异丙酚治疗后的细胞缺氧复氧模型中差异MicroRNA分析揭示了自噬信号网络的变化

抽象的

最近的研究表明，异丙酚可以通过抑制由缺氧雷诺（H / R）诱导的过量的活性氧物质引起的自噬细胞死亡来保护细胞。建立了在存在或不存在异丙酚Postyypoxia治疗（P-POSTH）的H / R过程中，基因表达模式在H / R过程中显着改变了相关的基因。然而，这种差异的原因仍然很大程度上是未知的。MicroRNA提供基因调控的新机制。在本研究中，我们系统地分析了使用在存在或不存在Postthypoxic Photofol治疗的情况下进行H / R的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的MicroRNA表达的改变。然后使用MicroRNA微阵列进行微小RNA的基因组分析。十四个miRNA是差异表达的，并且由其中六个验证的六种实时PCR（Q-PCR）验证，其中三个基本上增加，而一个人则减少。为了通过改变的miRNA进行后续调节获得无偏见的全局观点，使用基因本体（GO）分析来分析10 miRNA的预测靶标以构建信令网络。有趣的是，已知六个鉴定的微稻草靶向与自噬相关基因。总之，我们的结果表明，通过H / R中的异丙酚Posthypoxia治疗诱导不同的miRNA表达模式，并且miRNA表达模式的改变涉及调节与众不同的自噬相关基因表达。

1.介绍

由于氧化应激增加，缺血组织或细胞的再灌注导致全身炎症反应，进而可能导致广泛的微血管功能障碍和组织/细胞损伤[1- - - - - -3.］．研究表明，血管内皮是受缺血/再灌注（I / R）损伤影响的关键位点[4- - - - - -6］．由于目前I / R损伤整体动物模型的不稳定性，这主要受多方面因素的影响体内和在体外因此，动物模型因此不能反映药物对组织/细胞损伤的确切保护机制。在体外然而，培养的内皮细胞是一种简单可控的系统，可以创建有用的I/R损伤模型[7，8］．

异丙酚是一种广泛应用的具有抗氧化能力的静脉麻醉药，对过氧化氢（H₂O₂）诱导心脏细胞和心肌缺血和再灌注（I / R）损伤的细胞凋亡[9，10］．最近的证据表明，异丙酚可能通过影响自噬相关基因的表达来抑制I/R激活的自噬细胞死亡[11- - - - - -14］．但是异丙酚对Huvecs I / R损伤的保护作用的机制尚未得到很好的研究。

microrna (mirna)是一种进化上保守的短非编码rna家族，通过降解或翻译抑制其靶mrna负调控细胞中的基因[15]近年来，通过大规模微阵列分析和遗传学方法，已经确定并证实了疾病机制与特定miRNA之间的许多关联[16］．研究概述了miRNA在心脏和肾脏在I / R损伤发展中的作用[17]然而，与异丙酚对I/R损伤的保护作用相关的miRNA在很大程度上仍不清楚。

在本研究中，我们构建了一个在体外细胞缺氧/再灌注（H/R）模型，发现异丙酚可有效降低H/R损伤。我们使用miRNA微阵列对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中miRNA表达的变化进行了系统分析在有无异丙酚的情况下进行缺氧处理。14个miRNA显示出差异表达，其中8个显著增加，而6个减少，其中6个被挑选并通过qRT PCR进一步验证。然后，基因本体（GO）对10个miRNA预测靶点的信号网络进行了分析。有趣的是，6个已鉴定的microRNA被发现靶向自噬相关基因。我们的结果显示，异丙酚缺氧后处理在H/R中诱导了不同的自噬相关miRNA表达模式，这意味着miRNA调控的细胞自噬相关基因表达可能在异丙酚缺氧后治疗H/R中发挥作用。

2.结果

2.1.异丙酚缺氧后处理对H/R损伤对细胞活力的保护作用

细胞H/R P-PostH模型的构建如图所示1对照组的细胞被认为是100%存活的。如图所示2（a），在正常条件下，异丙酚处理的细胞与对照组细胞相比没有明显变化。CCK-8测定显示异丙酚处理4小时，浓度达150μ.Mol / L没有影响细胞活力（)．H/R暴露导致细胞活力降低(图)2（b）)．H/R组细胞活力显著高于H/R组（相对于对照）。在所有的H / R + P-PostH的基团，细胞的存活力增加了与H / R仅组相比（）除150之外 μ.摩尔/升(，，，及，Arch。）表明施用过量的异丙酚没有保护作用。与之前的报告相比，结果没有显示出显着的剂量依赖性方式。这种差异可能是由于不同的实验条件（例如，缺氧室中的氧气浓度，H / R时间和我们使用的不同细胞系）。

图1

₂ ₂ ₂ μ. μ. 建立H/R和P-PostH模型。30分钟后，用正常培养箱中平衡的葡萄糖和无血清DMEM替代培养基，然后将HUVEC细胞置于一个小型封闭湿化有机玻璃腔内94% N形成的缺氧条件下，5%的公司，1％o在37°C温度下持续12小时 H缺氧后，立即冲洗培养基，将HUVEC放回正常培养箱中的维持培养基（NCS-DMEM）中培养4天 H同时，将制备好的异丙酚添加到不同浓度的培养基中（25 mol / l-150 mol / L)。

（a）

(b)

(c)

(d)

图2

μ. μ. ^▼ ^▼ 异丙酚可提高H/R致HUVECs损伤的存活率，减少细胞凋亡。(a)用不同浓度(0-150)处理正常HUVECsmol/L)，静置4 h。(b)增加异丙酚浓度(0-150)后处理细胞mol/L)，经12 h缺氧再灌注4 h。如前所述，通过CCK-8测定细胞活力。数值表示为活细胞的百分比;载体处理的细胞被认为是100%的活细胞。所代表的数据是三个独立实验中活细胞的平均百分比+ SD。＊，与对照组相比，，与H/R组比较。（c）膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶染色检测细胞凋亡。流式细胞术检测各组细胞膜联蛋白V和碘化丙啶染色情况。代表早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞百分比的直方图。数据代表三个独立实验的平均值+SD*，与对照组相比与H / R组。(d)正常组、H/R损伤组、异丙酚缺血治疗组细胞凋亡相关蛋白表达。数据为3个独立实验()．

2.2。Postypoxia治疗与H / R诱导凋亡和自噬治疗的抑制作用

为了证实P-PostH对细胞凋亡的抑制效果，将HUVEC用膜联蛋白V-FITC和碘化丙锭染色，然后通过流式细胞术分析。早期凋亡在控制和H的百分比/ R基团是和，分别（相对于对照）。早期凋亡细胞的数量明显减少，（，，，)当细胞被不同浓度的异丙酚（25,50,100,150）处理时 μ.摩尔/升）分别与H / R组相比（与H / R组）在图中2 (c)．然后我们用Western blotting (WB)检测凋亡相关蛋白。H/R处理后，凋亡蛋白Bax上调，PARP切割，抗凋亡蛋白Bcl-2下调(图)2 (d))．然而，这些蛋白质的表达是逆转的，并且在除缺氧治疗以剂量依赖性方式后，预防PARP切割后，除了150 μ.mol / l，这与活力测定和膜蛋白V-fitc和pi染色的结果一致（图2 (d))．

接下来，我们调查了H / R诱导的HUVEC诱导的自噬是否可以通过异丙酚调节。H / R促进LC3-I至LC3-II的有效转变，除150外，通过异丙酚治疗预防 μ.mol/L，对照细胞在H/R损伤或常氧过程中受到DMSO(图)3.(一),3.(b)3.(c))。免疫荧光观察加强了WB结果。HR诱导了大量LC3斑点和不规则形状的线粒体(指示凋亡)，而异丙酚处理后细胞可以恢复到正常状态(图)3.(d))。

图3

μ. μ. μ. μ. 异丙酚抑制H / R诱导的自体吞噬。在正常细胞中，测定（a）中LC3的表达，H / R损伤的细胞，和异丙酚posthypoxia治疗细胞（25-150 （b）在对照细胞和异丙酚常氧（25-150）处理的细胞中测定LC3的表达 mol / L)。(c)检测正常细胞组、H/R损伤细胞组、DMSO缺血处理组(25 ~ 150)LC3的表达mol / L)。数据为3个独立实验()．（d）通过抗LC3，抗LC3和抗-TIM23在正常细胞，H / R损伤细胞和异丙酚Postyypoxia处理细胞中探测自噬体和线粒体。酒吧，20 M

总之，这些数据表明异丙酚可以有效地抑制H/R诱导的HUVECs凋亡和自噬。

2.3. miRNA在P-Post+H/R中的表达与仅在H/R中的表达不同

为了研究可能对HUVECs H/R损伤起保护作用的潜在miRNA，我们通过miRNA微阵列分析确定了HUVECs中的miRNA表达谱。我们首先评估了P-PostH和H/R组中的miRNA表达谱。数百个miRNA的表达谱确定在P-P之间受调节ost和H/R将样本分为生物学上可解释的组。其中，P-PostH组有8个miRNA被鉴定为上调两倍以上，而H/R组有8个miRNA被下调两倍以上(）（数字4).6从这些筛选出的miRNA中选择4个进行qRT PCR验证，其中4个经验证在异丙酚组和HR组之间存在显著差异()．其余两种表达趋势与阵列结果一致，但无统计学意义。如图所示5，HSA-MIR-30B，HSA-MIR-20B，HSA-MIR-374B，HSA-MIR-374B的水平，在异丙酚处理基团中，仅用HR组进行，而HSA-Let-7e和Hsa-mir-15b显示了一种相反的表达模式，其与微阵列杂交的结果一致。

（a）

(b)

图4

miRNA谱从H / R组区分异丙酚组。的14种miRNA的表达被改变显著的（a）分级聚类（倍数变化> 2，，FDR的丙泊酚和HR组> 0.05）。颜色表示的信号的强度（)．(b)散点图中红色点代表HR组中表达量较高的mirna，绿色点代表异丙酚组中表达量较高的mirna，黑色点则无明显变化。

2.4。揭示了差异表达的miRNA的潜在自噬相关目标

计算算法显示，hsa-miR-20b、hsa-miR-30b、hsa-miR-96和hsa-miR-196a可能分别靶向自噬相关基因ULK1、Becline-1、ATG7和Rictor。Hsa-miR-15b或hsa-miR-374b可能靶向抗凋亡或增殖相关基因。Hsa-miR-7e可能靶向线粒体相关基因(见表)1)．所有往复式表达的miRNA和蛋白质被两种算法预测（表1)MTOR抑制直接参与自噬诱导[18，19］．我们发现，在异丙酚对H/R损伤的保护作用中，Hsa-miR-20b、hsa-miR-196和hsa-miR-15b可能分别是自噬、mTOR和抗凋亡通路的关键调控因子。我们之前预测的与自噬和mTOR通路相关的miRNA-target基因相互作用网络如图所示6．上调的miRNA HSA-miR-20b显示出自噬途径时的10个靶mRNA，而HSA-MIR-30B也与自噬途径有关。预计HSA-MIR-96和HSA-MIR-196A靶向MTOR途径相关基因（图6)．


microrna的	目标符号	目标公用名	米兰达	TargetScan	HR表达水平
microrna的	目标符号	目标公用名	米兰达	TargetScan	microrna的

HSA-MIR-30B	BECN1	Beclin 1，自噬相关	是的	是的
HSA-MIR-30B	ATG5	自噬相关5	是的	是的
HSA-MIR-20B	ULK1	Unc-51类似自噬激活激酶1	是的	是的
HSA-MIR-20B	MAP3K14	丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶14	是的	是的
hsa - mir - 196 a	RICTOR	rptor独立的mtor伴侣	是的	是的
hsa - mir - 96	ATG7	相关7.	是的	是的
HSA-MIR-15B	BCL2	b细胞慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤2	是的	是的
hsa-miR-374b	VEGFA	血管内皮生长因子a	是的	是的
hsa-let-7e	ATP2A2	atp酶，Ca++转运，心肌，慢抽动2	是的	是的

3.讨论

H/R相关的细胞损伤可能通过形成活性氧（ROS）参与氧化应激诱导的损伤。作为有效的氧化和还原剂，ROS通过脂质过氧化和还原酶抑制直接损伤内皮细胞膜[20.］．ROS还上调细胞粘附分子的表达，诱导细胞因子的转录，进而刺激中性粒细胞的活化和趋化，导致内皮细胞的死亡[21］．

异丙酚在结构上类似于内源性抗氧化剂维生素E，具有抗氧化活性[22].它对氧化应激介导的细胞损伤具有保护作用[23］．异丙酚可防止活性氧(ROS)，如过氧化氢(H₂O₂)诱导内皮细胞和心肌细胞的细胞损伤在体外［24，25和缺血/再灌注损伤的心脏体内［10］．

迄今为止，据报道，只有几项关于通过MicroRNA调节的少数研究通过MicroRNA的细胞保护。未进行P-POSTH处理的H / R中的关键节点MicroRNA的大规模和系统分析。与先前的结果一致，我们的研究还发现异丙酚对Huvecs的H / R损伤的保护作用。为了揭示参与此过程中涉及的关键MicroRNA，我们首先在Huvec细胞的异丙酚后处理H / R损伤中评估了miRNA表达谱，以揭示MiRNA在保护作用中的潜在作用。我们发现一组不同表达的miRNA，与H / R基团相比，在异丙酚后处理组中下调和8个上调的miRNA。HSA-MIR-30B，HSA-MIR-20B，HSA-MIR-15B，HSA-Let-7E，HSA-MIR-374B和HSA-MIR-196A的QRT-PCR进一步验证了微阵列结果的可靠性。

为了深入了解mirna的功能，我们将GO term和KEGG pathway注释应用于它们的目标基因库。KEGG注释显示，与H/R组相比，P-PostH组的自噬和mTOR信号通路发生显著变化。进一步研究这两个通路的mirna基因网络，发现hsa-miR-20、hsa-miR-30b和hsa-miR-196a可能分别是自噬和mTOR通路的关键调控因子。

自噬是一种进化保守过程，涉及长寿命或受损蛋白和细胞器的降解[26- - - - - -28］．先前的研究表明，异丙酚保护心肌I / R损伤引起的自噬细胞死亡[14]Beclin-1和ATG5也被证明是hsa-miR-30b的靶基因[29，我们的研究证实了这一点。需要进一步的实验来探究其详细的机理。我们还发现了与H/R组相比，P-PostH中其他可能调节MAPK信号通路和凋亡的差异mirna，如hsa-miR-20b和hsa-miR-15b [30.- - - - - -33］．

综上所述，我们的研究首次系统地研究了P-PostH处理H/R HUVEC细胞的microRNA谱，揭示了一些在P-PostH /R诱导的细胞损伤中差异表达的mirna。异丙酚对H/R损伤的保护作用可能与它们在自噬和抗凋亡通路中的调控作用有关。hsa-miR-30b、hsa-miR-20b低表达可能导致自噬相关蛋白异常上调，诱导过度自噬，导致细胞死亡。这一机制的证实和阐明还有待进一步研究。目前的研究结果也为未来的研究指明了几个令人兴奋的方向。我们确定的每一对可能的mirna -基因对都是一项重要研究的有力候选，以确定特定mirna -基因相互作用的存在，从而创建异丙酚影响的更详细的图像。

4.材料和方法

4．1.试剂和抗体

异丙酚购自Sigma Chemical，以排除脂乳液的影响。试剂包括Dulbecco 's modified Eagle 's培养基(DMEM)、新生小牛血清(NCS)、青霉素、链霉素、胰蛋白酶- edta (GIBCO Laboratories, Grand Island, New York, USA)、二甲亚胺(DMSO)、Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒、CCK-8细胞计数试剂盒。异丙酚溶解在DMSO中，并进一步稀释在磷酸盐缓冲盐水(PBS)。最终DMSO浓度为0.1%，不影响细胞功能或检测系统。本研究使用的一抗为抗- actin抗体(Santa Cruz, sc-47778)、抗lc3b多克隆抗体(Sigma, L7543)、抗lc3多克隆抗体(MBL, PM036)、抗tom20 (FL-145) (Santa Cruz, sc-11415)。

4.2.HUVEC细胞培养

根据Jaffe等人所描述的改良技术，通过胶原酶消化从新鲜人脐带静脉中分离HUVECs。34］．简单地说，HUVECs在37°C 95% O条件下培养₂和5%的公司₂DMEM的潮湿气氛补充有20％胎牛血清，100 μ.g/mL streptomycin, and 100 IU/mL penicillin. The HUVECs were subcultured nine to ten days later.

4.3。建设A.体外细胞异丙酚痘痘治疗H / R模型

对于缺氧，在30分钟内用葡萄糖和无血清DMEM替换培养基，然后将HUVEC细胞置于缺氧条件下，缺氧条件由一个充满94%N的小型封闭增湿有机玻璃室创建₂, 5%的公司₂，1％o₂37°C, 12小时。缺氧后洗掉培养基，将HUVECs返回到含有5% CO的正常培养箱中的维持培养基(NCS-DMEM)中₂和95％N₂四 H同时，将制备好的异丙酚添加到不同浓度的培养基中（25 μ.mol / l-150 μ.摩尔/升）。异丙酚的临床相关血药浓度约为17-62 μ.摩尔/ L的维持满意的麻醉[11］．大剂量注射异丙酚血药浓度可达56μ.mol / l。因此，我们考虑25-100 μ.Mol / L作为临床相关浓度和增加的异丙酚浓度的范围设计为25,50,100和150 μ.摩尔/升，分别为（图1)．

4.4。细胞活力测定

使用CCK-8试剂盒评估细胞活力。细胞被镀在最外层在96孔板中每孔细胞数，并在缺氧处理后用H/R和不同浓度的异丙酚处理。每种浓度的异丙酚（0-150 μ.mol / l）在6个孔中重复。同时，向非H / R细胞中增加浓度的异丙酚4小时。在辐射暴露后，用PBS洗涤细胞两次，并与1mL培养基孵育，其含有10％CCK-8溶液，在37℃下进行2小时。通过在450nm处通过多模微相液读取器测量吸光度。使用公式计算细胞活力（％）．如:曝光或假曝光皿中含有上清液的孔的吸光度;Ac:含有正常对照上清液的孔的吸光度;Ab:含10% CCK-8溶液的培养孔的吸光度。

4.5。检测细胞凋亡

为了定量凋亡，HUVEC用膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶染色。制备的细胞用冷PBS洗涤两次，然后在500℃下再悬浮 mL结合缓冲液。5微升膜联蛋白V-FITC和5 毫升碘化丙啶（1 然后将其加入FACSCalibur流式细胞仪分析。早期凋亡细胞膜联蛋白V阳性，碘化丙啶阴性，而晚期凋亡死亡细胞膜联蛋白V和碘化丙啶标记均较高。

4.6。西方墨点法

细胞凋亡相关蛋白和LC3的表达，用Western blot检测。The whole cell lysates were prepared in RIPA buffer (50 mM Tris HCl, pH 8, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.1% SDS, and 1% Triton X-100 plus proteinase inhibitors; Sigma). Protein concentration was determined by Bradford assay, and samples containing 30 ug were separated by 12% SDS-PAGE. Proteins were transferred to nitrocellulose membranes. After membranes were blocked in 5% nonfat milk in 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, and 0.05% Tween 20 for 1 hr at room temperature, the membranes were incubated overnight at 4°C with different primary monoclonal antibodies;β-actin抗体作为负载对照。然后将膜与与过氧化辣根结合的二抗在室温下孵育1小时，并暴露于增强的化学发光试剂中。采用密度分析量化信号强度。

4.7。免疫荧光

细胞生长至70％汇合在盖玻片上。After treatment, cells were washed twice with PBS (Shanghai Sangon Biotech) and fixed with freshly prepared 4% paraformaldehyde at 37°C for 15 min. Antigen accessibility was increased by treatment with 0.1% Triton X-100 (Shanghai Sangon Biotech). After blocking with 1% BSA, cells were incubated with primary antibodies for 1 h at room temperature, and, after washing with PBS, stained with a secondary antibody for a further 50 min at room temperature. Cell images were captured with a TCS SPF5 II Leica confocal microscope.

4.8.RNA提取和miRNA微阵列分析

使用Trizol试剂(Invitrogen公司)从HUVECs的H/R组和P-PostH组中提取含有小RNA的总RNA，并按照制造商的方案用mirVana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX, USA)纯化。用分光光度计(NanoDrop ND-1000)从OD260/280读数中测定RNA的纯度和浓度。用1%甲醛变性凝胶电泳检测RNA的完整性。使用安捷伦miRNA阵列进行miRNA谱分析。安捷伦阵列设计为每片8个相同的阵列(8 × 60 K格式)，每个阵列包含探针询问1887个人类成熟mirna和121个人类病毒相关mirna，均来自miRBase R18.0。每个miRNA用探针重复检测30次。

微阵列实验按照制造商的说明进行。简言之，将种miRNA使用Agilent miRNA标记试剂进行标记。Total RNA (100 ng) was dephosphorylated and ligated with pCp-Cy3, the labeled RNA was purified and hybridized to miRNA arrays. Images were scanned with the Agilent microarray scanner (Agilent), gridded, and analyzed using Agilent feature extraction software version 10.10.

4.9.通过qRT PCR验证选定的微阵列数据

如前所述，通过qRT PCR测定H/R和P-PostH水平之间差异表达的miRNA[35，36］．简单地说，用mirVana miRNA Isolation Kit (Ambion)从HUVECs中分离rna。采用mirVana定量实时聚合酶链反应miRNA检测试剂盒(Ambion)的方法，对50 ng总RNA生成的cDNA进行miRNA的QRT-PCR。作为内部控制，U6被用于miRNAs模板的标准化。荧光信号归一化为内部参考，阈值循环(Ct)设置在聚合酶链反应的指数阶段。通过比较每个目标聚合酶链反应的循环时间来计算相对基因表达量。目的聚合酶链反应Ct值减去U6 Ct值归一化，得到价值。处理之间的相对表达水平，然后使用以下公式计算：使用相对基因的方法与U6 rRNA内源对照归一化。RT-PCR使用的引物如表所示2．


基因	退火温度°C	基因底漆数量（5'3′)	加入号码

U6	60.	F：5'CTCGCTTCGGCAGCACATATACT3'	nr_004394.1.
		R: 5 'cgaatttgcgtgtcatccttgcg3”
HSA-MIR-30B	60.	F: 5 'cgctgtaaacatcctacactca3 '	MIMAT0000420
		R：5'gcagggtccgaggtatc3'
HSA-MIR-15B-5P	60.	F:5′ATGGTTCGTGGGTAGCAGCACATGGTTTACA3′	MIMAT0000417
		R：5'gcagggtccgaggtatc3'
mir - 196 - 5 - p	60.	F：5'ATGGTTCGTGGGTAGGTAGTTTCATGTTGTTGG3'	MIMAT0000226
		R：5'gcagggtccgaggtatc3'
hsa - mir - 374 b - 5 - p	60.	F:5′cgtggataatacaacctagtg3′	MIMAT0004955
		R: 5 'ctcaactggtgtcgtgga3”
HSA-MIR-20B-5P	60.	F：5'ATGGTTCGTGGGCAAAGTGCTCATAGTGCAGGTAG3'	MIMAT0001413
		R: 5 'ctcaactggtgtcgtgga3”
hsa-let-7e	60.	F：5'CGCTGAGGTAGGGGTTGTA3'	MIMAT0000066
		R：5'gcagggtccgaggtatc3'

F：前底漆;R：反向底漆。
特定miRNA的miRNA的数目和序列可以从miRBase序列来获得。

4.10。靶基因预测

miRNA靶位点预测由于miRNA与mRNA靶位点之间的碱基配对规则、靶位点3'UTR内结合序列的定位以及靶位点相关基因组内结合序列的保守性，可以通过计算算法进行miRNA靶位点预测。在我们的研究中，TargetScan v5.1 (http://www.targetscan.org/)和米兰达v5 (http://www.mirbase.org/)被认为是某种miRNA的潜在靶点。

4.11。差异表达mirna的生物信息学分析

基因本体论（GO）分析是为了组织基因导入分级类别和揭开生物过程，细胞组分和分子功能的基础上，所述miRNA基因调控网络应用。我们把差异表达的miRNA分为两组（H / R上调和H / R下调），并映射这些两组到GO数据库的每个节点。对应于每个节点的miRNA通过GSEABase包将R统计平台上计数（http://www.r-project.org/)．我们还使用基于基因和基因组（Kegg）途径数据库的京都百科全书，使用Genmapp V2.1分析了潜在的靶基因相关途径。富集-计算各途径中靶基因的值。随后，我们整合了基因和mirna之间的调控相互作用。我们同时分析了两种不同的相互作用:(1)KEGG数据库中描述基因间关系的数据，包括酶-酶关系、蛋白-蛋白相互作用和基因表达相互作用(KEGGSOAP软件包(http://www.bioconductor.org/packages/2.4/bioc/html/KEGGSOAP.html））和（2）蛋白 - 蛋白相互作用通过验证高通量实验（在MIPS哺乳动物蛋白质 - 蛋白质相互作用数据库：http://mips.helmholtz-muenchen.de/proj/ppi/)．然后，我们将结果整合到基因网络中，并使用Medusa 21软件(数据未显示)显示图像。最后，我们利用miRNA的预测靶点构建了特定的通路相关网络，根据miRNA的程度识别可能调节通路的关键miRNA。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

国家自然科学基金资助项目(no . 81270916, no . 31301104);广东医学院科研启动基金资助项目(no . XB1342, no . 701B01206)。

参考文献

H. K.Eltzschig和C. D. D. Contard，“血管缺血和再灌注损伤”英国医学公告，卷。70，pp。71-86,2004。浏览：出版商的网站|谷歌学术
“异氟醚预处理和异丙酚后处理的协同作用减少心肌再灌注损伤，”黄振中，钟学军，M. G. Irwin等，“异氟醚预处理和异丙酚后处理的协同作用减少心肌再灌注损伤，”临床科学号，第121卷。2，页57-69,2011。浏览：出版商的网站|谷歌学术
G.Tan和M.G.Irwin，“非麻醉师使用异丙酚的最新进展，”F1000医学报告，第2卷，第1号，第79条，2010年。浏览：出版商的网站|谷歌学术
S.F.Hughes、M.J.Cotter、S.A.Evans、K.P.Jones和R.A.Adams，“缺血再灌注损伤期间白细胞在血管内皮损伤中的作用，”不列颠生物医学科学杂志，卷。63，否。4，pp。166-170,2006。浏览：谷歌学术
V. V. Shuvaev和V.R.Muzykantov，“血管内皮中的反应性氧物种的靶向调节”，控制释放杂志，第153卷，第153期1, pp. 56-63, 2011。浏览：出版商的网站|谷歌学术
“体外循环时大剂量异丙酚降低冠状动脉手术患者心肌损伤的生化指标:与异氟醚的比较，”麻醉与镇痛，第103卷，第3期，第527-5322006页。浏览：出版商的网站|谷歌学术
T. Radovits，J.Zotkina，L. N.Lin，M. Karck和G.Szabó，缺氧雷诺治疗后的内皮功能障碍：体外模型工作吗？“血管药理学第51卷第1期1，第37-43页，2009。浏览：出版商的网站|谷歌学术
S.Dohgu，T.Nishioku，N.Sumi等，“环孢菌素A对体外缺氧-复氧损伤后脑微血管内皮细胞屏障功能的不利影响，”细胞与分子神经生物学，卷。27，不。7，PP。889-899,2007。浏览：出版商的网站|谷歌学术
B.王，J.Shravah，H. Luo，K.Raedschelders，D. D. Y.陈和D.M.Ansley，“欧安州”通过AKT激活和Bcl-2上调，对心脏H9C2细胞的过氧化氢诱导损伤免受过氧化氢诱导的损伤，“生物化学与生物物理研究通讯，卷。389，没有。1，第105-111，2009。浏览：出版商的网站|谷歌学术
Y. C. Jin, W. Kim, Y. M. Ha等，“异丙酚限制大鼠心肌缺血和再灌注损伤，与体内凋亡细胞死亡的相关减少，”血管药理学，卷。50，不。1-2，第71-77,2009。浏览：出版商的网站|谷歌学术
D. R.崔L.王，W.江，A. H.齐，问：H.周，和X张良军，“异丙酚防止脑缺血引发的自噬激活和细胞死亡在大鼠海马通过NF-κB的/ p53信号通路，”神经科学，卷。246，第117-132，2013。浏览：谷歌学术
D.Cui，L.Wang，A.Qi，Q.Zhou，X.Zhang和W.Jiang，“异丙酚预防PC12细胞缺氧和葡萄糖剥夺后的自噬细胞死亡以及大鼠脑缺血再灌注损伤，”《公共科学图书馆•综合》，卷。7，不。4，物品ID E35324,2012。浏览：出版商的网站|谷歌学术
S.Lee，K.Kim，Y.H.Kim等人，“异丙酚在缺氧/复氧诱导的H9c2大鼠心肌成肌细胞凋亡中的预防作用，”分子医学报告，第4卷，第4期。2，第351-356，2011。浏览：出版商的网站|谷歌学术
Noh，I.W.Shin，J.H.Hah，Y.S.Hah，S.M.Baek和D.R.Kim，“异丙酚保护大鼠缺血/再灌注损伤诱导的自噬细胞死亡，”分子和细胞，卷。30，没有。5，pp。455-460，2010。浏览：出版商的网站|谷歌学术
V. Ambros，“蝇类和蠕虫的MicroRNA途径:生长、死亡、脂肪、压力和时间”细胞，第113卷，第113期。6，页673-676,2003。浏览：出版商的网站|谷歌学术
K. K. H. Farh, A. Grimson, C. Jan等人，“生物化学:哺乳动物microrna对mRNA抑制和进化的广泛影响”，科学，第310卷，第5755号，第1817-18212005页。浏览：出版商的网站|谷歌学术
Yin，X.Wang和R.C.Kukreja，“热休克诱导的内源性microRNA减少小鼠缺血再灌注后的心肌梗死，”费用字母，第582卷，第2期。30，页4137-4142,2008。浏览：出版商的网站|谷歌学术
J. J. Jaboin, E. T. Shinohara, L. Moretti, E. S. Yang, J. M. Kaminski, B. Lu，“mTOR抑制在增强辐射诱导的自噬中的作用”，癌症研究与治疗技术，第6卷，第5期，第443-447页，2007年。浏览：谷歌学术
B.Ravikumar，C.Vacher，Z.Berger等人，“在亨廷顿病的苍蝇和小鼠模型中，抑制mTOR诱导自噬并降低多聚谷氨酰胺扩张的毒性，”自然遗传学第36卷第2期6，页585-595,2004。浏览：出版商的网站|谷歌学术
Sun H.Y.N.P.Wang，F.Kerendi等人，“缺氧后处理通过抑制ROS生成和细胞内Ca2+超载减少心肌细胞损失，”美国生理心脏杂志杂志和循环生理学，卷。288，没有。4，PP。H1900-H1908,2005。浏览：出版商的网站|谷歌学术
S. Grotti和T. Gori， "内皮，缺血和氧自由基好的一面"临床血液流变学和微循环第39卷第3期1-4页，197 - 203,2008。浏览：出版商的网站|谷歌学术
I.Gülçin，H.A.Alici和M.CESUR，“测定体外抗氧化剂和异丙酚的激进清除活性”，“化学和药品公报，卷。53，没有。3，pp。281-285,2005。浏览：出版商的网站|谷歌学术
I. Vasileiou, T. Xanthos, E. Koudouna等，“异丙酚的非麻醉效果综述”，欧洲药理学杂志号，第605卷1-3，第1-8页，2009。浏览：出版商的网站|谷歌学术
“异丙酚对过氧化氢介导的心肌细胞氧化应激和凋亡的抑制作用涉及血红素加氧酶-1”，欧洲麻醉学杂志，卷。25，不。5，第395-402，2008。浏览：出版商的网站|谷歌学术
B.Wang，T.Luo，D.Chen和D.M.Ansley，“异丙酚减少过氧化氢刺激的人脐静脉内皮细胞的凋亡并上调内皮型一氧化氮合酶蛋白表达，”麻醉与镇痛，卷。105，没有。4，pp。1027-1033，2007。浏览：出版商的网站|谷歌学术
N. Mizushima，“自噬的生理功能”微生物学和免疫学的当前主题，卷。335，没有。1，第71-84，2009年。浏览：出版商的网站|谷歌学术
L.Liu，D.Feng，G.Chen等人，“线粒体外膜蛋白FUNDC1介导哺乳动物细胞中缺氧诱导的有丝分裂吞噬。”自然细胞生物学，卷。14，不。2，第177-185，2012。浏览：出版商的网站|谷歌学术
冯德峰，刘磊，朱勇，陈青，“线粒体自噬的分子信号及其生理意义”，实验细胞研究，第319卷，第1697-1705页，2013年。浏览：出版商的网站|谷歌学术
W.潘，钟Y.，C. Cheng等人，“MIR-30调节的自噬介导血管紧张素II引起的心肌肥厚，”《公共科学图书馆•综合》，第8卷，文章编号e53950, 2013。浏览：出版商的网站|谷歌学术
S. Cascio，A.D'Antrea，R.Ferla等，“MiR-20B通过靶向HIF-1来调节VEGF表达α.和MCF-7乳腺癌细胞中的STAT3，“细胞生理学杂志第224期1，页242 - 249,2010。浏览：出版商的网站|谷歌学术
Z. Lei，B. Li，Z. Yang等，“HIF-1的调节α.和VEGF通过miR-20b调节肿瘤细胞适应氧浓度的变化。”《公共科学图书馆•综合》，第4卷，第4期。10、Article ID e7629, 2009。浏览：出版商的网站|谷歌学术
F.安，龚B.，H. Wang等人，“的miR-15B和miR-16调节TNF通过BCL-2介导的肝细胞凋亡在急性肝功能衰竭”凋亡，第十七卷，第二期7，第702-716页，2012。浏览：出版商的网站|谷歌学术
“miR-15b和miR-16通过靶向BCL2调控人胃癌细胞的多药耐药，”国际癌症杂志号，第123卷2，第372-379页，2008。浏览：出版商的网站|谷歌学术
E.A.Jaffe、R.L.Nachman、C.G.Becker和C.R.Minick，“从脐静脉中提取的人类内皮细胞的培养。通过形态学和免疫学标准进行鉴定，”临床调查杂志号，第52卷。11，第2745-2756页，1973。浏览：谷歌学术
Ji，Y.Cheng，J.Yue等人，“MicroRNA表达特征和反义介导的耗竭揭示了MicroRNA在血管新生内膜病变形成中的重要作用。”流通研究，卷。100，没有。11，PP。1579-1588,2007。浏览：出版商的网站|谷歌学术
林毅仁，刘晓阳，程毅仁，杨俊杰，霍耀荣，张春春，“微RNA参与过氧化氢介导的血管平滑肌细胞基因调控和细胞损伤反应，”生物化学杂志，卷。284，没有。12，PP。7903-7913,2009。浏览：出版商的网站|谷歌学术

氧化医学和细胞寿命

氧化应激介导的再灌注损伤：机制与治疗