h的非经典的角色α-syn (A53T)在帕金森病发病机制中的作用:突触病理和神经元老化

抽象

帕金森病的运动和非运动症状涉及几个脑区。但是，是否α从SNC -syn病理学始发可直接导致在遥远脑区的病理变化，并诱导PD相关症状仍不清楚。在这里，AAV9-突触-mCherry的人SNCA（A53T）注射到小鼠的黑质致密单边。运动功能和嗅觉灵敏度进行了评价。我们的研究结果表明AAV9-突触-mCherry的人SNCA在黑质致密持续表达。动物表现为轻度运动和嗅觉障碍在病毒注射后7个月。黑质致密的病理学的特征是伴有ER应激多巴胺能神经元的损失。在纹状体，Hα-syn表达很高，CaMKβ-2和NR2B表达降低，并且活性突触减少。在嗅球中，hα-syn高表达，二尖瓣层衰老细胞增多。结果表明，hα-syn在纹状体和OB中沿源于SNc的神经纤维运输，并在大脑远端引起病理改变，从而导致PD的运动和非运动症状。

1.介绍

帕金森病(PD)的典型病理特征是异常构象α-syn与Lewy体的形成（LBs）[1-3]. 单体α-syn是生理条件下是可溶的和展开。α-syn易于形成α螺旋结构时，其N-末端结合于细胞膜的磷脂[4]. 在病理条件下，α-syn最初形成可溶性低聚物，也被称为profibrils，在电子显微镜下是具有线性形态的球形和环状分子[五]. 逐渐地，profibrils变得不溶并相互结合形成纤维[6]. A53T和A30P突变α-syn比野生型有更高的聚集成纤维的可能性[7]。α-syn纤维也可以沉积在神经细胞中形成包涵体，称为LBs（在细胞体内）和Lewy神经突（LNs，在神经元的末端）[6]。在过去的半个世纪中，LB中逐渐被用作PD患者的神经病理学标记[8-10个]。α-syn可以形成LBs和LNs，破坏神经元和突触，导致运动和非运动功能障碍[11个-13个]。

在帕金森病的发展过程中，LBs逐渐分布在大脑的各个区域。LBs首先出现在嗅球、黑质、皮质和其他脑区[14个，15个]。Braak和德尔Tredici发现形成的LBα-syn被规则地分布在散发PD患者的大脑。在早期阶段，LBs的第一次出现在迷走神经和嗅球的背核，然后在基底核和中脑，最后在新皮质的广域[16个]. 脑区LBs的分布与PD患者临床症状的多样性一致。这些病人首先表现出非运动症状，如嗅觉和睡眠障碍，随后在后期表现出运动症状[17岁-19个]。虽然Braak发现在PD患者中，LBs的病理从一个脑区逐渐出现到另一个脑区，但出现的频率较高α-特定脑区的syn，如SNc，仍不清楚。近年来，研究表明，LBs的病理学进展与朊病毒的传播相似，即，α-syn错误折叠的蛋白质可以从一个大脑区域转移到另一个，然后沉积[20个-22个]. 这种情况得到了胚胎神经元移植治疗帕金森病患者的支持，在移植的胚胎神经元中发现了LBs。四个单独的尸检报告了LBs的存在α-syn为主要成分，移植后10 ~ 22年在多巴胺能神经元中被废黜[23个-26个]。

尽管LBs或LNsα-syn作为主要成分可广泛分布于多个脑区，对神经元损伤的敏感性似乎主要集中在SNc的多巴胺能神经元[27个，28个]. 迄今为止，与选择性神经变性有关的机制仍不清楚。尽管人们提出了多种多样且频繁的相互作用机制，包括线粒体功能障碍、蛋白质处理不当、炎症、氧化应激、遗传和环境因素以及正常衰老，但其死亡的病因仍不清楚[29个-32个]。这些因素不一定局限于黑质多巴胺神经元，但包括其他类在其他脑区的神经元。从SNC或其他脑区域中的初始风险因素不能区分基于以hα-syn (A53T)转基因小鼠。因此，本研究在SNc右侧注射AAV9-synapsin-human SNCA (A53T)病毒。注射后7个月，观察右侧嗅球和右侧纹状体的病理变化。

SNc中的多巴胺神经元投射到纹状体，形成突触连接。是否h的连续表达式α-syn多巴胺黑质致密的神经元受到影响在纹状体突触功能，因此蛋白激酶的表达β-2和NR2B进行了评价，其中蛋白激酶β-2是与突触前小泡释放[33个]NR2B与突触后膜NMDA受体的功能有关[34个]，而CREB是一种与突触可塑性密切相关的分子[35岁]. 考虑到纹状体多巴胺投射功能与多巴胺受体分布有关，测定了纹状体D1R和D2R水平。此外，用电镜结合半定量技术分析纹状体突触结构的变化，以评价连续高表达hα在从功能和结构方面纹状体-syn上突触可塑性。GRP78和CHOP是内质网应激的重要调节由蛋白的积累所致[36个]. 本研究旨在揭示hα-syn（A53T）在黑质致密部上遥远的大脑区域，例如纹状体和嗅球，其病理机制，以及是否h的高表达α-syn（A53T）在黑质致密部可直接引起的运动功能障碍和嗅觉灵敏度受损。

2。材料和方法

2.1条。动物

雄性C57BL/6小鼠，体重约20–22 g，购自兰州大学实验动物中心。所有动物均在22°C至25°C、40%-60%湿度和12小时光照周期的标准条件下饲养，可随意喂养和饮用。将小鼠分为实验组和对照组。实验鼠在右侧SNc注射AAV9突触蛋白人SNCA（A53T），对照鼠在右侧SNc注射AAV9突触蛋白mCherry。所有动物实验方案均经兰州大学动物伦理委员会批准。

2.2。试剂

异氟醚来源于深圳市龙华生命科学有限公司。AAV9-synapsin-human SNCA (A53T)和AAV9-synapsin-mCherry由瑞珍生物科技有限公司(山东，中国)开发。兔抗grp78、抗th、抗p62多克隆抗体购自Abcam (Cambridge, UK)。兔多克隆抗chop，抗-β-camkII和抗NR2B抗体是从中国南京Bioworld科技有限公司购买的。小鼠单克隆抗GAPDH抗体购自美国德克萨斯州Immunoway生物技术公司。聚偏氟乙烯（PVDF）膜和ECL试剂均取自美国马萨诸塞州贝勒丽卡市的微孔。RNAiso Plus、cDNA反转录试剂盒和实时PCR（RT-PCR）混合物购自TAKARA生物技术有限公司（大连）。

2.3。立体定向注射

常规异氟醚麻醉下应用立体定向仪进行病毒立体定向注射。右SNc注射aav9 -synapsin- mchery -human SNCA (A53T)或AAV9-synapsin-mCherry (500 nl)(配位:AP， - 3.2 mm;毫升,1.2毫米;使用注射泵以慢速率(125 nl/min)注射。注射结束后5分钟，取出注射针。通过制备切片，确定了所有小鼠的注射部位和病毒感染性的准确位置。

2.4。性能试验

2.4.1。旷场测试（OFT）

旷场试验（OFT）通过使用OFT-100仪器（台门，中国成都）进行。实验箱的尺寸为  cm. During the experiment, the mice were placed in the experimental box, and the freezing time, movement distance, and residence time in the middle area of the box were recorded for 5 min.

2.4.2条。气缸试验

在自发运动前肢不对称性通过使用基于先前描述的气缸试验进行评价。该animal was placed in a transparent cylinder, and its progress was recorded for 10 min. Two mirrors were placed behind the cylinder to facilitate recording of all forelimb touches. The forelimb touch times were recorded and counted in 10 min, and the ratio was calculated as follows: 。

2.4.3。波兰人后裔

为了便于动物的抓握，在家中的笼子里放了一根0.5 m长、直径1 cm、用非粘性的架子衬垫包裹的柱子。我们遵循了Tim Arentsen等人的方法。[37个]。简单地说，从动物杆的顶部，并进入家庭笼接受两天的培训下降。动物在训练的第一天定的三项试验。将它们置于他们的头倒在第一试验中，在第二个试验中的距离的2/3的底板上方的距离的1/3，并且放置在所述第三试验的顶部。在培训的第二天，给予动物三次试验下降与他们的头，从杆的顶部向下。在测试当天，将动物置于他们的头倒在杆的顶部，并定时对自己的方式回到家里笼。计时开始时公布的实验者对动物和结束时，一个后肢传到家乡笼底座。

2.4.4条。嗅觉测试

嗅觉偏好测试是在先前描述的基础上进行的，并进行了修改。测试箱的底部(  cm大小）被木屑覆盖。实验前，老鼠禁食24小时。嗅觉习惯训练进行如下：100 μl peanut butter (0.6 g dissolved in 1 ml distilled water) was set on a cm滤纸，放置在测试盒的一侧。小鼠在试验箱中停留15分钟后，返回原来的笼子。5 min后，再次将小鼠置于试验箱中，待15 min。30分钟后进行嗅觉测试。首先，滤纸用100μl将蒸馏水埋在木屑下，并记录小鼠发现滤纸的时间作为对照。第二，滤纸用100 μ升花生酱被替换而根据木片掩埋，并检测出直到小鼠的时间长度的滤纸被记录下来。

2.4.5。食品埋葬实验

食物埋葬试验是根据先前的描述进行的。测试箱的底部(  cm size) was covered with wood chips, and 15 pieces of chow food were buried in the wood chips. After fasting for 24 hours, the mice were placed in the test box, and the length of time the mice found all the chow food was recorded.

2.4.6条。三室式社会接近任务

社交性和社会认知在三腔的装置进行了评价，如先前所描述。明确有机玻璃的矩形三室框分成三个相等大小的腔室（  厘米）。分隔房间的墙壁有一个小的长方形开口(  cm），提供通往相邻腔室的通道。根据需要，使用透明矩形有机玻璃门关闭开口。试验开始时，在中间试验室进行一次短时间的习惯化试验（即1 min），无需进入任何一个侧试验室，然后在整个空箱中进行一次10 min的习惯化试验，可进入所有三个试验室。当实验者放置刺激物时，实验鼠被短暂地限制在中心室中。为了评估一只不熟悉的活体老鼠（体重、性别和应变与实验鼠相同）的社交方式行为，将一只先前习惯于网格封闭的新型C57BL/6老鼠（倒铁丝铅笔杯）放置在其中一个侧室中。另一边的房间里放着一个控制新颖的物体，一个完全相同的没有社会气味的空格子围栏。新物体和新鼠标的位置在物体左右两侧的腔室之间交替。将物体放置在侧室后，同时打开两个门口，允许试验鼠进入所有三个室10 分钟。试验10 分钟后，试验鼠很快又被限制在中心室中。为了评估社会认知能力，我们将一只新型的C57BL/6刺激小鼠放在先前包含空网格的小室中。将刺激物小鼠放置在各自的封闭空间中，打开门口，试验小鼠自由探索所有三个腔室10 min。在每个腔室中花费的时间和在封闭空间周围花费的时间（靠近新物体，新小鼠，或熟悉的鼠标）由一个摄像机直接记录在测试设备的正上方，并由一个自动跟踪系统进行分析。

2.5。脑组织的制备

在病毒注射后15天和3个月，随机从实验组和对照组各选取3只小鼠，观察病毒感染性和hα-检测syn表达。注射后7个月，首先测量小鼠的行为，每组小鼠随机分为3组，即动物组( ）用于准备特定脑区的新鲜组织，动物( ）用来准备大脑切片和动物( ）将被用于电子显微镜检查。

2.5.1条。新鲜脑组织的制备

小鼠接受3%戊巴比妥钠(45 mg/kg)的腹腔局部麻醉。取脑，在体视显微镜下分离右脑中脑和纹状体，用液氮冷冻，使用前保存于- 80℃冰箱中。

2.5.2。脑切片的制备

小鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠（45 mg/kg）局麻药。打开胸腔，0.9%生理盐水以30 rpm/min的速率灌注左心室3 min，然后以4%多聚甲醛以30 rpm/min的速率灌注2 min，然后以18 rpm/min的速率持续10 min，用4%多聚甲醛整夜固定整个大脑，放入20%和30%蔗糖中，直到它们沉入容器底部。25 低温恒温器系列截面图μ用低温恒温切片机进行m厚度测量。

2.6。免疫荧光

病毒注射15天后，选择SNc脑切片，用多克隆兔抗TH抗体（1 ： 200）37℃孵育1 h，4℃孵育过夜。用0.01 M磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗切片，并用第二抗体（1 ： 100）与FITC在37℃下结合孵育1 h。用0.01 M PBS冲洗切片并用DAPI染色。用荧光显微镜观察切片，计数SNc中TH标记神经元、mCherry阳性神经元、TH和mCherry标记神经元的数量。简单地说，根据George paxinos的小鼠脑图谱，选择了Bregma-2.7、Bregma-2.95和Bregma-3.2三个区间250 μm、 计算各组TH阳性细胞数，三组平均值代表一只小鼠SNc中TH阳性细胞数。

2.7条。免疫组织化学

选择SNc、纹状体和嗅球切片，用0.3%的过氧化氢(H₂Ø₂)去除内源过氧化物酶活性20 min。用0.01 M PBS多次洗涤后，切片在含有小鼠抗--α-syn (A53T) antibody (1 : 200), 0.3% Triton X, and 0.1% goat serum for 24 h at 4°C. The incubated sections were washed and incubated for 90 min in biotinylated goat antirabbit antiserum (1 : 200), followed by washing with 0.01 M PBS. Then, the sections were incubated with strep-avidin–biotin peroxidase complex (1 : 200) for 90 min and immersed in 0.02% 3,3-diaminobenzidine containing 0.01% H₂Ø₂in 0.01 M PBS for development.

2.8。电子显微镜

Glutaraldehyde (3% in PBS)-fixed dorsal striatum and SNc was postfixed with 1% OsO4 for 90 min and dehydrated with graded ethanol. The samples were then embedded with Epon 812 and polymerized at 72°C for 48 h. Four ultrathin sections (50–70 nm) were selected at every 1.0 μ每只小鼠间隔m，用醋酸铅和铀酰染色，用JEM1230显微镜观察（日本东京）。这些图像是用盖坦图像系统（纽约，美国）拍摄的。

2.9条。蛋白印迹

每组随机抽取4只小鼠，戊巴比妥麻醉，取右侧中脑和右侧纹状体，置于冰冷PBS中。样品在液氮中冷冻并均匀化，用含有蛋白酶抑制剂的萃取剂制备蛋白质组分。总蛋白（30 ）μ克）在10％SDS-PAGE分级分离并转移至PVDF膜。该membranes were blotted with anti-p62 (1 : 1000), anti-Grp78 (1 : 1000), anti-CHOP (1 : 1000), anti-CaMkβ-2(1:10 00)，抗nr2b(1:10 00)，抗gapdh(1:50 00) 4℃过夜。用0.01 M TBST冲洗后，用辣根过氧化物酶标记的二抗(1:5 00)印迹膜，用增强化学发光法观察免疫反应蛋白条带。

2.10条。实时PCR

根据制造商的说明，使用RNAiso-Plus试剂（Takara Biotech，Co.，Ltd.，Dalian，China）从右侧纹状体中提取总RNA。用无RNase的DNase去除DNA污染。以1 为原料合成cDNAμ根据制造商的说明，用M-MuLV逆转录酶提取g个RNA。使用PIKoREAl96检测器（美国热科学公司）进行定量RT-PCR。用SYBR-Green-PCR主试剂盒（美国Promega公司）按照制造商的说明，对3份反向转录cDNA样本中DR1、DR2和CREB的mRNA水平进行评估。小鼠CREB的引物为5个 -GACAACCAGCAGCAGAGTGGAGATG-3（正向）和5 -TGGATACTGGCTAATGGG-3型（反向）。小鼠DR1的引物为5 -GGTGGAGGAGGACTGGTGTCAA-3（正向）和5 -CTTGGAAATCACTTTGCCTGGA-3（反向）。小鼠DR2的引物为5 -CCTTCATCGTCACCCTGCTGG-3（正向）和5 -CTCCATTCCAGCTC CTGAG-3型（反向）。小鼠GAPDH引物为5个 -GCGAGACCCCACTAACATCAA-3（正向）和5 -GTGGTTCACACCCATCACAAA-3（逆转）。该assays were initiated for 5 min at 95°C, 40 cycles of 15 s at 94°C, and 1 min at 60°C. The threshold cycles of the target gene and GAPDH were calculated. The amplification of DR1, DR2, and CREB cDNA was normalized to the expression of GAPDH. The relative mRNA expression levels of CREB, DR1, and DR2 were calculated by using a 2^-ΔΔCT方法。

2.11。β加染色

选择嗅球切片，0.01 M PBS冲洗，1%多聚甲醛室温固定30min。用0.01 M PBS冲洗切片，用免疫组化染色β-gal kit according to the operation manual, and counterstained with 1% neutral red for 5 min. Finally, the sections were dehydrated and observed.

2.12。统计分析

数据表示为 。单因素方差分析用于多组比较，Tukey的事后分析用于评估配对组的显著性。在所有的分析中， 被认为是重要的。

3.结果

3.1。h高表达α-syn在黑质致密

分别于病毒注射后15天、3个月、7个月，用荧光显微镜观察同侧SNc中mCherry阳性细胞，并与对照组比较α用抗h的检测同侧黑质致密-syn表达αsyn (A53T)抗体。结果表明，可以观察到mchry阳性细胞，其中mCherry和TH标记的细胞约占总mchry阳性细胞的85%(图2)图1（a）和图1（b））在病毒注射后15天。这些的mCherry阳性细胞从15天逐渐增加至3个月和病毒注射后7个月。3个月（图后阳性细胞的数目是在病毒注射比7个月后更高图1（c）和1（d）). 病毒注射后3个月，hα-syn表达在黑质致密显著增加了与AAV9-突触-mCherry的人SNCA（A53T）与动物相比，用AAV9-突触-mCherry的注入（图注入1（e）中和一（f）)。在病毒注射，H 7个月后α-syn在SNc中的表达增加（图1（克）和1（小时）). 这些结果表明，AAV9突触在人源性SNCA（A53T）中持续作用，并产生了一种新的神经递质α-syn（A53T）蛋白。

3.2条。病理学特征α-syn在黑质致密

在右侧SNc注射AAV9突触蛋白mCherry人SNCA（A53T）7个月后，SNc中TH阳性细胞减少约35%（图图2（a）和图2（b））与对照组比较。在电子显微镜下观察到黑质致密的神经元，并且包含体样结构（图2（c））在H中观察到αsyn组。采用WB法检测自噬调节蛋白p62，结果表明，自噬调节蛋白中p62的表达水平显著升高α-syn组比对照组中（图2（d）和2（e）). 结果表明，在正常对照组和正常对照组中，Grp78和CHOP蛋白的表达水平明显高于正常对照组α-syn组优于对照组（图2（f）-2（小时）). 这些结果表明High expression of hα-syn在黑质致密导致异常溶酶体降解，内质网应激和多巴胺神经元的损失。

3.3。h的影响α-同侧纹状体上的syn

在AAV9-突触-mCherry的人SNCA（A53T）或AAV9-突触-mCherry的，mCherry的阳性纤维的注射后3个月（图3（甲）)在同侧纹状体中发现。小时α-用抗-h抗体检测同侧纹状体syn的表达αsyn抗体。h的表达水平α-syn比对照组更高显著（图3（b）和3（c）)。在注射，mCherry的阳性神经纤维后7个月（图3（d））在纹状体中发现，和hα-syn表达明显高于对照组（图3 (e)和3 (f)). 这些结果表明neurons with high hα在黑质致密-syn表达可以在纹状体中突出，从而导致h的增加α-syn在纹状体中的表达和形成α-综合病理学。

3.4。h的影响。α-syn对纹状体突触结构和功能的影响

注射人SNCA（A53T）或AAV9突触后7个月，观察同侧纹状体突触可塑性相关分子和突触结构的变化。结果显示D2R和CREB的mRNA水平下降（图4（甲））和蛋白激酶的表达水平β-2和NR2B减少（图4（b）-4（e））在Hα-syn组与对照组比较。电镜观察并测量了纹状体突触结构的变化，每组60个非对称突触测量了突触前膜面积，结果显示，hα-syn组小于对照组（图4（楼）和4（小时）)。穿孔突触的比例计算，结果表明，穿孔突触的比例分别为约7％和28％在Hα-分别为syn组和对照组（图4（克）和4（一）). 这些结果表明α-syn病理学在纹状体导致突触可塑性和活性在纹状体的降低。

3.5。运动行为的变化

在注射后7个月，AAV9-突触-mCherry的人SNCA（A53T）或AAV9-突触-mCherry的注射的小鼠中检测到的运动行为。在小鼠中的自发性活动通过使用OFT测定，其结果表明，移动距离减小，不动时间的增加（图5(一个)-5（c））在Hα-syn组与对照组比较。通过极下降试验测量了发动机的性能，结果表明，在hα-syn组较对照组明显延长(图2)5（天）). 采用圆筒试验测定前肢的协调能力，结果表明，动物前肢提举次数明显减少（图5（e）），以及动物执行的右前肢触摸时间分别显著超过当它完成左前肢触摸倍（图5（华氏度））在Hα-syn组与对照组比较。这些结果表明，在Hα单侧SNc中-syn表达(A53T) 7个月后引起小鼠轻度运动功能障碍。

3.6条。h的影响α-syn在嗅球

在AAV9-突触-mCherry的人SNCA（A53T）或AAV9-突触-mCherry的，mCherry的阳性神经纤维的注射后3个月（图6（甲））在同侧嗅球中发现。Hα-抗h抗体检测同侧嗅球syn表达α-syn抗体，结果显示α-syn表达明显高于对照组（图6（b）和6（c）)。病毒注射后7个月，mchry阳性神经纤维(图6（天））在同侧嗅球中发现，和hα-syn表达明显高于对照组（图6（e）和6（华氏度）). 通过以下方法检测嗅球细胞的老化β-gal染色，结果显示β-嗅球二尖瓣细胞层gal阳性细胞在hα-syn组比对照组中（图6（克）和6（H）). 这些结果表明高hα-syn表达加速僧帽细胞在嗅球老化。

3.7。在嗅觉功能的变化

在AAV9-突触-mCherry的人SNCA（A53T）或AAV9-突触-mCherry的，要认识到的气味的能力进行了评价在注射后7个月。结果表明，直到小鼠的时间长度中发现的花生酱比显著短直到找到水两组（图7（甲）和7（b）). 结果表明，两组小鼠的嗅觉探索能力均正常。在食物掩埋实验中，小鼠发现食物的时间在hα-syn组较对照组（图7（c）)。基于记忆训练的量级上，检测到的气味的记忆能力，结果表明，直到小鼠的时间长度发现熟悉的气味较长在Hα-syn组与对照组比较（图7（甲）和7（天）)。此外，检测到嗅觉识别的基础上，社会行为，结果表明，时间由不熟悉的同种小鼠花费的长度比在两个组的同种熟悉鼠标的长（图图7（e）和图7（F）)，而不熟悉的小鼠在hα-syn组较对照组（图图7（G）)。

4.讨论

的研究α-当SNCA（编码）参与时，syn已成为PD研究的一个重要方面α-syn蛋白)基因突变于1997年首次报道于家族遗传性帕金森病发病机制中[38个]。一个转基因动物模型已经建立。虽然基于此动物模型的研究加深了对帕金森病病理的认识，但对其功能的认识还有待进一步深入α-syn，尤其是突变α-syn在PD病理形成中的作用尚不清楚[39个-41个]。高α-syn表达或PD在脑内的转归不能确定为PD的病因。我们的研究发现αAAV9-突触-mCherry的人SNCA（A53T）的在黑质致密部单侧注射后在黑质致密-syn表达式（A53T）在3和7个月增长。在注射后7个月，黑质致密部多巴胺能神经元的数量可能减少由于由小时细胞内蛋白质聚集和内质网应激α-同步（A53T）。此外，内质网应激依赖性凋亡被激活。为Hα-SNc神经元沿投射纤维进入纹状体后产生的syn（A53T）影响纹状体的突触结构和效率，提示这种现象可能是运动功能障碍的关键机制。hα从被输送到沿着突出纤维嗅球神经元黑质产生-syn（A53T）加速细胞在嗅球的二尖瓣层老化，可能有助于在嗅觉灵敏度的下降。

h的持续高表达α-syn（A53T）在SNc中以内质网应激、蛋白聚集、异常自噬和诱导内质网依赖性凋亡为特征，导致其病理性形成α-syn在黑质致密。这种情况可能导致在黑质致密部多巴胺能神经元的损失[42个-44个]。PD病理的大脑区域特异性不断吸引了相当多的关注，从研究人员。已经在不同的动物模型研究表明，多巴胺能神经元的黑质致密的伤害是显而易见的。这种情况可能是由于以下原因：首先，许多突触连接在多巴胺能神经元存在于黑质致密[45岁]。因此，神经元活动的频率高，并且伴随着高代谢。此外，在中脑多巴胺能神经元表达高的单胺氧化酶，它可以产生许多氧自由基是造成神经元损伤[46个]. 在这项研究中，我们排除了其他脑区仅通过感染SNc神经元对SNc病理形成的影响，这对于确定SNc的独立表达的影响很重要α-syn在黑质致密部上的病理形成PD的。

虽然PD病理学涉及转基因动物模型的基底神经节，无论是纹状体的病理形成引起多巴胺能神经元的黑质致密的伤害不能被确认，因为纹状体神经元也表达^ hα-syn（A53T）以hα-syn转基因小鼠。我们的研究证实了hα-syn（A53T）来源于纹状体上的SNc，在单侧SNc中使用定向病毒注射。注射后3个月和7个月，α-syn是在纹状体神经纤维表达。mCherry的标签证实，这些纤维起源于黑质致密。这些结果表明，在Hα-syn（A53T）在黑质致密部从神经元沿其投射纤维衍生纹状体影响纹状体神经连接。此外，电子显微镜结果显示，突触结构改变参与突触前膜面积和穿孔突触的背侧纹状体的比率降低，提示活性突触减少。

嗅觉功能障碍对PD的非运动症状有重要意义。然而，嗅觉功能障碍是否是由SNc神经元的病理学引起的尚不清楚。在这项研究中，hα-单侧SNc病毒注射后在同侧嗅球神经纤维中发现syn（A53T）。此外，mCherry标记证实这些神经纤维直接起源于SNc，从而表明SNc中多巴胺能神经元的发病机制通过投射纤维影响嗅球，加速了嗅球二尖瓣细胞层的细胞老化，随后导致嗅觉敏感度下降。

投射到纹状体和嗅球的神经纤维可能分别是PD运动功能改变和嗅觉功能障碍的直接原因。h神经元α-syn（A53T）在局部脑区的表达通过投射纤维影响远侧脑区的功能。h的病理沉积α-syn不仅影响突触结构，突触可塑性，和突触效率也加快神经老化在遥远脑区，从而指示这一现象可能是h的重要病理特征α-同步（A53T）。

以前的研究已经表明，α-syn可以跨脑传播[47个-四十九]。我们的研究表明hα-syn（A53T）黑质致密神经元中表达可在遥远的脑区沿突出的纤维到达。大多数研究认为，AAV只存在于受感染的神经元，这表明大部分H的α-syn (A53T)在大脑远端区域直接沿投射纤维分布[50个]. 然而，研究表明AAV具有跨突触的作用，这表明一些hα-syn（A53T）可能在两个以上的神经元中扩散到遥远的脑区[51个]。因此，主装置α-syn沿神经纤维从一个区域向另一个区域传播。

有许多类型SNCA突变，最高频率为A53T，A30P和E46K。该α-A53T突变编码的syn蛋白易于形成α螺旋结构，这取决于自噬溶酶体途径导致纤维化和积累，导致退化的功能障碍[52个]. 一致地，h的表达α-syn在纹状体和嗅球增加，在我们的实验时间。然而，这是很难区分的构象α-体内合成。

5个。结论

AAV9-突触-mCherry的人SNCA（A53T）在黑质致密的定向注射可诱导部分PD样病理和症状。h的高表达α-syn（A53T）黑质致密不仅导致在黑质致密的发病机制，但也降低在纹状体突触活动，并通过从SNC，纤维的投影加速细胞在嗅球老化从而导致在电机和非运动功能障碍PD发病机制的发展。

数据可用性

用来支持这项研究的结果的数据是可用的，请相应的作者。

的利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或金融关系的情况下进行的，这种关系可以被解释为潜在的利益冲突。

作者的贡献

庆郡王和安迪辰同等贡献这项工作。

致谢

这项工作部分是由中国国家自然科学基金（81570725号和81870949），以玉宏晶的支持。

补充材料

我们检测到了γ-嗅球中H2X的免疫组化检测，二尖瓣细胞中阳性细胞的水平与β-gal染色。结果显示γ位于嗅球的僧帽细胞层-H2X阳性细胞是在H显著更高α-syn组优于对照组（图S1 a和b）。图S1：（a）显示阳性的典型图像γ-病毒注射后7个月嗅球中的H2X。（b） 数量γ-H2X阳性细胞在病毒注射后7个月嗅球。 与对照组相比， 。我们提供了所有Western blot的原始图片。图S2：Western blot的原始图片。（A） 表示对照组，（B）表示hα-syn（A53T）基团。的（a）中脑P62的表达。（b）中的GRP78和中脑的表达CHOP。（c）中的Grp78的中脑的表达。（d）CHOP的中脑的表达。（E）蛋白激酶的表达β-2同侧纹状体。（F）GAPDH的同侧纹状体中的表达。（G）蛋白激酶的表达β-同侧纹状体2例。（h） 同侧纹状体NR2B的表达。（补充材料）

参考

1. M、 G.Spillantini，M.L.Schmidt，V.M.Y.Lee，J.Q.Trojanowski，R.Jakes和M.Goedertα共核蛋白的路易体”自然卷。388，没有。6645，第839-840，1997。视图:发布者网站|谷歌学术
2. 斯皮兰蒂尼先生、克劳瑟先生、贾克先生、长谷川先生和戈德特先生，”α共核蛋白在帕金森氏症和路易体痴呆路易体丝状包体”国家科学学院院刊，第95卷，不。11，页646 - 6473,1998。视图:发布者网站|谷歌学术
3. M、 Baba，S.Nakajo，P.H.Tu等人，“散发性帕金森病和路易体痴呆路易体中α-突触核蛋白的聚集”美国病理学杂志，第152卷，第4期，第879-8841998页。视图:谷歌学术
4. 五十、 Maroteaux和R.H.Scheller，“大鼠脑突触核蛋白；与神经元膜瞬时相关的蛋白质家族，”分子脑研究卷。11，没有。3-4，第335-343，1991。视图:发布者网站|谷歌学术
5. 五、 N.Uversky和D.Elizer，“帕金森病的生物物理学：α-突触核蛋白的结构和聚集，”当前蛋白质和肽科学，第10卷，第5期，第483-4992009页。视图:发布者网站|谷歌学术
6. 康韦、李、罗切特、丁天泰、威廉姆森和小兰斯伯里，“加速低聚化，而不是发蜡化，是两者的共同属性。α挂早发性帕金森病α-突触核蛋白突变：对发病机理和治疗意义，”国家科学学院院刊卷。97，没有。2，第571-576，2000。视图:发布者网站|谷歌学术
7. R、 A.Fredenburg，C.Rospigliosi，R.K.Meray等人，“E46K突变对α-处于单体和寡聚体状态的同核蛋白，”生物化学，第46卷，第24期，第7107-7118页，2007年。视图:发布者网站|谷歌学术
8. M、 Goedert，M.G.Spillantini，K.Del Tredici和H.Braak，“刘易氏病理学100年”自然评论神经，第9卷第1期1、2013年第13-24页。视图:发布者网站|谷歌学术
9. J. L.埃里克森，T. M.道森，D·W·迪克森，和L. Petrucelli，“当场抓获：α突触核蛋白在帕金森氏病的罪魁祸首，”神经元，第40卷，第3期，第453-4562003页。视图:发布者网站|谷歌学术
10. D. Chatterjee的M.巴特，D. Butler等人，“蛋白酶体靶向的纳米抗体减轻病理和功能下降在α-基于突触核蛋白的帕金森病模型NPJ帕金森病，第4卷，第1期，2018年。视图:发布者网站|谷歌学术
11. W. Peelaerts，L. Bousset，A.范德Perren等人。“α共核蛋白株引起局部和全身给药后不同的α-共核蛋白病”自然，第522卷，第7556号，第340-3442015页。视图:发布者网站|谷歌学术
12. P. Y.潘，朱Y.，Y.沉，和Z.悦，“帕金森病突触贩运和自噬之间的串扰，”神经生物学疾病，第122卷，第64-712019页。视图:发布者网站|谷歌学术
13. P、 Mahlknecht，A.Iranzo，B.Hogl等人，“嗅觉功能障碍预测特发性RBD早期向路易体病过渡，”神经病学，第84卷，第7期，第654-658页，2015年。视图:发布者网站|谷歌学术
14. H. Braak，U.擦，W. P.盖，和K.德尔Tredici，“特发性帕金森氏病：可能路线，通过该脆弱神经元类型可能会受到神经侵染由未知病原体，”神经传输杂志卷。110，没有。5，第517-536，2003。视图:发布者网站|谷歌学术
15. H、 布拉克，R.A.I.de Vos，J.Bohl和K.del Tredici，“胃α-帕金森氏病相关脑病理病例的Meissner和Auerbach神经丛中的同核蛋白免疫反应内含物，”神经科学通讯，第396卷，第1期，第67-72页，2006年。视图:发布者网站|谷歌学术
16. H、 Braak和K.Del Tredici，“散发性帕金森病的神经解剖学和病理学”在解剖学，胚胎学和细胞生物学的进步，第201卷，第1-119页，2009年。视图:谷歌学术
17. 梅泽尔和艾姆博格，“帕金森病的自主神经功能障碍与动物模型”，临床自主神经研究卷。29，没有。4，第397-414，2019。视图:发布者网站|谷歌学术
18. B.露迪，J. Janszky，S. Komoly和N.科瓦奇，“帕金森病睡眠障碍：特点，评估和治疗方法，”Orvosi Hetilap卷。156，没有。27，第一〇九一年至1099年，2015年。视图:发布者网站|谷歌学术
19. C.的O'Callaghan和S. J. G.刘易斯，“认知帕金森氏病，”神经生物学国际评论，第133卷，第557-583页，2017年。视图:发布者网站|谷歌学术
20. D、 A.Chistiakov和A.A.Chistiakovα突触核蛋白携带外泡在帕金森氏症：致命的发射器，”比利时神经学报，第117卷，第1期，第43-51页，2017年。视图:发布者网站|谷歌学术
21. C. Duyckaerts，F. Clavaguera和M. C.博天，“朊病毒样在阿尔茨海默传播假说和帕金森氏病，”目前在神经意见卷。32，没有。2，第266-271，2019。视图:发布者网站|谷歌学术
22. Y、 H.Koh，L.Y.Tan和S.Y.Ng，“帕金森病患者诱导的多能干细胞和类器官，用于模拟α-突触核蛋白的繁殖。”在细胞神经科学前沿，第12卷，第413页，2018年。视图:发布者网站|谷歌学术
23. J. H. Kordower, Y. Chu, R. A. Hauser, T. B. Freeman和C. W. Olanow，“帕金森病长期胚胎黑质移植中的路易体样病理学”自然医学，第14卷第1期5，页504-506,2008。视图:发布者网站|谷歌学术
24. J. H. Kordower, Y. Chu, R. a . Hauser, C. W. Olanow，和T. B. Freeman，“移植的多巴胺能神经元发展PD病理改变:第二例报告”运动障碍，第23卷，第16期，第2303-23062008页。视图:发布者网站|谷歌学术
25. Z、 Kurowska，E.Englund，H.Widner，O.Lindvall，J.Y.Li和P.Brundin，“帕金森病患者12-22岁中脑多巴胺神经元移植物的退化迹象”帕金森病杂志，第1卷，第1期，第83-92页，2011年。视图:发布者网站|谷歌学术
26. J. Y.李E.英格伦，J. L. Holton等人，“在与帕金森氏病的受试者移植神经元路易体建议主机到移植物疾病的传播，”自然医学，第14卷，第5期，第501-503页，2008年。视图:发布者网站|谷歌学术
27. O. J.利伯曼，S. J.彩，E.坎特等人，“α-同核蛋白依赖性钙离子进入是培养的SN和VTA多巴胺能神经元对帕金森神经毒素敏感性差异的基础埃涅罗，第4卷第1期ENEURO.0167-ENEU17.2017, 2017。视图:发布者网站|谷歌学术
28. S.弗拉汉姆，V.梅利斯，D.霍斯利等人，“α-突触核蛋白转基因小鼠，H-α-SynL62,显示α-突触聚集和多巴胺能表型使人想起帕金森氏病，”行为脑研究卷。339，第153-168，2018。视图:发布者网站|谷歌学术
29. A、 Anandhan，S.Lei，R.Levytskyy等人，“葡萄糖代谢和AMPK信号调节基因诱导的多巴胺能细胞死亡”(α-合核素-环境（百草枯）相互作用，”分子神经生物学卷。54，没有。5，第3825-3842，2017。视图:发布者网站|谷歌学术
30. T、 N.Taylor，D.Potgieter，S.Anwar等人，“多巴胺（而非去甲肾上腺素）的区域特异性缺陷，新A30P中的信号转导α突触核蛋白BAC转基因小鼠，”疾病的神经生物学，第62卷，第193-207页，2014年。视图:发布者网站|谷歌学术
31. B. Byers, B. Cord, H. N. Nguyen等，“SNCA三折叠帕金森患者的ipsc来源的DA神经元积累”α突触核蛋白和易受氧化应激，”公共科学图书馆一号，第6卷，第11期，第e26159条，2011年。视图:发布者网站|谷歌学术
32. E、 K.Butler，A.Voigt，A.K.Lutz等人，“线粒体伴侣蛋白TRAP1减轻α-核蛋白毒性。”遗传学卷。8，没有。2，文章e1002488，2012。视图:发布者网站|谷歌学术
33. N.长崎，T.平野和S. Y.川口，“阻抑突触可塑性的相对调节α和β钙的亚基^2个+/钙调素依赖性蛋白激酶II，”该生理学杂志卷。592，没有。22，第4891-4909，2014。视图:发布者网站|谷歌学术
34. 十、 吴斌，张志军等，“趋化因子受体CCR2通过增加伏隔核含中棘神经元的D1和D2多巴胺受体NR2B介导的电流，参与神经病理性疼痛和相关抑郁的发生。”神经心理药理学，第43卷，no。11、2320-2330页，2018。视图:发布者网站|谷歌学术
35. J. Viosca，G. Malleret，R. Bourtchouladze等人，“在空间信息的检索海马CREB干涉活性的慢性增强，”学习与记忆，第16卷，no。3、第198-209页，2009。视图:发布者网站|谷歌学术
36. P.姜，M.甘，W. L.林，和S. H. C.日元，“营养剥夺诱导α-通过内质网应激反应和SREBP2途径聚集同核蛋白，”在衰老神经科学前沿，2014年第6卷。视图:发布者网站|谷歌学术
37. T、 Arentsen，R.Khalid，Y.Qian和R.Diaz Heijtz，“老年细菌肽聚糖敏感分子2基因敲除小鼠运动和焦虑样行为的性别依赖性改变，”大脑，行为与免疫，第67卷，第345-3542018页。视图:发布者网站|谷歌学术
38. M. H.和Polymeropoulos，C. Lavedan的，E。Leroy等人，“突变与帕金森氏病家族中确定的α-突触核蛋白基因，”科学卷。276，没有。5321，第2045-2047,1997。视图:发布者网站|谷歌学术
39. R.克鲁格，W.库恩，T. Muller等人，“在编码基因突变AlaSOProα-帕金森病中的突触核蛋白自然遗传学，第18卷，第2期，第106-108页，1998年。视图:发布者网站|谷歌学术
40. J、 J.Zarranz，J.Alegre，J.C.Gómez Esteban等人，“新突变，E46Kαα-突触核蛋白会导致帕金森和路易体痴呆”神经病学纪事，第55卷，no。2，第164-173页，2004。视图:发布者网站|谷歌学术
41. P.帕萨宁，L. Myllykangas，M. Siitonen等人，“一种新的α非典型多系统萎缩和帕金森氏病的病理类型相关的α-突触核蛋白突变A53E，”衰老神经生物学卷。35，没有。9，第2180.e1-2180.e5，2014。视图:发布者网站|谷歌学术
42. I.派瓦，G.耆那，D.F。拉萨罗等人，“α-突触核蛋白deregulates COL4A2和损害ER-高尔基体功能的表达，”疾病的神经生物学，第119卷，第121-135页，2018年。视图:发布者网站|谷歌学术
43. N. Sharma, S. P. Rao，和S. V. Kalivendi，”DJ-1的脱氧作用减弱αα-突触核蛋白糖基化和聚合中的多巴胺能细胞：在帕金森病DJ-1的氧化应激介导下调的作用，”自由基生物学和医学，第135卷，第28-37页，2019年。视图:发布者网站|谷歌学术
44. D. Grassi, S. Howard, M. Zhou等人，“高度神经毒性的鉴定”α-突触核蛋白在帕金森病中诱导线粒体损伤和有丝分裂吞噬作用，”国家科学学院院刊卷。115，没有。11，第E2634-E2643，2018。视图:发布者网站|谷歌学术
45. R、 J.Sizemore，R.Zhang，N.Lin等人，“大鼠中脑多巴胺能神经元、纹状体胆碱能神经元和纹状体棘状投射神经元的躯体和初级树突突触的数量和类型存在显著差异。”比较神经学杂志，第524卷，第5期，第1062-1080页，2016年。视图:发布者网站|谷歌学术
46. G、 R.Khakimova，E.A.Kozina，O.A.Buneeva，L.N.Aksenova，A.E.Medvedev和M.V.Ugryumov，“小鼠帕金森病症状前和症状早期黑质纹状体系统中单胺氧化酶的活性”《实验生物学与医学通报》，第159卷，第4期，第456-458页，2015年。视图:发布者网站|谷歌学术
47. D、 锰促进细胞聚集和朊样细胞向细胞外体的传递α-突触核蛋白科学信号，第12卷，no。572, p. eaau4543, 2019。视图:发布者网站|谷歌学术
48. J. Y.巴尔加斯，C. Grudina，和C. Zurzolo，“朊病毒状的扩频α-同核蛋白：来自体外到体内帕金森病的模型，”衰老研究评论卷。50，第89-101，2019。视图:发布者网站|谷歌学术
49. A、 Recasens和B.Dehay，“α-突触核蛋白在帕金森病中的传播”在神经解剖学前沿，第8卷，第159页，2014年。视图:发布者网站|谷歌学术
50. M. J. Castle, Z. T. Gershenson, A. R. Giles, E. L. F. Holzbaur，和J. H. Wolfe，“腺相关病毒血清型1、8和9在轴突的顺行和逆行转运中共享保守机制，”人类基因治疗，第25卷，第8期，第705-720页，2014年。视图:发布者网站|谷歌学术
51. B.金克，X. L.周，Z. G. Zhang等人，“AAV介导的跨突触顺行标记：映射corticocollicular输入定义的神经通路用于防御的行为，”。神经元卷。93，没有。1期，第33-47，2017年。视图:发布者网站|谷歌学术
52. de Oliveira和J. L. Silva，“Alpha-synuclein逐步聚集揭示帕金森病早期发病突变的特征，”通信生物学，第2卷，第1期，2019年。视图:发布者网站|谷歌学术

版权

版权所有©2020 Qing Jun Wang等人。这是一篇在知识共享署名许可，它允许在任何媒体中不受限制地使用、分发和复制，前提是正确引用了原始作品。