PGC-1α诱发肺动脉高压

摘要

特发性肺动脉高压(IPAH)的特征是肺动脉梗阻性重塑，肺动脉压进行性升高(PAP)，随后出现右侧心衰和死亡。缺氧诱导过氧化物酶体增殖物激活受体的表达γcoactivator-1α(PGC-1α)，调节氧化代谢和线粒体生物发生。我们分析了PGC-1的表达αIPAH患者血清中细胞色素C (CYTC)、超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化状态(TAS)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性的变化。表达PGC-1α在IPAH患者中检测到，但在健康志愿者中未检测到。IPAH组SOD mRNA水平较对照组降低(3.93±0.89倍)。与健康供体相比，患者的TAS和GPX活性也较低(分别为0.13±0.027 vs 0.484±0.048 mM和56.034±10.37 vs 165.46±11.38 nmol/min/mL)。我们发现PGC-1的表达水平呈负相关α与年龄、PAP、PVR呈正相关，与CI、PaO呈正相关₂， CYTC、SOD、TAS、GPX的mRNA水平。这些结果表明了PGC-1可能的作用α作为IPAH进展的潜在生物标志物。

1.介绍

肺动脉高压(Pulmonary arterial hypertension, PAH)是一种复杂的疾病，其特征是肺动脉梗阻性重塑，导致肺动脉压(Pulmonary arterial pressure, PAP)的进行性升高，进而导致右侧心衰和死亡[<一个href="#B1">1]．根据针对肺动脉高压病因的具体治疗干预措施(1)肺动脉高压，(2)伴有左心疾病的肺动脉高压，(3)与呼吸系统疾病或低氧血症相关的肺动脉高压，可将肺动脉高压疾病分为五类。(4)血栓性或栓塞性疾病引起的PH;(5)多因素机制引起的PH [<一个href="#B2">2]．特发性PAH (IPAH)纳入组1，患者平均肺动脉压(PAPm)≥25 mmHg，肺毛细血管楔形压(PCWP)、左房压或左室舒张末期压≤15 mmHg，肺血管阻力大于3个Wood单位[<一个href="#B3">3.]．肺动脉重塑导致肺血管阻力(PVR)增加，导致右心室(RV)超负荷、肥大和扩张，最终右心室衰竭和死亡[<一个href="#B4">4].这些变化是由于心肌收缩力的适应性不足所致[<一个href="#B5">5]．

尽管IPAH的生理病理仍在研究中，但包括心肌缺血在内的自由基氧介导事件的作用似乎很清楚[<一个href="#B6">6]．在PAH的发展过程中，由于心肌肥厚细胞对氧的需求增加，以及毛细血管密度的降低，出现进行性缺氧情况[<一个href="#B7">7，<一个href="#B8">8]．这种缺氧情况导致氧化/抗氧化状态的不平衡，随之而来的细胞损伤导致RV衰竭[<一个href="#B9">9，<一个href="#B10">10]．

活性氧生成的增加已经在不同的PH实验动物模型和ipah诊断的患者中建立起来[<一个href="#B11">11，<一个href="#B12">12]．尤其是这些物种的主要来源，是损伤的血管，导致一氧化氮(NO)信号传导受损和肺血管重塑的发展[<一个href="#B13">13，<一个href="#B14">14]．在这种情况下，超氧化物歧化酶(SOD)的作用是相关的，因为它参与了NO代谢的调节和防止PH，正如它在成年动物模型中所描述的[<一个href="#B15">15]．参与氧化酶病(包括PH)的另一个重要的抗氧化酶是谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)。这种酶的缺乏与活性氧的增加和NO的减少有关^•导致内皮功能障碍和血管反应性受损[<一个href="#B16">16]．

过氧化物酶体增殖物激活受体γcoactivator-1α(PGC-1α)是一个著名的基因转录调控因子，参与氧化代谢和线粒体生物发生，包括线粒体呼吸链CYTC [<一个href="#B17">17]．该转录共激活因子在心肌代谢控制中发挥关键作用，并参与心肌细胞分化[<一个href="#B18">18].PPAR激动剂（吡格列酮和罗格列酮）可保护心室功能和PGC-1α水平(<一个href="#B19">19- - - - - -<一个href="#B21">21]．组织产生PGC-1的能力α在缺氧事件后，可以预测组织的再生能力。事实上，我们最近报道了PGC-1的表达水平α在心肌梗死患者的血液样本中可能与缺氧区域的大小相关，支持该蛋白在缺氧损伤后保护心肌细胞的作用[<一个href="#B22">22]．

本研究的主要目的是分析PGC-1的表达水平α在12名ipah诊断的患者和15名健康志愿者中这些水平与疾病的进展有关，与细胞色素c (CYTC)和超氧化物歧化酶(SOD) mRNA水平以及总抗氧化状态(TAS)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性相关。

2.材料和方法

２.１.病人

在这项研究中，12名ipah诊断的患者与15名健康志愿者进行了比较。12例确诊患者的纳入标准包括mPAP > 25 mmHg, PWP小于或等于15 mmHg和PVR > 3木单位导管测量。本研究纳入患者的临床特点见表<一个href="//www.newsama.com/journals/omcl/2012/236572/tab1/" target="_blank">1．所有患者在样本采集前接受了波生坦、曲前列尼、硝苯地平和伊洛前列素的不同组合。健康志愿者与年龄相仿的患者配对(和岁的职责)。

所有实验均经当地伦理委员会批准并获得知情同意。一方面，2.5 mL外周血在PAX基因RNA收集管(Qiagen, Valencia, CA, USA)中收集，并按照制造商的建议在−80°C下保存直到分析。另一方面，用EDTA抽真空器(Becton Dickinson, NJ, USA)采集外周血4 mL。血浆通过离心分离(15分钟在2500 rpm)，并在−80°C储存在500μL整除。

２.２.测定PGC-1α、CYTC、SOD mRNA表达

根据制造商说明，使用PAXgene血液RNA试剂盒(Quiagen, Valencia, CA, USA)从PAX基因收集管中存储的外周血中提取总RNA。使用nanodrop 200分光光度计(Fischer Scientific, Madrid, Spain)在260 nm处测定RNA浓度。本研究只考虑比例为260/280 nm >1,4的萃取物。使用Bioanalizer (Agilent technologies, Santa Clara CA, USA)对RNA完整性进行电泳评价。只有那些RIN值接近10的萃取物才被用于基因表达研究。

根据制造商的说明，使用TaqMan RT试剂(应用生物系统公司，福斯特市，CA，美国)合成cDNA。反应稀释1/2，使用TaqMan前置放大器主混合(应用生物系统公司，福斯特市，CA，美国)根据供应商说明进行预放大。根据需要对PGC-1进行检测α， CYTC, SOD和GAPDH购自Applied Biosystems公司，并在7900HT实时热循环仪(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)中进行基因表达。的比较方法计算纳入基因的相对表达量[<一个href="#B23">23]．

2．3.总抗氧化状态(TAS)测定

在血浆样品中使用总抗氧化测定试剂盒(Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA)按照制造商的说明进行TAS测定。该分析依赖于样品中抗氧化剂的能力，以抑制ABTS(2,2 ' -偶氮-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸])氧化的亚甲基肌红蛋白的ABTS+。样品中抗氧化剂防止ABTS氧化的能力与Trolox相比较，Trolox是一种水溶性生育酚类似物。结果用mM Trolox等效物表示。

２.４.谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性分析

根据供应商说明，使用GPX分析试剂盒（美国密歇根州安阿伯开曼化学公司）对血浆样本中的GPX活性进行了估计。血浆样品在样品缓冲液（随试剂盒提供）中稀释1/2，通过计算340℃时吸光度的变化来评估GPX活性 纳米(nm/min)，如试剂盒中包含的用户手册所描述。结果以nmol/min/mL表示。

2．5．数据分析

数据以平均值±SEM表示。采用GraphPad软件(GraphPad software Inc.， San Diego, CA)对结果进行非参数Mann-Whitney检验和非参数Spearman相关分析。意义被接受时．

3.结果

３．１．PGC-1αCYTC在PAH血样中表达

本研究的第一个目的是评估PGC-1的表达水平α与健康志愿者相比，PAH诊断患者血液中CYTC mRNA的表达存在差异。进行了基因表达分析，结果表明，这两种基因均未在健康献血者中表达，与PAH患者中的情况相反，在PAH患者中，两种基因的表达水平均被明确检测到。在或为了获得比较数据，平均计算PAH组的表达水平，并估算每个患者的表达水平。结果如表所示<一个href="//www.newsama.com/journals/omcl/2012/236572/tab1/" target="_blank">1．

３.２．超氧化物歧化酶(SOD)在PAH患者中的表达降低

测定肺动脉高压患者SOD表达水平。我们的结果表明，与健康志愿者相比，PAH患者中该酶的表达较低(分别为1.01-±0.61-和3.93-±0.89倍)，如图所示<一个href="//www.newsama.com/journals/omcl/2012/236572/fig1/" target="_blank">1(一)．接下来我们用类似于PGC-1的方法计算该基因的相对表达量α和CYTC，以确定其表达水平与疾病进展指标的相关性。得到的结果如表所示<一个href="//www.newsama.com/journals/omcl/2012/236572/tab1/" target="_blank">1．

３．３．PAH患者总抗氧化状态降低

缺氧是影响肺动脉高压患者的重要因素之一。由于PGC-1的相关性α我们决定分析纳入本研究的肺动脉高压患者的TAS。一方面，我们发现PAH患者的TAS水平低于健康供者(和mM，代表)，如图所示<一个href="//www.newsama.com/journals/omcl/2012/236572/fig1/" target="_blank">1 (b)．另一方面，我们发现TAS水平与PGC-1的相对表达水平存在明显的相关性α如第3.5点所述。表中总结了肺动脉高压患者TAS水平<一个href="//www.newsama.com/journals/omcl/2012/236572/tab1/" target="_blank">1．

3．4．PAH患者谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性降低

测定了肺动脉高压患者和健康供体血浆中GPX酶的活性。得到的结果如图所示<一个href="//www.newsama.com/journals/omcl/2012/236572/fig1/" target="_blank">1 (c)并清楚地证明与健康志愿者相比，PAH患者的这种酶活性降低(和nM /分钟/毫升,职责)。GPX活性总结见表<一个href="//www.newsama.com/journals/omcl/2012/236572/tab1/" target="_blank">1．

3．5．IPAH患者临床、分子和生化特征的多元回归分析

最后，采用非参数Spearman检验对临床、分子和生化数据进行多元回归分析。相关矩阵如表所示<一个href="//www.newsama.com/journals/omcl/2012/236572/tab2/" target="_blank">2．关于PGC-1α，结果汇总如图所示<一个href="//www.newsama.com/journals/omcl/2012/236572/fig2/" target="_blank">2．我们发现年龄、PAP和PVR之间呈负相关(图)<一个href="//www.newsama.com/journals/omcl/2012/236572/fig2/" target="_blank">2(一个)，<一个href="//www.newsama.com/journals/omcl/2012/236572/fig2/" target="_blank">2 (b),<一个href="//www.newsama.com/journals/omcl/2012/236572/fig2/" target="_blank">2 (d)）．这种相关性对PAP和PVR (P= 0.0001,P= 0.0426，分别)，但年龄(P= 0.108)。相反，CI为正相关，、CYTC、SOD的相对表达量、TAS、GPX活性(图)<一个href="//www.newsama.com/journals/omcl/2012/236572/fig2/" target="_blank">2 (c)，<一个href="//www.newsama.com/journals/omcl/2012/236572/fig2/" target="_blank">2 (e)，<一个href="//www.newsama.com/journals/omcl/2012/236572/fig2/" target="_blank">2 (f)，<一个href="//www.newsama.com/journals/omcl/2012/236572/fig2/" target="_blank">2 (g)，<一个href="//www.newsama.com/journals/omcl/2012/236572/fig2/" target="_blank">2 (h),<一个href="//www.newsama.com/journals/omcl/2012/236572/fig2/" target="_blank">2(我)）．在所有情况下，更改被认为是显著的。PGC-1之间无相关性α水平和6 MWT，仅与患者的年龄显著相关。

4.讨论

在本研究中，我们分析了PGC-1的表达水平α12例ipah确诊患者和15例健康献血者外周血中CYTC、SOD mRNA及TAS、GPX活性的变化我们的结果表明PGC-1的mRNAαCYTC可通过实时RT-PCR在PAH患者中检测到，但在健康志愿者中检测不到。另一方面，与对照组相比，这些患者中SOD的相对表达水平下降，TAS和GPX活性下降。相关研究表明PGC-1之间存在明显的相关性α水平和本研究包括的临床参数，表明疾病的进展和患者的氧化状态。我们发现PGC-1的表达水平呈负相关α与年龄、PAP、PVR呈正相关，且与CI呈正相关，提示患者PGC-1水平较高α心肺功能有改善。结果部分指出，6 MWT与PGC-1之间没有相关性α的水平。一种可能的解释是，这个参数受其他因素的影响，如患者的年龄[<一个href="#B24">24]．

PGC-1α是一种转录辅激活因子，已被证明在低氧血症下激活广泛的转录因子并调节编码线粒体蛋白（包括CYTC）的基因，如动物模型所示[<一个href="#B25">25- - - - - -<一个href="#B27">27]．这里的结果表明PGC-1的表达水平之间有很好的相关性α和ipa患者循环血液中的CYTC，支持这些发现。

IPAH的特征是持续缺氧，导致细胞损伤并导致右心室衰竭[<一个href="#B9">9，<一个href="#B10">10]．TAS决定了生物系统对氧化介导事件的反应能力。这种状态代表了氧化剂和抗氧化剂分子之间的平衡。我们发现，与健康供者相比，IPAH患者的TAS显著降低。尽管获得的结果一致，但在我们的知识下，这是第一个表明IPAH患者减少的研究。

SOD是最重要的抗氧化酶之一，它在慢性缺氧下表达减少[<一个href="#B30">28]．这些发现与肺动脉高压患者与健康志愿者相比SOD的下降相一致。超氧化物歧化酶(SOD)过表达可防止小鼠和原代人内皮细胞缺氧诱导的肺动脉高压中PH的发展并改善已建立的PH [<一个href="#B31">29]．我们观察到PGC-1之间有很好的相关性α和SOD的表达水平，这可能支持该抗氧化酶在IPAH发病机制中的作用。

另一种控制氧化损伤的关键酶是GPX，正如在IPAH患者的肺中观察到的那样[<一个href="#B32">30.]．与SOD发生的情况类似，我们观察到IPAH患者与健康供体相比，这种酶的活性显著降低，并且与PGC-1的表达水平呈正相关α，这与氧化酶病中这种转录共激活因子的抗氧化作用一致[<一个href="#B16">16]．

本研究纳入的所有患者均采用不同的药物组合治疗，包括钙通道阻滞剂、内皮素受体拮抗剂、PDE5抑制剂和前列环素合成类似物。虽然这种处理方法降低氧化剂水平的效果众所周知[<一个href="#B33">31- - - - - -<一个href="#B35">33]，由于本研究纳入的患者数量有限，治疗方法的异质性使得很难得出药物对改变抗氧化/氧化状态的影响的结论。然而，无论采用何种治疗方法，本研究中考虑的所有患者均为轻度/中度低氧血症。需要更多的研究，包括新发患者和用药前后情况的比较，以了解治疗对低氧血症状态的影响以及与PGC-1控制的机制的关系α．

本研究的主要局限性是纳入的患者数量，然而IPAH是一种罕见疾病，每年发病率为2-3 /百万[<一个href="#B36">34]．这里提供的数据表明PGC-1可能的作用α在控制疾病进展和IPAH患者的氧化状态方面本研究提示循环PGC-1的监测αmRNA水平可以指示疾病的进展，为治疗疗效和疾病进展的严重程度等参数提供有价值的信息。另一个重要方面是对循环PGC-1的监测α包括对病人没有风险的非侵入性手术，而且可以以一种快速和经济的方式进行。基于这些原因，我们提出了PGC-1α作为PAH进展的一个潜在的新的生物标志物。

致谢

这项工作得到了西班牙科学和创新部和西班牙政府“卡洛斯三世”卫生研究所的PI10/02294 (M. Mata)、SAF2008-03113 (J. Cortijo)和CIBERES (CB06/06/0027)的资助，以及地区政府的研究资助(GV2007/287和AP073/10, Generalitat Valenciana)。

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