四名参与研究的志愿者中

单次口服的效果3 g剂量的扑热息痛对全身前列环素和血栓素合成以及肾脏PGE合成的影响24名健康志愿者(时间零点和基线值用虚线箭头表示)。(a)肌酐纠正的2,3-dinor-6-keto-prostaglandin F尿排泄量1 α(2, 3-dn-6k-PGF1 α)来衡量全身PGI2合成。（b）肌酸酐矫正尿排尿2,3-末唑键B2(2, 3-dn-TxB2）作为系统性TXA的衡量标准2合成。（c）PGI2/酸2由2,3-DN-6K-PGF计算的摩尔比1 α2, 3-dn-TxB2排泄率分别如(a)和(b)所示。(d)肌酐纠正的PGE尿排泄2作为肾脏PGE的一种测量方法2合成。(a)中的星号表示有统计学意义( P < ０．０５ ）与基础值相比。数据显示为平均值±SEM。

扑热息痛引起的全身前列环素合成的变化并没有伴随血浆总hcy浓度的显著变化(图) 3（a））或在自由排泄率15（ 年代)-8- iso-PGF.2 α(图 3（b）），表明在高剂律的扑热氨基酚给药时没有氧化应激的升高或降低。

在4名健康志愿者中，单次口服3 g对乙酰氨基酚对氧化应激的影响(时间零点和基线值用虚线箭头表示)。(a)血浆总同型半胱氨酸(hcy)浓度和(b)肌酐校正尿排泄率为15( 年代)-8- iso前列腺素F2 α（15（ 年代 )-8- iso-PGF.2 α）作为氧化应激的量度。数据显示为平均值±SEM。

由于在四名受试者中测定的血浆亚硝酸盐和硝酸盐的基线浓度存在相当大的差异，因此计算血浆亚硝酸盐和硝酸盐的变化，并以各自基线水平的百分比表示。数字 4（a）显示血浆亚硝酸盐浓度的适度增加，当与0.5小时值进行比较时，血浆亚硝酸盐浓度统计学显着更高。血浆硝酸盐浓度的变化（图 4（b）)和尿亚硝酸盐(图 4（c））和尿液（图 4（d））排泄并没有统计学显着不同。最后，血浆Arg和Adma浓度在扑热息痛摄入时没有改变（图 4（e）)．

3g单口服剂量扑热戊酰胺对血浆（a）和尿液（c）亚硝酸盐，血浆（b）和尿液（d）硝酸盐，和血浆精氨酸（arg）和不对称二甲基碱（Adma）（e）的影响健康的志愿者（时间零和基线值用虚线表示）。等离子体中的数据显示为基线血浆亚硝酸盐浓度的百分比变化（1.26,3.04,3.76和4.05  μM）和基线等离子体硝酸盐浓度（37.3,42.5,26.8和52.9  μ米)。数据显示为平均值±SEM。星号表示统计意义( P < ０．０５ )，与0.5 h值比较。

以前，我们表明，通过测量自由的浓度，可以评估CYP同种型的全身活性，即无敏化油酸氧化物 独联体-等离子体中的epoa [ 28].图 5显示平均等离子体的突然增加 独联体-EpOA浓度2.5 h服用扑热息痛后突然降至基线水平1 这一发现可能提示对乙酰氨基酚引起的CYP活性的短期升高。然而，我们也发现血浆中游离15-羟色胺浓度的变化非常相似( 年代 )-8- iso-PGF.2 α(图 5)．以前，我们观察到添加磷脂酶a2(中国人民解放军2）对人血清平行增加自由浓度 独联体-EpOA和免费15( 年代 )-8- iso-PGF.2 α［ 25]．因此，暂时的短时间增加 独联体-EpOA和15 ( 年代)-8- iso-PGF.2 α扑热氨基醇给药后的2.5小时可能是由于大概的肝PLA释放而导致的2进入血液。

单次口服3克扑热息痛对血清的影响 独联体-epoxyoctadecanoic酸( 独联体-（a）及15( 年代 )-8- iso-PGF.2 α四个健康志愿者(时间零点和基线值用虚线表示)。数据显示为平均值±SEM。注意上面的对数刻度 y -轴。Only the 2.5 h concentration of 独联体-EpOA差异有统计学意义( P < ０．０５ )与基线相比。

 ３．２．扑热息痛对大鼠肝细胞重组heNOS活性及iNOS的影响

治疗相关浓度为100  μM(即15 mg/L)时，对乙酰氨基酚对15.N] 亚硝酸盐和[15.n]硝酸盐在重组梭藻的培养混合物中（图 6)．[中的浓度分析的线性回归15.N] 亚硝酸盐和[15.N]对乙酰氨基酚与15.N] 亚硝酸盐和[15.在没有扑热息痛的情况下，N]硝酸盐的斜率值为0.834(图 6（b）)．这一发现表明扑热息痛抑制了henos催化15.没有形成（即，[15.N] 亚硝酸盐和[15.从L - N]硝酸) 胍-15.N2]-arginine in average by 16.6%, notably for incubation times longer than 10 min. Similar small effects of paracetamol on iNOS were also seen in experiments with adult rat hepatocytes proliferating in vitro independent of the presence of LiCl (Figure 7)．众所周知，过氧亚硝酸能将扑热息痛硝基硝化成3-硝基扑热息痛[ 33]．在重组heNOS和大鼠肝细胞iNOS的含有扑热息痛的样品中，no 3-[15.通过高于定量限（约1nm）的GC-MS / MS检测N]硝基乙酰氨基检测到，表明不形成过氧腈（数据未显示）。

对乙酰氨基酚(APAP)在100 μm（15 mg / L）形成[15.N] 亚硝酸盐和[15.N]在孵育时间(a)和线性回归分析[15.N] 亚硝酸盐和[15.N] 在对乙酰氨基酚（b）存在和不存在的情况下测量硝酸盐浓度。（a）中的数据显示为两个独立实验的平均值±SD；未进行统计分析。

对乙酰氨基酚(APAP)在100 μM (15 mg/L)对M /z 47的峰面积比[15.N]亚硝酸盐为m /为[Z 4614.n]亚硝酸盐（a）和m / z 63的峰面积比[15.N]硝酸盐到m/z 62为[14.n]硝酸盐（b）用L- [培养成年大鼠肝细胞 胍-15.N2]-精氨酸(5 mM)，在37℃条件下无LiCl (1 mM)和存在LiCl (1 mM)的指示时间，如其他地方所述[ 8]．加400终止反应 μL进一步加工了另外的冰冷丙酮和样品用于GC-MS分析。数据显示为三个独立实验的平均值±SD;没有进行统计分析。

 4.讨论 4.1。一般言论和研究的目的

扑热息痛通常被认为会增加氧化应激，因此通常用于氧化应激动物模型，在该模型中，扑热息痛被给予过高的剂量[ 21]．扑热息痛，当给予治疗剂量时，是否也起促氧化剂的作用尚不清楚。扑热息痛已知能与许多酶相互作用，如CYP、COX和NOS，而这些酶本身也会导致氧化应激，例如，通过产生超氧自由基阴离子。而扑热氨醇对人体内前列环素合成的抑制作用已被证实[ 16.]，其对血栓烷和NO合成以及CYP活性的影响尚不完全清楚。这可能是由于当以治疗剂量给药时，例如口服500mg扑热息痛片时，细胞内扑热息痛浓度不够高。本研究的目的是在健康人群中研究大剂量扑热息痛(即3 g)对COX、NOS和CYP活性以及氧化应激的影响。鉴于众所周知的扑热息痛的肝毒性，只有4名健康受试者被纳入人体研究。通过使用对乙酰氨基酚浓度,有望获胜后相当一段时间管理一个3 g口服剂量对人类,我们调查的影响扑热息痛在suprapharmacological浓度两个号的活动亚型体外,也就是说,在鼠肝细胞重组人类以挪士和进气阀打开。

 4．2．扑热息痛对环氧合酶通路的影响

考虑平均分数(口服生物利用度， F )对乙酰氨基酚的值为88% [ 32]，它的平均分布容积（ V D )在本文描述的人类研究的志愿者中估计为88 L。这一数值几乎是估计志愿者血浆容量的25倍，表明扑热息痛浓度可能高达5000左右 μM在除红细胞外的其他体内腔室。这样的高浓度足以抑制前列环素(PGI)2）和血栓素（TXA2)分别在内皮细胞和血小板中合成[ 10.]．

实际上，扑热息痛，在3g的高单口服剂量，易受抑制PGI的PGHS催化合成2是一种有效的血管扩张剂和血小板聚集抑制剂。相比之下，TxA的合成2扑热息痛是一种有效的血管收缩剂和血小板激活剂，在四名受试者中发现扑热息痛没有明显的抑制作用。药物对PGI的相对作用2和酸2合成通常是用类前列腺素的摩尔比来估计的[ 34]．在我们的研究中，口服施用单一的3g口服扑热息痛剂量减少了平均PGI2/酸2在给药前施用约0.6的摩尔比在给药后0.4和0.2之间的值，从而移位血管大松（PGI2)/血管收缩（TxA）2)以血管扩张为代价的平衡。这种变化的后果可能是血压升高。事实上，Sudano和同事发现，冠心病患者长期服用扑热息痛的剂量较低（1 每天三次每次服用两周）比目前的研究结果血压升高幅度小[ 9]值得一提的是，在Sudano等人的研究中[ 9与我们在研究中测量的血浆中对乙酰氨基酚浓度相比，已经达到了相当低的水平。为证实先前的研究[ 9， 15.]，我们发现PGE的是排泄2提示即使高剂量3 g对乙酰氨基酚也没有显著改变肾脏PGE2生产在志愿者中。

 4．3．扑热息痛对l -精氨酸/NO通路的影响

对乙酰氨基酚对一氧化氮合酶(NOS)表达和活性的影响已被几组研究。然而，这些观察结果是矛盾的[ 17.- - - - - - 20.]．在我们的人体研究中，扑热息痛暂时增加了血浆中亚硝酸盐的浓度。由于循环中的亚硝酸盐的主要部分可能来自内皮细胞产生的NO [ 23[我们的体内结果可能表明亚乙酰氨基醇在给药后增加eNOS活性和/或eNOS表达2.5至3.5小时。然而，例如扑热胺醇诱导的硝酸盐对亚硝酸盐的替代方式也可能在志愿者中增加血浆亚硝酸盐浓度。扑热息痛不改变L-精氨酸/无途径的另外两种主要参数的血浆浓度，即L-精氨酸和ADMA。体外，扑热息痛对体外增殖的成年大鼠肝细胞中的分离的重组雌性和InOS中仅具有非常弱的抑制作用。众所周知的LiCl诱导大鼠肝细胞中Inos的表达和活性[ 31]增加iNOS活性，但并没有改变NO生物利用度。因此，对乙酰氨基酚，也没有氯化锂的影响大鼠肝细胞iNOS的相关氧化应激。

 4.4。扑热息痛对细胞色素P450通路的影响

对乙酰氨基酚被CYP家族氧化为NAPQI ( N 乙酰基 p -苯醌亚胺)，扑热息痛的有毒中间体。不饱和脂肪酸包括花生四烯酸和油酸是CYP酶的底物[ 28， 35]而且一些花生酸环氧化物是血管活性化合物[ 35]．在高浓度时(如，1000 μM），对乙酰氨基酚可以抑制CYP同种型的活性。在我们的人体研究，对乙酰氨基酚暂时增加的油酸氧化物的血浆浓度 独联体-EpOA。作为 独联体-EpOA是CYP活性的人类的标记[ 28，这一发现可能表明扑热息痛在很短的时间内增加了CYP的活性。另一种解释是等离子体增加的时间很短 独联体-epoa浓度可以是细胞外磷脂酶a的激活2(中国人民解放军2）肝PLA的活动或释放2通过扑热息痛进入血液，因为相当一部分 独联体-EpOA被发现与人血清脂酯化[ 28]．后一种解释得到了血浆中游离15( 年代 )-8- iso-PGF.2 α显示了一个类似的过程，包括尖锐的最大像 独联体-epoa在目前的人类研究中。值得一提的是15（ 年代)-8- iso-PGF.2 α和 独联体-epoA在与PLA孵育时从血清脂质并联释放2［ 28]目前，对扑热息痛对PLA的影响知之甚少2活性和/或表达。相较于消炎痛，扑热息痛（1000  μM)不抑制细胞外PLA2用放射性标记油酸酯化到 大肠杆菌膜[ 36].在小鼠中，对乙酰氨基酚在400%剂量下诱导的肝毒性 mg/kg，即约为我们人类研究的10倍，被发现与肝脏PLA分泌增加的时间依赖性模式相关2在没有肝脏COX-2的情况下加剧了这一点[ 37]．因此，暂时增加了 独联体-EpOA和15 ( 年代)-8- iso-PGF.2 α在我们的研究中观察到的可能是由于对乙酰氨基酚诱导的健康受试者的短期肝毒性。

 4.5.对乙酰氨基酚对氧化应激的影响

在人类研究中，通过测量尿中氧化应激生物标志物15( 年代 )-8- iso-PGF.2 α［ 21， 22]．如上所述，自由血浆浓度的急剧和缺点增加（ 年代 )-8- iso-PGF.2 α可能是由于PLA的临时发布2来自肝脏和/或由于细胞外PLA的激活2．在这种高剂量的情况下，扑热息痛不增加血浆总HCYS，其通常假设与氧化应激相关。鉴于扑热氨基酚的ROS-清除酚类部分（ N 乙酰基 p -氨基酚)，扑热息痛没有增强氧化应激似乎是合理的。F2-isoprostane 15 ( 年代 )-8- iso-PGF.2 α是由AA通过COX的催化作用产生的[ 38]．与乙酰水杨酸、吲哚美辛和塞来昔布相比[ 25， 39]，我们的研究表明扑热息痛(3 g)不能抑制cox依赖的15( 年代 )-8- iso-PGF.2 α在人类身上。

 结论

我们研究了镇痛解热酚类药物paracetamol对L-Arg/NO、AA/COX、CYP生化途径和氧化应激的体内外影响。在高单次口服剂量3 g时，扑热氨酚没有改变体内氧化应激。在超药理学浓度下，paracetamol也没有改变体外氧化应激，这是通过在重组heNOS孵育混合物和表达iNOS的成年大鼠肝细胞中测定的不变的亚硝酸盐-硝酸盐摩尔比得出的。的PGI2抑制高剂量的对乙酰氨基酚在本研究的健康受试者表明，在血压相对小的增加由他人[在CAD患者中观察 9很可能是由于涉及血管扩张剂增强形成的代偿机制。可能的候选物质是NO和环氧二十碳三烯酸(EETs)。在循环过程中，l -精氨酸可以通过eNOS和/或亚硝酸盐/硝酸盐的催化作用产生NO。et是由花生四烯酸在CYP家族的催化作用下产生的[ 34]．我们的结果表明，在健康受试者中，NO可以补偿高剂量扑热息痛引起的血管舒张和抗聚集性前列环素的损失(图) 8)．另外，扑热息痛即使在超药理学剂量的情况下也不会增加氧化应激。我们假设在健康人中扑热息痛诱导PGI的变化2/酸2循环NO产量的增加抵消了平衡。潜在的机制仍然难以捉摸。可能的作用机制包括内皮细胞中NO的升高、硝酸盐转化为亚硝酸盐并连续还原为NO。对于心血管疾病患者，即内皮功能不全的患者，扑热息痛仅通过NO部分抵消其不利的血管舒张/收缩作用。

在健康和疾病中，在没有(a)和有(b)给药对乙酰氨基酚(对乙酰氨基酚)的情况下，显示拟议的三种主要酶促血管收缩、血管扩张和血管内聚集作用的简化方案。在血小板中，花生四烯酸(AA)被COX-1转化为血管收缩剂和聚集剂TxA2．在内皮细胞中，AA通过COX-2转化为PGI2，L-Arg通过NOS氧化 ∙否；PGI2和 ∙NO既是血管扩张剂又是抗聚集剂。AA被CYP环氧合酶(CYP)转化为血管扩张剂环氧二十碳三烯酸(EETs)。(a)在没有包括扑热息痛在内的COX抑制剂的情况下，在健康情况下，生产TxA2，pgi.2， ∙NO和et保证了血管收缩/聚集和血管舒张/抗聚集之间的平衡。(b)扑热息痛和其他COX抑制剂改变了这种平衡，有利于COX依赖的血管收缩/聚集。为了应对这种转变， ∙不增加任何EETS形成，以补偿不平衡。在健康中，这种补偿成功，血压和血小板聚集不会改变。在内皮功能障碍相关的疾病中，如冠状动脉疾病（CAD），这种补偿不足，导致血压的中等增加[ 9]．- ，+，及 ≈平均抑制，激活和没有显着的变化，分别。箭头的厚度是定量的，但不是真正的到各专用路径和对乙酰氨基酚的贡献的比例量度。

 缩写 AA：

花生四烯酸

 ADMA：

不对称dimethylarginine

 APAP：

乙酰氨基酚（即，扑热息痛）

 参数:

精氨酸

 作为一个：

乙酰水杨酸

 CAD：

冠状动脉疾病

 CYP:

细胞色素P450

 考克斯:

环氧合酶

 特点:

环氧-二十碳三烯酸

 FPIA:

荧光偏振测定免疫测定

 GC-MS：

气相色谱分析-质谱法

 GC-MS / MS：

气相色谱 - 串联质谱

 HUVECs:

人脐静脉内皮细胞

 tHyc:

总同型半胱氨酸

 没有:

一氧化氮

 号:

一氧化氮合成酶

 以挪士:

内皮型一氧化氮合酶

 鸡蹄：

人内皮型一氧化氮合酶

 伊诺:

诱导型一氧化氮合酶

 nNOS:

神经元一氧化氮合酶

 非甾体抗炎药：

非甾体类抗炎药

 答:

前列腺素

 铂族元素2：

前列腺素E.2

 PGE-MUM：

前列腺素e大尿代谢物

 PGHS:

前列腺素H合酶

 PGI.2：

前列腺素

 pl2：

磷脂酶A.2

 质量控制:

质量控制

 ROS：

反应性氧气

 SD:

标准差

 扫描电镜:

均值的标准误差

 TID：

之三中二（一天三次）

 TXA2：

血栓素一个2．

 利益冲突

作者声明，本论文的发表不存在利益冲突。

 作者的贡献

DIMITRIOS TSIKAS构思和设计了本文中描述的所有实验。Arne Trettin和AnkeBöhmer在重组酶和肝细胞上进行体外实验，进行了生化分析，并写了纸张的部分。Maria-Theresia如此在人类研究中获得的样品进行生化分析。Irmelin Probst管理和监督肝细胞的实验。所有作者都阅读并批准了本文的最终版本。

 致谢

该研究是在部分地由德意志研究联合会（批准TS 60 / 4-1）的支持。作者感谢B.贝克曼和A. Mitschke优秀实验室援助和F.-M.Gutzki用于执行GC-MS和GC-MS / MS分析。

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