文摘

先天性耳聋残疾的最常见原因之一人类,和超过一半的病例是由遗传因素引起的。突变的MYO15A基因是第三个最常见的遗传性听力损失的原因。使用新一代测序结合听觉测试,两个新颖的复合杂合变异体c.2802_2812del / c。5681 t > C和c.5681T > C / C。6340 g > AMYO15A基因被发现在渊源者从两个不相关的中国家庭。听觉表型的渊源者与隐性变量之前报道的一致MYO15A基因。这两个新变种,c。2802年_2812del和c。5681T>C, were identified as deleterious mutations by bioinformatics analysis. Our findings extend theMYO15A基因突变谱和提供更多的信息,用于快速和精确的分子诊断先天性耳聋。

1。介绍

先天性耳聋是一种最常见的出生缺陷,与一个发病率约为1.4每1000新生儿筛查。超过60%的新生儿先天性耳聋可以归因于遗传因素1]。这些病例nonsyndromic听力损失(NSHL)和常染色体隐形遗传占80%的NSHL [2]。GJB2,SLC26A4,MYO15A的三大常见基因遗传性听力损失(3,4]。突变MYO15A基因被发现导致常染色体隐性nonsyndromic听力损失3 (DFNB3) [5),新基因的突变是不断被发现。

的MYO15A17号染色体上基因跨越71 kb的基因组DNA p11.2。它包含66个外显子和编码非常规myosin-XV蛋白由3530个氨基酸(6]。编码的蛋白主要定位在哺乳动物的毛细胞静纤毛,在静纤毛的发展起着至关重要的作用和正常听觉功能的形成7,8]。这股票结构组织组成的n端结构域,一个腺苷三磷酸酶电机领域,与肌球蛋白轻链绑定颈部区域,一个球状尾巴域(6,9]。一种蛋白质的完整性起着关键作用的功能。因此,删除打断了一个终止密码子突变可能导致致病蛋白质。此外,超过40个错义突变已确定在运动领域的MYO15A基因与常染色体隐性nonsyndromic听力损失(ARNSHL),大多数突变发生的地方。在小鼠模型中,突变在电机领域的结果较短的静纤毛结构异常楼梯导致耳聋(4]。

听力筛查结合基因诊断可以帮助我们认识更多的致病基因突变。的突变谱MYO15A基因是高度异构是指两个杂合变异体在反式构型在相同的基因组区域。通过两个独立的研究MYO15A基因突变的家庭,我们确定了两个新的化合物的杂合突变:c.2802_2812del / c。5681 t > C和C / c.6340G c.5681T > >。此外,已知的致病变种的c。6340G>A provides more evidence to deduce the pathogenicity of the first two novel mutations by the verification between pedigrees.

2。材料和方法

2.1。家庭的描述

在这项研究中,两个中国家庭影响先天性NSHL招募。这两个中国家庭包含三名家庭成员(女儿/儿子,母亲,和父亲),分别。受影响的家庭成员II-1 1(图1(一)):一个两岁的女孩,没有通过听力筛查和诊断为先天性NSHL。的渊源者II-1家庭2(图1 (d)):一年和5个月大的孩子男孩,患有先天性NSHL。其他个人没有听力障碍的历史。

2.2。临床检查

所有受影响的家庭成员进行临床评价耳鼻喉科学部门,工会医院、同济医科大学、华中科技大学,武汉,中国。一系列的听力学检查渊源者,其中包括耳镜检查的检查,行为观察听力测定(BOA),听觉导抗,听觉脑干反应(ABR),听觉稳态诱发反应(ASSR)和畸变产物耳声发射(DPOAE)。DPOAE检测在750、1000、1500、2000、3000、4000、6000和8000赫兹的频率。听力损失的程度定义为轻度(26-40 dB霍奇金淋巴瘤),中等(41-55 dB霍奇金淋巴瘤),中度严重(56 - 70 dB HL)、严重(71 - 90分贝霍奇金淋巴瘤),而深刻的(> 90分贝霍奇金淋巴瘤)。计算机断层扫描(CT)扫描和MRI(磁共振成像)也进行渊源者。此外,体检也执行排除其他系统性疾病。渊源者的父母提供家族病史和临床调查问卷,从全家获得知情同意是包含在这项研究。

2.3。突变检测和分析

HDNPL_9957712After获得知情同意,3 - 5毫升外周静脉血样从门店的所有家庭成员获得+ Sanger测序。从血液样本中提取基因组DNA是根据制造商的标准程序使用QIAamp DNA血液Midi设备(试剂盒Inc .)、希尔登,德国)。琼脂糖凝胶电泳进行评估的质量和数量根据常规DNA样本协议。DNA的渊源者进行whole-exome测序。Whole-exome捕获了使用BGI-Exome工具包V4和测序BGI-seq500 100 bp paired-end测序。人类基因组测序读收集和对齐参考(UCSCGRCh37 / hg19)的burrows - wheeler对准器(BWA-MEM,版本0.7.10)[10]。为了验证突变渊源者中确认并确认他们cosegregation血统,家庭的所有成员的DNA进行桑格测序。后聚合酶链反应(PCR)扩增,纯化扩增片段,桑格测序ABI3730xl DNA序列和执行结果分析利用测序分析5.2软件(热费希尔科学、美国)11]。变异是指HGVS发布的名字命名指南(http://www.hgvs.org/mutnomen)。已发表在我们先前的研究方法(12,13]。

2.4。致病性变化的预测

几种不同的计算机算法被用来预测错义的致病特性变异:MutationTaster (http://www.mutationtaster.org/),PROVEAN (http://provean.jcvi.org/)和PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)。PROVEAN分数表示有害的和中性的函数,与一组截止得分为-2.5。PolyPhen-2分数范围从0.0到1.0。得分0.0,变异的预计是良性的。值接近1.0更自信地预测是有害的。系统发育分析不同的序列比对是由Clustalω(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)。的同源MYO15A蛋白质序列包括鼠标、黑猩猩、老鼠和猕猴。突变检测在1000基因组数据库,dbSNP数据库,数据库(ExAC)和外显子组聚合财团。致病性变异的分类是基于2015年ACMG指南(14]。

3所示。结果

3.1。临床数据

3.1.1。家庭1

的渊源者II-1家庭1测试结果如下。美国银行显示可怜的听力,声导抗测试结果表明,该tympanograms类型(左耳)和类型(右耳)。ASSR的阈值是80分贝nHL在500赫兹,90分贝nHL 1 kHz, 100分贝nHL 2 kHz,和100分贝nHL 4千赫(右耳)和90 dB nHL在500赫兹,60 dB nHL 1 kHz, 110 dB nHL 2 kHz, 110分贝nHL 4千赫(左耳)(图1 (b))。双耳的波V的ABR阈值是90分贝,和DPOAE缺席双边(图1 (c))。Tympanogram表示几乎正常中耳的函数。颞骨CT扫描显示中间的渊源者没有任何畸形或内耳。

3.1.2。家庭2

家庭2的渊源者II-1遭受深刻的听力损失,由听觉显示考试。双耳的波V的ABR阈值提取在105分贝。ASSR的阈值都是100分贝nHL在每个频率(图1 (e)每只耳朵),双边DPOAE缺席(图1 (f))。Tympanogram透露一种曲线显示中耳的正常功能。颞骨CT扫描和核磁共振显示没有明显的异常。没有家族史的先天性耳聋和没有潜在的环境导致的听力损失。详细的临床资料总结了表1。

3.2。突变的识别和分析

使用耳聋面板测序,基因159位点的22导致先天性耳聋被排除在外。Whole-exome测序结果与人类基因组(GRCh37 / hg19)的引用。我们发现小说c.2802_2812del / c复合杂合的突变。5681 t > C家庭1和c.5681T > C / C。6340 g > A家庭2。在家庭1中,c。2802_2812del mutation, which was located in exon 2 and passed on from her clinically normal father (Figure2(一个)),导致n端结构域(p.Gln937Leufs移码变化39)和截断mRNA翻译导致缺乏完整的氨基酸序列。发生在外显子24,c。5681T>C mutation, which was inherited from the unaffected mother (Figure2 (b)),导致一个替换从亮氨酸脯氨酸在atp酶氨基酸位置1894电机领域(p.Leu1894Pro)。他们两个都预测有害变异的基础上,计算机算法PolyPhen-2和PROVEAN(表的结果2),这两个变异数据库dbSNP没有公开露面,1000人基因工程,ExAC。根据美国医学遗传学和分子病理学Genomics-Association (ACMG-AMP)指南,c的变体。2802年_2812del和c。5681T>C were classified pathogenic (PSV1+PM2+PM3+PM4+PP3) and likely pathogenic (PM2+PM3+PP3), respectively.

有趣的是,c的变体。5681T>C (p.Leu1894Pro) was also found in Family 2 and his unaffected father, and another variant was a reported variant c.6340G>A (p.Val2114Met) in exon 30, which was also detected in his mother (Figure2 (c))。突变c。6340 g > AMYO15A基因,一个已知的致病错义突变,导致一个交替的缬氨酸和蛋氨酸在氨基酸位置2114 MyTH4域。c。6340G>A mutation was previously reported in another Chinese family and in two Egyptian families which is predicted to weaken the function of MyTH4 [15,16]。这是有害的预测计算工具。ACMG指南后,c。6340G>A variant was classified as pathogenic (PVS1+PM2+PM3+PP1+PP3). Detailed information of variants is shown in Table2。

3.3。突变蛋白的功能分析

Myosin-XV与其他肌凝蛋白蛋白质的不同之处在于,它有一个长n端扩展前面的守恒的运动区域。它包括一个n端结构域由巨大的编码外显子2(图3(一个))、腺苷三磷酸酶电机领域,包括三个智商图案的杠杆臂,尾巴和球状域包含MyTH4丰贸,SH3, PDZ配体(图3 (b))。突变的位置在这个研究已经显示在图4。突变c。2802_2812del identified in the proband II-1 of Family 1 results in a frameshift, and no. 975 amino acid was converted into a termination codon, which generated a truncated protein (Figure4(一))。进化保护结果证明是高度保守的氨基酸残基的突变网站在多个物种(图4 (b))。这强烈表明的重要性这些残留的正常功能的蛋白质。

4所示。讨论

内耳毛细胞(高碳钢)贡献声波转换成电信号(17- - - - - -21]。听力损失是全世界的一个主要障碍,这通常是由不可逆损失的感官高碳钢和螺旋神经节神经元的变性。先天性听力损失可能是由遗传因素引起的,耳蜗感染、耳毒性的药物,和噪声暴露,遗传因素占60%以上的先天性听力损失(22]。每个耳蜗毛细胞有一束actin-based静纤毛检测声音。的MYO15一个基因编码一个非传统的耳蜗中表达的肌球蛋白,运输量和提供所需的关键分子静纤毛发展,从而为构建mechanosensory至关重要的头发包(7,23,24]。小鼠模型的研究表明MYO15A突变会导致听力功能异常引起的静纤毛和损失的正常楼梯在毛细胞静纤毛的结构25,26]。

突变c。2802_2812del results in a truncated protein caused by the frameshift. Like many previously reported pathogenic truncating mutations in theMYO15A基因,c。2802_2812del variant is predicted to result in a truncated protein product without motor, IQ, MyTH4, FERM, SH3, and PDZ domains. Since DFNB3 is an autosomal recessive disorder and the proband’s father is a heterozygous carrier, we strongly speculate that the variant c.2802_2812del might cause hearing loss related to the incomplete protein structure. A previous study indicated that pathogenic mutations that reside in the N-terminal domain are associated with a variety of mild hearing loss phenotypes [27- - - - - -29日]。结合其他研究[30.),我们的研究表明,截短突变c。2802年_2812del的n端结构域MYO15A基因可能导致严重的表型。这些证据表明听觉表型由于的多样性MYO15A变化(31日]。

c。5681T>C mutation leads to a single substitution from leucine to proline at amino acid position 1894. This variant is located in the motor domain of theMYO15A基因。我们的文献综述说明运动域是一个热门地区的影响MYO15A变异和越来越多的变种被发现在这一领域(32,33]。这个区域包含肌动蛋白和ATP生成力结合位点运输体外(肌动蛋白丝34]。它是合理的,电机领域功能障碍会导致异常的静纤毛与严重耳聋表型有关。机制最近的一项研究显示,myosin-XV电机领域可能出现应变敏感性,这表明它还可以作为力敏元件桥接膜和肌动蛋白细胞骨架静纤毛小费,反过来,让人类耳聋的重要影响MYO15A突变(24]。深刻的听力损失和零DPAOE反应可能是由于这本小说的复合杂合的基因突变MYO15A基因。c。6340G>A mutation is a known disease mutation (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs377385081)由杨等人在2013年首次报道(15]。在杨的研究中,biallelic突变c.6340G > A / c。6956+9C>G were also found in the proband’s deaf relatives for which they were identified as disease mutations. The c.6340G>A mutation is a missense mutation resulting in an alternation of a Valine with a Methionine at amino acid position 2114 in the first MyTH4 domain in myosin-XV. The MyTH4 domain of myosin has some roles in microtubule as well as actin binding at the plasma membrane. Mutations in this domain can disrupt the protein-protein interaction which is important for the normal function of hearing [35,36]。

在这里,我们发现c。5681T>C was compound heterozygous with c.2802_2812del and c.6340G>A in these two irrelevant pedigrees. We concluded the c.5681T>C variant to be pathogenic for several reasons: (a) the amino acid residues at the mutation sites were highly conserved; (b) several pathogenic mutations have been found near this location; (c) detected in 2 sporadic pedigrees with similar DFNB3 phenotype; (d) theMYO15A基因是高度异构和c。6340G>A mutation is a known disease mutation, which combined with c.5681T>C causing deafness. Moreover, both the 2 novel mutations were cosegregated with the profound deafness and were predicted to be pathogenic mutations by computer algorithms. These all suggested that c.5681T>C is a relevant and pathogenic mutation in theMYO15A基因的深刻渊源者的听力损失。

总之,我们的研究表明,两种复合杂合的突变MYO15A基因(c.2802_2812del / c。5681T>C and c.5681T>C/c.6340G>A) were the pathogenic variants in two ARNSHL families. The c.2802_2812del and c.5681T>C mutations are reported for the first time, and both were strongly speculated as pathogenic mutations in theMYO15A基因。我们的发现进一步扩展了MYO15A基因突变谱的genotype-phenotype相关性和丰富了我们的知识MYO15A有关的耳聋。

数据可用性

数据支持我们的研究的结论是可用的。

同意

书面知情同意参加本研究提供的参与者的法定监护人。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

肖惠,森勒谢,陈的贡献同样对这项工作。

确认

作者感谢家人的参与这项研究。这项工作是支持由中国国家自然科学基金(81771003和81771003)。