TPEN在急性淋巴细胞白血病模型中独立于锌螯合剂活性诱导细胞凋亡离体急性白血病通过氧化应激和线粒体胱天蛋白酶3-和AIF依赖性途径细胞

抽象的

急性淋巴细胞白血病仍是一种无法治愈的疾病对治疗耐药广大患者发展。我们研究了在Jurkat和TPEN，细胞内锌螯合剂的作用体外抗化疗的急性淋巴母细胞白血病(ALL)细胞。通过细胞核形态的改变、活性氧的产生、次二倍体细胞的存在、磷脂酰丝氨酸易位、线粒体膜去极化、细胞死亡信号分子的免疫组化鉴定和药理学抑制检测凋亡细胞的死亡途径。我们发现，TPEN通过参与分子氧化应激途径诱导两种类型的细胞凋亡-κB(物/ c-Jun)损失Caspase-3，AIF>染色质凝结/ DNA碎片。有趣的是，TPEN诱导细胞凋亡独立于葡萄糖;因此，白血病细胞通过代谢抗性抗性缺乏存活能力。最重要的是，TPEN细胞毒性效应最终可以由抗氧化N-乙酰基半胱氨酸和锌离子调节。我们的数据表明，TPEN可以用作难治性白血病的潜在治疗促进剂。这些数据有助于了解氧化应激在所有氧化应激的重要性。

1.介绍

白血病是造血细胞群负责的至少37520个新病例和15200名人死亡在美国[恶性肿瘤1]．虽然白血病的病因尚不清楚，但一些细胞、遗传和生化改变是最可能的病因机制[2-5.]．细胞凋亡是由特定形态学和生物化学特征定义的编程细胞死亡的受控和调节形式[6.-8.]．凋亡细胞死亡的再激活表现为消除癌细胞的主要目标[9.那10.]．不幸的是，次级治疗相关的白血病（例如，急性淋巴细胞性白血病，ALL）可能出现以下化疗，放疗，和/或终末分化初级恶性肿瘤[11.-13.]．因此，白血病仍然是一种不治之症，大多数患者对治疗产生了耐药性。因此，有必要研究达到最大限度的癌细胞死亡或细胞最终分化的治疗方法。鉴于细胞内死亡/分化途径的复杂性[8.那14.-16.[将这些途径放在与药物触发的正确关系中是否具有挑战性。由于白血病患者已经显示了金属蒸发（例如，锌）以[17.那18.]这是许多蛋白质和转录因子的必需辅助因子[19.那20.]，有理由认为螯合剂可能是一种潜在的药物制剂，以对抗不同类型的癌症[21.那22.]．因此，锌耗尽[19.那20.]在所有患者中可能是一个现实的目标。

TPEN（N那N那N那N-Tetrakis(2-吡啶甲基)-乙二胺)是一种脂溶性金属锌螯合剂，已被证明可诱导几种癌细胞凋亡[23.-27.]通过胱天蛋白酶家族蛋白酶的[25.那28.-33.]，转录因子p53 [28.那33.]和癫痫蛋白的X链接抑制剂（XIAP [27.]）。然而，在单细胞中TPEN诱导的细胞死导的完全分子机制尚未完全建立。有趣的是，抗氧化N-乙酰基-1-半胱氨酸（NAC）抑制TPEN的细胞毒性作用，表明氧化应激（OS）是Zn缺乏相关细胞死亡的可能介质[25.]．值得注意的是，产生OS的分子诱导细胞死导途径的最小完整性，作为癌细胞消除的机制解释[34.]．我们推测TPEN可能通过OS诱导白血病细胞凋亡。

为了测试这种假设，我们寻求（i）来确定TPEN治疗是否通过h诱导OS₂O.₂，以及Jurkat细胞中促凋亡转录因子、激酶和caspase-3的激活，用作人类ALL的模型。我们还想(ii)确定凋亡诱导因子(AIF)在TPEN治疗中的作用。葡萄糖似乎是癌症细胞对抗OS的关键病理生理抵抗[35.那36.]．因此，我们评估是否血糖可能改变Jurkat细胞生存回应TPEN。为了验证这一点体外数据显示，一名对化疗和放疗有耐药性的患者的ALL细胞被TPEN激发。所有细胞的细胞核形态学改变和丢失情况也同样进行评估，P53和Caspase-3激活或AIF分析。了解OS的机制可能会对更有效的抗癌治疗提供洞察力。

2。材料和方法

3, 3 ' -dihexyloxacarbocyanine碘化(OC_6.(3)， cat # D-273)，吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(PDTC, cat;# 548000)和1,9-吡唑蒽酮(SP600125, cat # 420119)均来自Calbiochem。碘化丙啶和7-AAD BD探针细胞活力均购自BD Bioscience (San Jose, CA)。Annexin v - phycoythrin (PE)凋亡检测试剂盒购自BD Pharmingen公司(San Diego, CA)。二乙酸二氯荧光素(DCFH₂-da）从Invitrogen获得。所有其他试剂都来自Sigma-Aldrich。

2.1。Jurkat t白血病细胞文化

Jurkat克隆E6-1 (ATCC目录号。TIB-152)。

2.2。Jurkat白血病细胞系的实验

2.2.1。荧光显微镜和流式细胞术对细胞死亡的形态学评价

细胞悬液(1ml，最终体积)暴露于增加的TPEN(0.1-5)中μm）在没有葡萄糖（G11，G55; Gibco / Invitrogen）或在37℃的情况下在不存在或存在不同产品的情况下（G0）的葡萄糖（G11，G55; Gibco / Invitrogen）或缺失（G0）以葡萄糖（G11，G55; G10）。荧光显微镜分析和凋亡形态的定量根据[37.]．在独立实验中3次盲法检测细胞凋亡指标。对于annexin V/7-AAD流式细胞仪分析，根据供应商的方案(BD Pharmingen, San Diego, CA)使用Becton Dickinson流式细胞仪FACSCanto II (San José， CA)对细胞进行评估。流式细胞仪检测细胞凋亡3次。

2.2.2。流式细胞术测定DNA碎片

DNA断裂是通过使用的碘化丙啶（PI）低渗溶液来确定。进入亚G1期的细胞用作标记的细胞凋亡。将细胞悬液在一个FACSCANTO III流仪（Beckton Dickinson）上进行分析。20,000个事件进行了评估。DNA片段化测定在独立的实验中评估3次。

2.2.3。细胞内反应性氧（ROS）的评价

超氧阴离子自由基(）检验了形成的甲臜阳性细胞和定量的根据[评价38.]．在独立实验中重复评估3次。

过氧化氢（H₂O.₂用2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯(5μ米,DCFH₂根据使用流式细胞仪的FACSCanto II，Becton Dickinson公司（圣何塞，加利福尼亚州）的流动供应商的方案-DA）。在独立实验中重复评估3次。

2.2.4。分析线粒体膜电位（ 通过流式细胞术

Jurkat细胞系按上述方法处理。然后，细胞(1 × 10^5.）在室温下在黑暗中孵育20分钟，用阳离子亲脂性DIC_6.（3）（10nM，最终浓度）和插层碘化物碘化钛（PI，12.5ng / ml，最终浓度），根据标准方案。使用流量细胞仪FACSCANTO II，BECTON DICKINSON（SANJOSÉ，CA）分析细胞。在独立实验中重复评估3次。

２.３.转录因子NF-的免疫细胞化学检测κB，p53和c-Jun的，Caspase-3的，和凋亡诱导因子（AIF）

圣克鲁斯生物技术供应商协议（山羊ABC染色系统：猫＃SC-2023），随后使用初级山羊多克隆抗体免疫细胞化学NF-κB p65 (C-20)- g (cat # sc-372-G)， p53 (FL-393) (cat # sc-6243-G)， p-(Ser73)-c- jun (cat # sc-7981)， caspase-3 (cat # sc-22171)，和AIF (cat # sc-9417)。细胞免疫染色，二氨基联苯胺阳性(DAB)⁺根据）细胞进行定量[37.]．

2.4。保护和救援实验

The Jurkat cell suspension (1 mL, final volume) was treated with (3 μM)立即单独使用TPEN(用于防护实验)或放置6小时(用于救援实验)。然后，将细胞与表中所示浓度的抗氧化剂和抑制剂共孵育1在37°C下放置24小时。在此之后，如前一节所述，通过荧光显微镜或流式细胞术评估细胞的凋亡特征。在独立实验中重复评估3次。

2．5．患者血细胞培养条件

获得知情同意后，从化疗和放射疗法收集外周血，根据经典形态学，细胞遗传学和免疫蛋白质标准诊断的患者（女性，53岁）的所有细胞抵抗所有细胞。安踏大学机构伦理委员会批准了这项研究。将所有患者的全血样品（1mL）与0,5,10,15,20孵育 μ在37°C时M Tpen 24小时。血液的涂片（30 μL)用Giemsa和aliquot染色(100μL)用AO/EB/Hoechst染色，分析细胞核形态变化。在剩余体积的红细胞溶血后，对细胞进行ΔΨ分析_m在相同条件下，采用流式细胞术。结果代表了一个实验中两个重复的平均值±标准差。用Ficoll-Hypaque (淋巴细胞分离用PBS (10 mM磷酸钠，160 mM NaCl, pH 7.4)洗涤三次，最后在标准培养条件下悬浮在rmi -1640培养基(GIBCO实验室，NY，美国)。LC镀24孔(1 × 10)^6.细胞/mL/well)，用上述相同浓度的TPEN在37°C下处理24小时。免疫组化采用LC。

2.6。统计分析

数据是指±S.D。三个独立实验。单因素方差分析和Bonferroni或游戏 - 霍威尔分析因果比较采用SPSS 18软件计算。一个的价值和被认为是重要的。

3.结果

3．1.TPEN诱导Jurkat细胞凋亡的浓度和时间依赖，但不依赖活性氧

如图所示1，TPEN诱导细胞凋亡的典型形态（图1(b))与未处理细胞比较(图1(a))的浓度依赖性(图1（C））。因为我们发现3-5 μM TPEN诱导100％AO / EB / HOECHST阳性核染色，我们使用3 μ中号TPEN用于进一步的实验。在这个浓度下，动力学分析表明，TPEN诱导产生的（数字2(a))呈带状，在6h时最大发电量(图2(c))和H₂O.₂（数字2（b））以时间为独立的方式（图2（C）），根据分别NBT染色和流式细胞术分析。此外，TPEN引发DNA片段化（图3.（a）），磷脂酰丝氨酸的外化，（PTDSER，图3.（b）), and loss  ΔΨ_m（数字3.（c））以时间依赖的方式，如流式细胞术测定确定。

图1

星号 μ 箭头, 箭头, 2 4（a） 4 (f) 6. 6. 7（a） 7（d） TPEN以浓度依赖的方式在Jurkat细胞中诱导染色质缩合和DNA碎片。代表性的荧光显微照片显示未经治疗的（-TPEN）细胞，具有正常核（），或经处理的细胞（+ TPEN，3- m）浓缩染色质（I期的细胞核形态）和DNA断裂（一个O./EB（（a），（b））（例如450-490 nm，em。515nm），hoechst染色（（a'），（b'））分析阶段II核形态）（（a'），（b'））（EX。354 nm，em。442nm）或合并图像（（a''），（b''））。（c）用正常，阶段I和阶段核形态增加Tpen浓度的Jurkat细胞的阳性AO / EB / Hoechst染色的百分比表示为平均百分比±S.D。来自三个独立实验。倍率（（a），（b））800x。（a） - （b）和图表所示的显微照片（一种），-那（一种）-(f)和-使用配有佳能PowerShot G5数码相机的蔡司（AxioStart 50）显微镜进行。斐济（斐济Win32）图像处理包用于复合图像（（a''） - （b'））。

图2

_{2 2} ^6. μ μ ⁺ μ TPEN诱导生产和HO.。。以一种独立的方式。Jurkat细胞（1×10细胞/毫升）或者暴露于TPEN（3 m）在37℃下为1,3,6,12和24小时，或未治疗24h（24u）（a）代表性光学射出，说明甲藻（Formz）沉淀，如代与TPEN孵育的Jurkat细胞（3 米)at 37°C for 3 h. (b) Representative histograms showing the percentage of DFC在TPEN (3（C）每个时间间隔后，FORMz和DCF阳性细胞的百分比表示为三个独立实验的平均百分比±S.D.。

图3

^6. μ _{1 6.} 5. 6. TPEN可诱导Jurkat细胞线粒体去极化、质膜损伤和染色质断裂。((a) - (c)) Jurkat细胞(1 × 10细胞/mL)与TPEN (3米)在37°C下放置1、3、6、12和24小时。这些细胞随后被用于几项化验。(a)显示SubG的代表性直方图DNA断裂的细胞群指示TPEN处理后，如在根据材料和方法（b）部分代表密度描述（点）的图，显示PI / DIOC（3）四种不同细胞群在TPEN处理下的百分比，如材料和方法部分所述。(c)代表性密度(点)图，显示TPEN暴露下四种不同细胞群的膜联蛋白V/7-AAD百分比，如材料和方法部分所述。圈号是三个独立实验的平均百分比。sd值低于±5%(图中也是如此)和)的平均值，并没有显示。

３．２．TPEN诱导转录因子、Caspase-3活化和AIF核转位

接下来，我们研究了TPEN是否能够激活转录因子、JNK激酶、caspase-3 [34.]和aif。如图所示4.，与未处理的细胞相比（例如，〜2％，图4（a）），TPEN有效地诱导NF-κB（例如，％， 数字4 (b)），p53（例如，％， 数字4 (c)），C-Jun（例如，％， 数字4 (d)），胱天蛋白酶-3（例如，％， 数字4 (e))和AIF(例如:％， 数字4 (f))。这些观察结果通过在药物抑制剂存在的情况下孵育Jurkat细胞得到了进一步的证实(见表)1)， AO/EB/Hoechst染色及流式细胞术检测。此外，细胞预暴露于TPEN 6h后，再与抑制剂化合物共孵育，可挽救Jurkat细胞免于凋亡(表)2）.

（一种）

（b）

（C）

(d)

(e)

(f)

（一种）
（b）
（C）
(d)
(e)
(f)

图4

κ ^6. μ κ κ TPEN诱导NF-的活化B.。，p53和c-Jun的转录因子，胱天蛋白酶-3和AIF在Jurkat T细胞。Jurkat细胞（1×10细胞/mL)与TPEN (3米)在37°C下24小时。未处理(a)和tpen处理的细胞用抗nf -染色b -p65 (b)、anti-p53 (c)、anti-c-Jun (d)、anti-caspase-3 (e)、anti-AIF (f)抗体根据材料与方法部分的注意事项中描述的协议，与对照相比，NF-B.。，p53和c-Jun的，胱天蛋白酶-3，和AIF阳性细胞核（深褐色）反映它们的核易位/激活，并且似乎与凋亡的核形态。还要注意的是（a）表示在（（B） - （F））中使用的各抗体的对照。放大倍率700X（（A） - （F））。

３．３．TPEN诱导Jurkat细胞凋亡，不依赖于葡萄糖浓度，但n -乙酰半胱氨酸可降低其毒性作用

如图所示5.， TPEN诱导细胞凋亡(图5.（一种）), loss of  ΔΨ_m（数字5.（b）中），和DNA片段化（图5.(c)与单独培养的细胞相比，Jurkat细胞以葡萄糖和时间无关的方式进行培养。相比之下，抗氧化化合物如NAC (1 mM)和锌离子(10μM）明确保护（表1）和救援（表2) tpen诱导Jurkat细胞凋亡作用。为了确定TPEN通过OS诱导细胞凋亡，细胞暴露于锌(SO)_4.）/ TPEN复杂。No significant difference in nuclei morphology, plasma membrane damage, and loss  ΔΨ_m在Zn/TPEN复合物或Zn + TPEN处理的Jurkat细胞中检测到(表1和2）.此外，NBT没有显着差异⁺(例如,％）和DCF⁺(例如,在用Zn / Tpen复合物和未经处理的细胞之间观察到％）百分比（图2）或单独的锌（例如，%电视台⁺那％dcf.⁺)持续24小时，表明减少和H₂O.₂生产。

图5

^6. μ _6. μ μ 葡萄糖对TPEN暴露Jurkat细胞的影响。(a) Jurkat细胞AO/EB/Hoechst染色阳性百分率(1 × 10)细胞/mL)，在葡萄糖饥饿(GS)、葡萄糖11 mM (G11)或葡萄糖55 mM (G55)培养基中，无或有TPEN (3米)at 37°C for 1, 3, 6, 12, and 24 h with normal, stage I, and stage II nuclei morphology are expressed as a mean percentage ± S.D. from three independent experiments. (b) Representative density (dot) plots showing PI/DiOC（3）在GS，G11和G55培养中孵育12小时的四种不同细胞群的百分比，或没有TPEN（3 米)，如材料和方法部分所述。(c)含或不含TPEN的GS、G11和G55培养基中12小时SubG1细胞群的代表性直方图(3米)，如材料和方法部分所述。

3.4。TPEN诱导凋亡通过线粒体caspase依赖和非依赖性途径的所有单元格

如图所示6.(b) -6.(f)全血ALL细胞经TPEN处理后，与未处理的细胞相比，细胞核呈现典型的凋亡变化(图)6.(a)和插图)。值得注意的是，这些形态与经TPEN处理的Jurkat细胞所显示的形态相当(图)1(b))。同样，TPEN诱导线粒体去极化(图)6.(g)和图6.（H））。有趣的是，TPEN诱导浓度依赖时尚的两种现象（图6.(我))。如图所示7.，TPEN显着诱导P53的激活（图7 (b)), caspase-3(图7 (c))， AIF向细胞核移位(图7（d））与在没有锌螯合剂的细胞相比（图7（a）)类似于TPEN处理的Jurkat细胞。显然，不仅仅是DAB的量⁺用TPEN处理的所有细胞中的核与DAB显着不同⁺AO/EB/Hoechst细胞和ΔΨ_m与未处理细胞相比标记物显著不同（表3.）.

图6

μ μ ^+/- _6. μ ^+/- _6. TPEN可诱导全血ALL细胞染色质凝聚、细胞核碎裂和线粒体去极化。所有细胞用TPEN(0, 5, 10, 15, 20)孵育米)在37°C下24小时。这些细胞随后被用于几项化验。代表性的显微摄影（（A） - （F））示出了与正常染色质/细胞核未处理ALL（a）和处理的所有细胞与TPEN（20 米)染色质浓缩，核碎裂((b) - (f))，通过吉氏染色确定。(g) - (h)表示PI的代表密度(点)图/dioc.未处理细胞中四种不同细胞群的百分比（（g））和用tpen处理的细胞（20 M， (h))来自病人。(i)通过AO/EB、Giemsa染色和PI评估核浓缩/破碎阳性的百分比/dioc.在暴露于高浓度TPEN的ALL细胞中，细胞表达为一个独立实验中两个重复的平均百分比±sd。

（一种）

（b）

（C）

(d)

（一种）
（b）
（C）
(d)

图7

^6. μ TPEN诱导p53-的活化，胱天蛋白酶-3和AIF中分离ALL细胞。ALL细胞（1×10细胞/mL)与TPEN (5米)在37°C下24小时。按照材料和方法部分描述的方法，用抗p53 (b)、抗caspase-3 (c)和抗aif (d)抗体对未经处理(a)和经tpen处理的细胞进行染色。注意，与对照组相比，p53、caspase-3和AIF阳性核(深棕色)反映了它们的核易位/激活，似乎与凋亡细胞核的形态有关。还请注意(a)表示(b)-(d)中使用的每种抗体的对照。放大倍数360x ((a) - (d))，插图1400x。

4.讨论

在目前的调查中，我们第一次报告体外锌螯合剂TPEN在Jurkat细胞和白血病患者ALL细胞中诱导凋亡的因果机制的证据tpen诱导的细胞凋亡符合OS诱导的细胞死亡信号最小完全性模型[34.]．最重要的是，我们证明TPEN诱导细胞死亡独立于细胞能量要求（即，葡萄糖[39.]）的培养环境。因此，该模型提供了白血病细胞死亡的机理解释。具体来说，我们发现，TPEN诱导通过OS主要是凋亡。我们发现，NAC不仅显著保护也是抢救Jurkat细胞对TPEN曝光[25.]．此外，当细胞暴露于锌/TPEN复合物时，可以比较/小时₂O.₂检测到未处理细胞的值;因此，TPEN诱导的细胞凋亡显着降低。该数据意味着锌禁用TPEN生成ROS，从而拒绝单元信令。因此，这种观察表明TPEN独立于其金属螯合剂功能诱导细胞凋亡。但是，TPEN的来源产生是未知的。无论产生的机制是什么，我们已经证明了TPEN诱导了持续的潜伏期可达6小时，然后逐渐减少，直至完全潜伏期(24小时)。生产过剩的导致H₂O.₂通过酶促或非酶的反应。有效地，TPEN诱导了剧烈的H增加₂O.₂从第1 h到12 h(~80% ~ 60%)，然后在24 h下降到~30%。这些H₂O.₂在未处理的细胞中，生产值与基线相比异常高(~10%)。人们普遍认为高H₂O.₂5用作氧化剂信号，该信号可能激活的关键信号分子，如NF-κB (40]．它已被证明使得h₂O.₂间接激活转录因子NF-κB通过几个激酶[41-45]．因此，TPEN诱导NF-的活化κ乙转录因子在Jurkat细胞中示出碎裂和缩合，细胞凋亡形态的典型指示。NF-κB的药理抑制κB组可明显抑制tpen诱导的细胞凋亡。这些观测结果符合NF-的概念κB被参与细胞凋亡[46那47]在Jurkat细胞暴露于TPEN。在这种观念线，NF-κb转录促凋亡基因，如p53 [48]．TPEN诱导p53活化和转位到细胞核。TPEN不仅能激活Jurkat细胞中的p53(这项工作)，还能激活神经元细胞中的p53 [28.那33.]．活化的p53通过改变线粒体功能触发细胞凋亡，这也许并不令人惊讶[49]，抑制抗氧化剂基因[50]和调节新陈代谢的基因[51]．这些数据表明，P53在不同应力信号下游的关键节点和应力传感器起作用。但是，P53诱导的细胞凋亡可以停止并反转。特异性抑制剂PFT能够在Jurkat细胞中保护和拯救TPEN诱导的细胞凋亡。该观察结果进一步增强了P53易受调控过程的观念，从而可能针对特异性地破坏恶性细胞。因此，P53已成为对白血病细胞治疗方法的优秀候选者[52-54]．与Ak和Levine相比[55，我们得出两个NF-κB和p53已经进化到可以对OS做出反应，并且它们可以在同一细胞中同时发挥作用。

TPEN / H.₂O.₂压力导致了ΔΨ的损失_m同时以时间依赖的方式伴随PTDSer的外化，作为凋亡的典型标记。但是，流量抑制仪值损失Δψ_m和PtdSer有显著差异。这一观察结果表明，要么放弃ΔΨ_m发生在PtdSer外化或Annexin V检测未成功标记所有凋亡细胞之前[56]．按照他人的意见[25.那28.那30.-33.，我们发现在处理过的细胞中caspase-3被激活。用NSCI抑制剂证实caspase-3参与了TPEN毒性，既能保护细胞，又能拯救细胞。因此，Caspase-3的激活构成了一种关键的蛋白酶，也是OS诱导的细胞死亡的标志。我们首次报道了TPEN刺激AIF向细胞核转移并诱导染色质凝结。与他人相比[57， AIF主要参与TPEN暴露下Jurkat细胞的凋亡，至少在本实验条件下是这样。为了支持这一观点，Stambolsky等人[58]已经表明，p53蛋白调控AIF的表达。我们的结论是根据细胞类型和应激刺激，AIF可能是在细胞凋亡或坏死[参与57那59]．综上所述，TPEN主要通过线粒体介导Jurkat细胞凋亡[60]由两个互补但独立的细胞死亡的子路径：AIF-和caspase-3依赖性机制。然而，我们发现，通过荧光显微术检测的核的在阶段II比例高于核的阶段中的比例更高I.一种可能的解释是，TPEN螯合物锌从胱天蛋白酶3，增加其催化活性[32.]并且由此overpassing线粒体胱天蛋白酶激活过程。此外，也TPEN破坏XIAP，天然胱天蛋白酶-3抑制剂[27.]．因此，锌作为caspase-3的有效抑制剂[61，保护和拯救Jurkat细胞免受TPEN的毒性作用。因此，AIF和caspase 3应该作为细胞死亡的常规标志物。此外，TPEN通过激活c-Jun和JNK激酶诱导细胞凋亡，其激活可能受H₂O.₂[62]．有报道称JNK可使p53磷酸化[63]．鉴于目前的数据和Yin等人报道的数据[64]遵守NF-的概念κB、JNK和p53通路参与HepG2细胞和Jurkat细胞的OS(本工作)。

We found that TPEN-induced nuclei fragmentation morphology and loss  ΔΨ_m以所有患者的全血细胞中浓度依赖性的方式。治疗分离的所有细胞（5μM) TPEN显示p53、caspase-3和AIF DAB⁺与未经处理的细胞相比。这些数据表明，TPEN通过类似机制诱导所有白血病细胞的细胞凋亡，作为TPEN在Jurkat细胞中的诱导的机制（图8.）.然而，我们注意到，在全血ALL细胞上，几乎5倍浓度的TPEN是必要的，以达到与TPEN处理Jurkat细胞相当的凋亡值。自TPEN能够充分诱导细胞凋亡在所有通过激活细胞死亡信号机制,得出所有细胞对化疗的耐药性与故障无关的细胞的死亡机器元素,至少,在死亡标记评估这项工作,但很可能由其他基因改变(65那66]．因此，提出了TPEN可能被探索为潜在的白血病潜在治疗剂分子。

图8

_{2 2} κ κ κ α P53. p53诱导基因3 (PIG3)、脯氨酸氧化酶(PO)、 _{2 2 2 2} κ P53. _{2 2} 提出了tpen诱导Jurkat细胞和ALL细胞凋亡的方案。TPEN生成（1，通过未知机制），这反过来又歧化成HO.。。最后一种化合物充当信号分子。事实上，它间接激活了NF-通过激酶的活化B（4）和c-Jun（6）转录因子（v.gr. ASK1，MEKK1，SHIP-1（3）和JNK（5））。一旦NF-B.。(4)通过其抑制剂I的磷酸化作用B.。。，它易于核，并转录几种抗曝气基因（7）和促凋亡基因，其中包括（8）。这种转录因子通过几种诉讼平衡细胞决定死亡：P53直接影响线粒体或转录促凋亡基因，例如通过拮抗抗曝光蛋白（9）促成外部线粒体膜的渗透。同时，P53诱导促兴奋剂基因的表达（例如，(10)产生更多的HO.。。（2），并抑制抗氧化基因的转录。因此，HO.。。过度生产和进一步激活NF-b诱导促凋亡基因的上调（例如，），这反过来又扩增初始ħO.。。-诱导细胞死亡信号。线粒体损伤允许AIF和细胞色素C等凋亡因子的释放(11)，它们与dATP、前caspase-9和凋亡蛋白酶激活因子-1一起释放;即凋亡复合物触发caspase-3蛋白酶的激活(12)。这种蛋白酶反过来通过切断核酸酶的抑制剂DFF45/ICAD来激活内切酶DFF40/CAD。最后，DFF40/CAD导致核染色质碎裂(II期细胞核形态，(13)，典型的凋亡。或者，AIF易位进入细胞核，产生染色质碎裂(第一阶段细胞核形态(14))。值得注意的是，锌螯合剂TPEN可以通过直接激活caspase-3(15)或通过释放x -联凋亡抑制剂(XIAP, 15)的caspase-3来进一步杀死细胞。有趣的是，TPEN的毒性可以被抗氧化剂n -乙酰半胱氨酸(NAC)(16)和锌离子(17)阻断，可能是通过改变其三维结构。

利益冲突

作者报告没有利益冲突。

致谢

这项工作得到了Colciencias向C. Velez-Pardo和M. Jimenez-Del-Rio提供的第1115-408-20525号资助。M. Mendivil-Perez是由Colciencias合同号资助的联合研究员。由Colciencias合同编号为8790-2514-2010的青年研究计划奖资助。8790-016-2011。作者感谢来自Leon XIII诊所的F. Cuellar博士(血液学家)和ALL患者的血细胞样本捐赠。他们感谢GICIG-SIU-UdeA流式细胞术单元的Catalina Burbano-Arciniegas提供的技术援助。

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