OMCL 氧化医学和细胞寿命 1942 - 0994 1942 - 0900 Hindawi出版公司 378484年 10.1155 / 2013/378484 378484年 研究文章 差微rna在细胞缺氧复氧模型分析在Posthypoxic异丙酚治疗显示改变自噬信号网络 程ydF4y2Ba 卓 1 胡 哲 1 陆 Zhiqi 1 蔡 Shuyun 1 顾 庐山逍夏 1 壮族 不知 1 阮 志华 1 夏 Zhengyuan 2 欧文 迈克尔。G。 2 冯 杜 3 张 Liangqing 1 雪 Mengzhou 1 美国麻醉学 广东医学院附属医院 524001年湛江 中国 gdmc.edu.cn 2 麻醉学研究实验室 美国麻醉学 香港大学 香港 hku.hk 3 广东省重点实验室的与年龄有关的Cardiac-Cerebral血管疾病 神经学部门 广东医学院附属医院 524001年湛江 中国 gdmc.edu.cn 2013年 22 12 2013年 2013年 10 09年 2013年 16 11 2013年 22 11 2013年 2013年 版权©2013卓陈等。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

最近的研究表明,异丙酚可能通过抑制自噬细胞死亡引起的过度保护细胞活性氧引起的缺氧复氧(H / R)。是建立基因表达模式包括autophagy-related显著改变过程中H / R基因的存在与否,异丙酚posthypoxia治疗(P-PostH)。然而,这些差异的原因在很大程度上仍未知。小分子核糖核酸提供一个新颖的基因调控机制。在目前的研究中,我们系统地分析了改变微rna表达用人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)受到H / R的存在与否posthypoxic异丙酚治疗。小分子核糖核酸的全基因组分析然后使用微阵列进行。十四和六的microrna表达不同的验证的定量实时PCR (Q-PCR)的三个显著增加,而降低。获得一个公正的全球视角改变microrna在后续监管,预测分析了十个microrna的目标使用基因本体论(去)分析构建信号网络。有趣的是,六个确定小分子核糖核酸autophagy-related已知目标基因。总之,我们的研究结果显示,不同的microrna的表达模式是由异丙酚诱导posthypoxia治疗H / R和microrna的表达模式的改变与调节独特autophagy-related基因表达。

 1。介绍

由于氧化应激增加,缺血性组织或细胞的再灌注导致系统性炎症反应进而可能导致广泛的微血管功能障碍和组织/细胞损伤( 1- - - - - - 3]。研究表明,血管内皮是一个至关重要的网站,影响缺血/再灌注(I / R)损伤( 4- - - - - - 6]。由于不稳定当前的总体I / R损伤的动物模型在很大程度上是受到多方面因素的影响 在活的有机体内和 在体外动物模型,因此不能反映药物的具体防护机制组织/细胞损伤。 在体外培养的内皮细胞,然而,是简单的和控制系统,可以创建有用的I / R损伤模型( 7, 8]。

异丙酚是一种广泛使用静脉麻醉具有抗氧化能力。它显示了保护角色在过氧化氢(H2O2全身的细胞凋亡在心肌细胞和心肌缺血再灌注(I / R)损伤大鼠( 9, 10]。最近的证据表明,异丙酚可以抑制I / R激活自噬细胞死亡通过影响autophagy-related基因的表达 11- - - - - - 14]。的机制异丙酚在HUVECs I / R损伤的保护作用并没有得到充分的研究。

小分子核糖核酸(microrna)是一种进化保守的家庭短非编码rna,负调节基因在细胞通过降解或翻译抑制目标mrna ( 15]。近年来,许多疾病之间的关联机制和具体的microrna已确定和证实使用大规模microarrary分析和遗传方法( 16]。研究概述的microrna的角色发展的I / R损伤在心脏和肾脏 17]。然而,microrna与异丙酚对I / R损伤的保护作用在很大程度上仍未知。

在目前的研究中,我们构造了一个 在体外细胞缺氧/再灌注(H / R)模型,发现异丙酚有效减少H / R损伤。我们进行了系统性的分析,改变使用microrna的microrna的表达人类脐静脉内皮细胞微阵列(HUVECs)治疗H / R在异丙酚的存在与否posthypoxia治疗。14个microrna被证明是差异表达的八个大大增加,而六人,六人,进一步减少验证中存在。然后,基因本体论(去)分析了构建信号网络的预测目标十microrna。有趣的是,六个确定小分子核糖核酸的发现目标autophagy-related基因。我们的研究结果显示,不同autophagy-associated microrna的表达模式是由异丙酚诱导posthypoxia治疗H / R,这其中牵扯到的微分autophagy-related microrna基因表达调控可能发挥作用在异丙酚posthypoxia治疗H / R。

 2。结果 2.1。保护作用的异丙酚Posthypoxia治疗H / R损伤细胞的可行性

建设的细胞H / R P-PostH模型如图 1。对照组的细胞被认为是可行的100%。如图 2(一个),没有明显改变propofol-treated细胞相比,控制细胞在正常情况下。CCK-8试验表明,异丙酚治疗4 h浓度高达150 μmol / L不影响细胞的生存能力( P > 0.05 )。接触细胞H / R导致细胞生存能力的降低(图 2 (b))。的异常细胞H / R组 55.9 ± 1。8 % ( P < 0.01 与控制)。在所有的组H / R + P-PostH,增加细胞的可行性与H / R组( P < 0.05 除了150 μmol / L ( 68.1 ± 5.3 , 69.4 ± 3所示。6 , 72.2 ± 5.7 , 62.5 ± 6.7 % 、职责)表明过量的异丙酚没有保护作用。结果并没有显示出明显的剂量依赖性的方式与以前的报告。这种差异可能是由于不同的实验条件(例如,氧气的浓度在低氧室,H / R时间和不同的细胞系,我们使用)。

建立H / R和P-PostH模型。文化媒体取而代之的是葡萄糖和无血清DMEM平衡在正常孵化器在30分钟内,这些HUVEC细胞被放置在缺氧条件是由一个小封闭湿润有机玻璃室充满94% N2,5%的公司2,1%的人啊2在37°C 12 h。缺氧后,媒体立即被冲洗掉,和HUVECs回到维护媒介(NCS-DMEM)在正常孵化器为4 h。同时,准备异丙酚添加到介质不同浓度(25 μmol / l - 150 μmol / L)。

异丙酚提高生存能力和降低H / R损伤诱导的细胞凋亡在HUVECs。(一)正常HUVECs处理不同浓度(0 - 150 μmol / L)的异丙酚4 h。细胞(b)与异丙酚浓度增加后置条件(0 - 150 μmol / L)后12 h(缺氧和再灌注4 h。细胞生存能力是由CCK-8化验,如前所述。值表示为可行的细胞的百分比;vehicle-treated细胞被认为是可行的100%。数据表示的意思是可行的细胞的百分比+ SD三个独立的实验。* P < 0.00 1 与对照组相比,▼ P < 0.05 ,与之相比,H / R组。与膜联蛋白(c)检测细胞凋亡V-FITC和propidium碘染色。每组细胞的膜联蛋白V和propidium碘染色流式细胞仪测定。直方图代表早期凋亡细胞的比例和晚期凋亡细胞。数据代表三个独立实验的平均+ SD。* P < 0.0 1 与对照组相比,和▼ P < 0.05 与H / R组。(d)的表达apoptosis-related蛋白质在正常组,H / R损伤组和异丙酚posthypoxia治疗组。数据代表世行从3独立实验( n = 2 )。

 2.2。抑制作用的Posthypoxia异丙酚治疗引起的细胞凋亡和自噬H / R

确认P-PostH对细胞凋亡的抑制作用,HUVECs是沾膜联蛋白V-FITC propidium碘,然后通过流式细胞术分析。早期凋亡的比例控制和H / R组 8 + 4.4 % 和 36.6 + 2.4 % 分别为( P < 0.01 与控制)。有一个明显的早期凋亡细胞的数量减少,( 25.6 + 2.8 , 22.6 + 2.6 , 21 + 3所示。2 , 32.2 + 2.5 % 当细胞与不同浓度的异丙酚治疗(25、50、100、150 μmol / L)分别与H / R组( P < 0.05 与H / R组)在图 2 (c)。然后我们调查了apoptosis-related蛋白质利用免疫印迹(WB)。凋亡蛋白伯灵顿是调节和PARP裂解当抗凋亡蛋白bcl - 2抑制在H / R治疗(图 2 (d))。然而,这些蛋白质的表达是逆转,PARP乳沟是预防缺氧治疗后在加入异丙酚剂量依赖性的方式除了150 μmol / L,协议与可行性分析的结果和膜联蛋白V-FITC和PI染色(图 2 (d))。

接下来,我们研究了H / R-induced自噬在HUVECs是否可以由异丙酚。H / R提升的有效过渡LC3-I LC3-II,除了150年由异丙酚预防治疗 μmol / L,而控制细胞受到DMSO溶液过程中H / R损伤或normoxia(数字 3(一), 3(b) 3(c))。免疫荧光观察加强世行的结果。人力资源诱导大量LC3 puncta和不规则形状的线粒体(表明细胞凋亡),细胞可以恢复到正常状态(图在异丙酚治疗 3(d))。

异丙酚抑制H / R-induced自噬。(一)LC3决心在正常细胞的表达,H / R损伤细胞,异丙酚posthypoxia治疗细胞(25 - 150 μmol / L)。(b) LC3决心在控制细胞的表达和细胞治疗normoxia与异丙酚(25 - 150 μmol / L)。(c)的表达LC3决心在正常细胞组,H / R损伤细胞组和DMSO posthypoxia治疗组(25 - 150 μmol / L)。数据代表世行从3独立实验( n = 3 )。(d)自噬小体和线粒体被anti-LC3探测anti-Tim23在正常细胞中,H / R损伤细胞,异丙酚posthypoxia细胞治疗。酒吧,20 μm。

在一起,这些数据表明,异丙酚能有效地抑制细胞凋亡和自噬诱导HUVECs H / R。

 2.3。microrna是不同的表达P-Post + H / R比H / R

研究潜在的可能功能的microrna在HUVECs H / R损伤的保护作用,我们确定HUVECs通过microrna的microrna的表达谱芯片分析。我们第一次评估P-PostH中的microrna的表达谱和H / R组。数以百计的microrna的表达谱确定P-Post之间监管和H / R独立样本分为生理上可判断的组。确定了其中8 microrna在P-PostH调节两倍多组相比,相同的8个microrna在H / R组,而6 microrna表达下调超过两倍( P < 0.01 )(图 4)。6 microrna在这些过滤的选择中存在验证,四是验证异丙酚和人力资源组之间有明显不同( P < 0.05 )。其他两个显示表达式与数组结果趋势一致,但没有统计学意义。是显示在图 5hsa-miR-30b的水平,hsa-miR-20b hsa - mir - 196 a, hsa - mir - 374 b是调节在propofol-treated组与人力资源组,而hsa-let-7e和hsa-miR-15b显示相反的表达模式,在协议与微阵列杂交的结果。

microrna的概要文件区分异丙酚组的H / R组。(一)分层聚类14个microrna的表达显著改变(褶皱变化> 2, P < 0.01 异丙酚,富兰克林·德兰诺·罗斯福> 0.05)和人力资源组。颜色代表信号的强度( n = 3 )。(b)的散点图,红色斑点的microrna表达更高的人力资源组,绿色的代表的异丙酚组高,和黑色的无显著变化。

验证所选微阵列数据中存在。异丙酚和H / R之间统计上的显著差异是用*表示 P < 0.05 ( n = 4 )。

 2.4。潜在Autophagy-Related目标差异表达microrna的揭示

计算算法表明,hsa-miR-20b hsa-miR-30b, hsa - mir - 96和hsa - mir - 196 - 5月目标ULK1 autophagy-associated基因,分别Becline-1, ATG7和Rictor。Hsa-miR-15b或hsa - mir - 374 b可能目标抗凋亡基因(或扩散。Hsa-miR-7e可能目标mitochondria-associated基因(表 1)。microrna表达的相互地和蛋白质都是由两个算法(表的预测 1)。抑制MTOR是直接参与自噬诱导 18, 19]。我们发现Hsa-miR-20b, hsa - mir - 196和hsa-miR-15b可能自噬的主要监管机构,mTOR和抗凋亡通路在异丙酚在H / R损伤的保护作用,分别。miRNA-target基因相互作用网络与自噬和mTOR途径我们先前预测图所示 6。调节microrna hsa-miR-20b显示10个目标mrna当自噬途径而言,尽管hsa-miR-30b也重要的是与自噬通路有关。hsa - mir - 96和hsa - mir - 196 a预测目标mTOR通路相关基因(图 6)。

和小分子核糖核酸的表达水平的目标。

microrna的 目标的象征 目标共同的名称 米兰达 TargetScan 人力资源表达水平
microrna的
hsa-miR-30b BECN1 Beclin 1,自噬相关 是的 是的 ↓
hsa-miR-30b ATG5 自噬相关5 是的 是的 ↓
hsa-miR-20b ULK1 unc-51像自噬激活激酶1 是的 是的 ↓
hsa-miR-20b MAP3K14 增殖蛋白激酶激酶激酶14 是的 是的 ↓
hsa - mir - 196 a RICTOR RPTOR独立MTOR的同伴 是的 是的 ↓
hsa - mir - 96 ATG7 自噬相关7 是的 是的 ↑
hsa-miR-15b BCL2 b细胞慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤2 是的 是的 ↑
hsa - mir - 374 b VEGFA 血管内皮生长因子A 是的 是的 ↓
hsa-let-7e ATP2A2 atp酶、钙+ +运输、心肌和缓慢的抽动2 是的 是的 ↑

miRNA-gene交互网络自噬和mTOR的途径。红色框节点代表microrna的调节在异丙酚组。蓝色代表表达下调的节点代表mRNA和绿色循环。边缘显示microrna在mRNA的抑制作用。

3所示。讨论

H / R-associated细胞损伤可能涉及氧化应激损伤,通过形成活性氧(ROS)。直接有效的氧化和减少代理,ROS损伤内皮细胞膜脂质过氧化作用和还原酶抑制( 20.]。ROS也移植细胞粘附分子的表达,诱导细胞因子的转录,并随后刺激中性粒细胞的激活和趋化作用,从而导致内皮细胞的死亡( 21]。

异丙酚在结构上类似于内源性抗氧化剂维生素E和展品抗氧化活动( 22]。它有一个保护作用对氧化stress-mediated细胞损伤( 23]。异丙酚阻止活性氧(ROS),如过氧化氢(H2O2)全身的细胞损害在培养的内皮细胞和心肌细胞 在体外( 24, 25在心脏缺血/再灌注损伤 在活的有机体内( 10]。

到目前为止,只有少数研究涉及监管propofol-mediated细胞保护的microRNA的报告。关键节点的大规模和系统性分析小分子核糖核酸在H / R处理P-PostH尚未进行。与以前的结果一致,我们的研究还发现,异丙酚的保护作用与HUVECs H / R损伤。为了揭示关键的小分子核糖核酸参与这个过程,我们首先评估中的microrna的表达谱propofol-postconditioned HUVEC细胞的H / R损伤的潜在作用microrna的保护作用。我们发现一组不同的microrna表达,6个表达下调和8调节microrna Propofol-postconditioned组相比,H / R组。中存在的hsa-miR-30b、hsa-miR-20b hsa-miR-15b、hsa-let-7e hsa - mir - 374 b, hsa - mir - 196 -进一步验证芯片结果的可靠性。

为了了解microrna的函数,术语和KEGG通路注释应用到他们的目标基因库。KEGG注释显示重大改变与自噬和mTOR P-PostH组的信号通路与H / R组。miRNA-gene网络的进一步调查这两个路径表明,hsa-miR-20 hsa-miR-30b,和hsa - mir - 196 a的主要监管机构自噬和mTOR途径,分别。

自噬是一种进化保守的过程参与长寿或受损的蛋白质和细胞器退化 26- - - - - - 28]。先前的研究表明,异丙酚保护自噬细胞死亡引起的心肌I / R损伤( 14]。Beclin-1和ATG5也显示目标基因hsa-miR-30b [ 29日),证实了我们的研究。还需要进一步的实验来调查的详细机制。我们还显示其他差异表达microrna在P-PostH相比,H / R组调节MAPK信号通路和细胞凋亡,如hsa-miR-20b和hsa-miR-15b [ 30.- - - - - - 33]。

总之,我们的研究中,首次系统地研究了微剖析P-PostH-treated H / R HUVEC细胞和显示一些差异表达的microRNA P-PostH H / R诱导细胞损伤。他们的监管角色的自噬和抗凋亡途径可能参与了异丙酚对H / R损伤的保护作用。hsa-miR-30b和hsa-miR-20b的低表达可能导致的异常upregulation autophagy-related蛋白,诱导自噬过度,导致细胞死亡。确认和说明的机制需要进一步研究。现在结果还指出,一些令人兴奋的未来研究方向。每个可能识别miRNA-gene对我们是一个强有力的候选人主要研究确定具体的存在miRNA-gene交互,从而创造一个更详细的照片异丙酚的影响。

 4所示。材料和方法 4.1。试剂和抗体

异丙酚是购自σ化学排除脂乳液的影响。评议包括杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM),新生牛血清(nc)、青霉素、链霉素、trypsin-EDTA (GIBCO实验室、大岛,纽约,美国),二甲亚砜(DMSO),膜联蛋白V-FITC凋亡检测装备,和CCK-8细胞计数工具。异丙酚在DMSO溶液溶解,在磷酸缓冲盐(PBS)进一步稀释。最后的DMSO浓度是0.1%,这并不影响细胞的功能或试验系统。以下主要抗体被用于这项研究:anti-beta-Actin抗体(圣克鲁斯,sc - 47778), anti-LC3B多克隆抗体(σ,L7543) anti-LC3多克隆抗体(MBL PM036) anti-TOM20 (fl - 145)(圣克鲁斯,sc - 11415)。

 4.2。HUVEC细胞培养

HUVECs孤立从新鲜人类脐带静脉通过胶原酶消化根据描述修改技术Jaffe et al。 34]。短暂,HUVECs培养在37°C O 95%2和5%的公司2调湿大气与20%胎牛血清DMEM补充,100 μg / mL链霉素和100国际单位/毫升青霉素。HUVECs亚文化是九到十天后。

 4.3。建设一个<斜体>体外细胞< /斜体>异丙酚Posthypoxia治疗H / R模型

缺氧,文化传媒取代葡萄糖和无血清DMEM平衡在正常孵化器在30分钟内和HUVEC细胞被放置在缺氧条件是由一个小封闭湿润有机玻璃室充满94% N2,5%的公司2,1%的人啊2在37°C 12 h。缺氧后,媒介被冲洗掉,和HUVECs回到维护媒介(NCS-DMEM)在正常孵化器有限公司为5%2和95% N24 h。同时,准备异丙酚添加到介质不同浓度(25 μmol / l - 150 μmol / L)。临床相关的血液中异丙酚的浓度大约是17 - 62 μmol / L的维修满意的麻醉( 11]。丸的血药浓度注射异丙酚可以达到56 μmol / L。因此,我们认为25 - 100 μmol / L的临床相关的浓度范围和增加异丙酚浓度被设计为25岁,50岁,100年和150年 μ分别为mol / L(图 1)。

 4.4。细胞生存能力分析

细胞生存能力是评估使用CCK-8工具包。细胞被镀在 1 * 10 4 每在96孔板和细胞治疗H / R和不同浓度的异丙酚posthypoxia治疗。每个浓度的异丙酚(0 - 150 μ在6井mol / L)重复。同时,增加浓度的异丙酚给non-H 4 h / R细胞。辐射暴露后,细胞被洗两次与PBS和孵化1毫升培养基,含有10% CCK-8解决方案,为2 h 37°C。的吸光度测量多模标在450海里。细胞生存能力(%)计算使用公式 ( ( 作为 - - - - - - Ab ) / ( 交流 - - - - - - Ab ) ] * One hundred. % 。:包含上层清液的吸光度的接触或sham-exposure菜;Ac:包含上层清液的吸光度的从正常的控制;阿瑟:含有培养基与10%的吸光度CCK-8解决方案。

 4.5。检测细胞凋亡

量化细胞凋亡,HUVECs沾膜联蛋白V-FITC propidium碘。准备细胞被洗两次冷PBS和resuspended 500毫升绑定缓冲。5毫升的膜联蛋白V-FITC和5毫升propidium碘(1毫克/毫升)被添加到这些细胞,而进行分析与FACSCalibur流式细胞分析仪。早期凋亡细胞被膜联蛋白V和阳性阴性propidium碘,而晚期凋亡坏死细胞显示高碘化膜联蛋白V和propidium标签。

 4.6。西方墨点法

细胞凋亡相关蛋白的表达和LC3由免疫印迹分析。整个细胞溶解产物里帕也准备了缓冲区(50毫米三羟甲基氨基甲烷盐酸,液pH值8,150毫米氯化钠,1%诺乃清洁剂p 40, 0.1% SDS和1% Triton x - 100加蛋白酶抑制剂;σ)。蛋白质浓度由布拉德福德决定试验和样品含有30 ug 12% sds - page分离。被转移到蛋白质硝化纤维膜。膜后被封锁在20毫米Tris-HCl 5%脱脂牛奶,150毫米氯化钠,和0.05%渐变20 1小时在室温下,一夜之间,细胞膜被孵化在4°C不同主要单克隆抗体; β肌动蛋白抗体被用作加载控制。膜被孵化与二次抗体结合辣根过氧化物为1小时在室温和暴露在增强化学发光试剂。光密度分析量化信号强度。

 4.7。免疫荧光

细胞融合在盖玻片增长到70%。治疗后,细胞被洗两次与PBS(上海Sangon生物技术)和固定刚做好的4%多聚甲醛在37°C,持续15分钟。抗原可访问性增加了治疗0.1% Triton x - 100(上海Sangon生物技术)。与1% BSA阻塞后,细胞被孵化主要抗体1 h在室温下,与PBS洗涤后,沾染了二次抗体在室温下进一步50分钟。细胞图像捕获与TCS SPF5 II徕卡共焦显微镜。

 4.8。RNA提取和microrna的微阵列分析

总RNA含有小RNA提取H / R组和HUVECs P-PostH团体通过使用试剂盒纯化试剂(表达载体)和mirVana microrna的隔离设备(美国Ambion、奥斯汀、TX)根据生产的协议。核糖核酸的纯度和浓度测定使用分光光度计从OD260/280读数(NanoDrop nd - 1000)。RNA完整性由1%甲醛变性凝胶电泳。microrna测定进行了使用安捷伦microrna的数组。安捷伦阵列设计每张幻灯片有八个相同的数组(8×60 K格式),每个数组包含调查询问1887人类成熟的microrna和121个人类病毒相关的microrna,从miRBase R18.0。每个microrna的探测器探测到重复30次。

微阵列实验根据制造商的指示。短暂,microrna标签使用安捷伦microrna的标记试剂。总RNA (100 ng)是脱去磷酸与pCp-Cy3和结扎,标记RNA是纯化和杂化microrna的数组。图像与安捷伦芯片扫描仪进行扫描(安捷伦),网格,使用安捷伦特征提取和分析软件10.10版。

 4.9。验证所选微阵列数据中存在

之间的差异表达microrna H / R和P-PostH水平测定中存在所述[ 35, 36]。短暂,rna从HUVECs孤立mirVana microrna的隔离设备(Ambion)。存在microrna进行cDNA产生50 ng总RNA的使用协议mirVana定量实时聚合酶链反应microrna的检测设备(Ambion)。作为内部控制,U6用于microrna模板规范化。荧光信号归一化一个内部参考,阈值周期(Ct)是在指数期的聚合酶链反应。相对基因表达是通过比较计算周期为每个目标聚合酶链反应。目标聚合酶链反应Ct值被减去U6 Ct值归一化,它提供了 Δ Ct 价值。之间的相对表达水平的治疗方法是计算使用以下方程:利用相关基因 Δ Δ Ct 方法与正常化U6 rRNA内生控制。用于rt - pcr引物如表所示 2。

引物用于存在。

基因 退火温度°C 数量的基因引物(5′ → 3′) 加入数量
U6 60 F: 5′CTCGCTTCGGCAGCACATATACT3′ NR_004394.1
R: 5′CGAATTTGCGTGTCATCCTTGCG3′
hsa-miR-30b 60 F: 5′CGCTGTAAACATCCTACACTCA3′ MIMAT0000420
R: 5′GCAGGGTCCGAGGTATTC3′
Hsa-miR-15b-5P 60 F: 5′ATGGTTCGTGGGTAGCAGCACATCATGGTTTACA3′ MIMAT0000417
R: 5′GCAGGGTCCGAGGTATTC3′
mir - 196 - 5 - p 60 F: 5′ATGGTTCGTGGGTAGGTAGTTTCATGTTGTTGG3′ MIMAT0000226
R: 5′GCAGGGTCCGAGGTATTC3′
hsa - mir - 374 b - 5 - p 60 F: 5′CGTGGGATATAATACAACCTGCTAAGTG3′ MIMAT0004955
R: 5′CTCAACTGGTGTCGTGGA3′
Hsa-miR-20b-5P 60 F: 5′ATGGTTCGTGGGCAAAGTGCTCATAGTGCAGGTAG3′ MIMAT0001413
R: 5′CTCAACTGGTGTCGTGGA3′
Hsa-let-7e 60 F: 5′CGCTGAGGTAGGAGGTTGTA3′ MIMAT0000066
R: 5′GCAGGGTCCGAGGTATTC3′

F:正向引物;接待员:反向引物。

microrna的数量和顺序的一个特定的microrna的可以从miRBase获得序列。

 4.10。目标基因预测

microrna的目标预测的预测可以由计算算法由于其碱基配对规则microrna与mRNA目标站点,位置绑定序列中目标的3′UTR和保护目标绑定在相关的基因组序列。在我们的研究中,基因预测的TargetScan v5.1 ( http://www.targetscan.org/)和米兰达v5 ( http://www.mirbase.org/)被视为一种microrna的潜在目标。

 4.11。生物信息学分析差异表达microrna

基因本体论(去)分析应用于以基因组织成层次类别和揭示microrna基因调控网络生物过程的基础上,细胞组件,和分子的功能。我们microrna表达的不同分为两组(H / R调节和H / R表达下调),这两组映射到每个节点的数据库。计算了每个节点对应的microrna GSEABase包R统计平台( http://www.r-project.org/)。我们也分析了潜在目标基因相关通路使用GenMAPP v2.1基于《京都议定书》全书的基因和基因组(KEGG)通路数据库。铀浓缩活动 P 目标基因的值在每个路径计算。后来,我们综合监管的基因之间的相互作用和microrna。同时我们分析两种不同的相互作用:(1)数据从KEGG数据库描述基因之间的关系,包括enzyme-enzyme关系,蛋白质相互作用、基因表达交互(KEGGSOAP软件包( http://www.bioconductor.org/packages/2.4/bioc/html/KEGGSOAP.html)和(2)蛋白质相互作用的高通量实验验证了(MIPS哺乳动物蛋白质相互作用数据库: http://mips.helmholtz-muenchen.de/proj/ppi/)。然后,我们综合结果的基因网络,并显示的图软件美杜莎21(数据未显示)。最后,我们建立了某些pathway-related网络使用预测目标的microrna识别关键的microrna调节途径根据microrna的学位。

 利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(81270916,31301104)也来自广东医学院的科研启动格兰特(XB1342 701 b01206)。

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