NP 神经可塑性 1687 - 5443 2090 - 5904 Hindawi 10.1155 / 2020/6283754 6283754 研究文章 典中的h的角色 αsyn (A53T)在帕金森病的发病机理:突触病理学和神经细胞衰老 王 Qing-Jun 1 2 陈 我顿时 2 陈 Hai-Chao 1 王 东鑫 1 蔡 Yi-Ting 1 阴 杰 1 https://orcid.org/0000 - 0001 - 6017 - 5898 京 虹宇 1 3 https://orcid.org/0000 - 0002 - 5310 - 3930 高 李平 2 3 Bagnato 塞吉奥 1 研究所的解剖学和组织学和胚胎学 神经科学 学校基本的医学科学 兰州大学 兰州 中国 lzu.edu.cn 2 生物化学与分子生物学研究所 学校基本的医学科学 兰州大学 兰州 中国 lzu.edu.cn 3 对新药临床前研究重点实验室的甘肃省 学校基本的医学科学 兰州大学 兰州 中国 lzu.edu.cn 2020年 21 3 2020年 2020年 29日 09年 2019年 04 01 2020年 31日 01 2020年 21 3 2020年 2020年 版权©2020王Qing-Jun et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

发动机和nonmotor PD症状涉及多个脑区。然而,是否 α来自SNc的syn病理可以直接导致病变在遥远的大脑区域和诱导透析相关症状仍不清楚。这里,AAV9-synapsin-mCherry-human SNCA (A53T)注入到单边SNc的老鼠。运动机能和嗅觉灵敏度进行评估。我们的研究结果表明,AAV9-synapsin-mCherry-human SNCA在SNc不断表示。动物显示轻微的电动机和嗅觉功能障碍在7个月后病毒注入。SNc的病理学特征是多巴胺能神经元的损失伴随着ER应激。在纹状体,h αsyn表达高,CaMK β2和NR2B表达减少,突触减少和活跃。在嗅球,h αsyn表达高,老化僧帽细胞层增加。结果表明,h αsyn运输在纹状体和OB沿着神经纤维起源于SNc和诱导病理变化在遥远的大脑区域,这导致了电机和nonmotor帕金森病的症状。

 中国国家自然科学基金 81870949 81570725 1。介绍

帕金森病(PD)的典型病理特征是异常的构象 αsyn和路易小体的形成(磅) 1- - - - - - 3]。单体 α在生理条件下syn可溶性和展开。 αsyn是容易形成一个 α螺旋结构时,其n端结合细胞膜的磷脂 4]。在病理条件下, αsyn最初形成可溶性低聚物,也称为profibrils,球面与线性和环形分子形态下的电子显微镜( 5]。渐渐地,profibrils成为不溶性和相互结合,形成纤维( 6]。A53T和A30P突变 αsyn有更高的概率比野生型聚合形成原纤维( 7]。 αsyn纤维也可以沉积在神经细胞形成包涵体称为磅(胞体)和路易探明(LNs,终端的神经元) 6]。在过去的半个世纪里,伦敦商学院已逐渐作为PD患者的神经病理标记( 8- - - - - - 10]。 αsyn可能形成磅LNs,破坏神经元和突触,导致电机和nonmotor障碍( 11- - - - - - 13]。

磅逐渐分布在不同的大脑区域在帕金森病的发展。磅首先出现在嗅球,黑质(SNc),皮层等脑区( 14, 15]。Braak Del Tredici发现磅而形成的 αsyn经常分布在零星的PD患者的大脑。在早期阶段,伦敦商学院首次出现在迷走神经背核和嗅球,然后在基底核和中脑,最后在一个广阔的区域内的大脑皮层 16]。磅的大脑区域的分布是一致的PD患者的临床症状的多样性。这些病人首先显示nonmotor症状,嗅觉和睡眠障碍等,随后在后期表现出运动症状( 17- - - - - - 19]。尽管Braak发现磅的病理逐渐从一个区域到另一个出现在PD患者中,频繁出现的 αsyn在特定的大脑区域,如SNc,仍不清楚。近年来,研究表明,磅相似的病理进展朊病毒的传播,也就是说, αsyn错误折叠的蛋白质可以从一个区域转移到另一个,然后沉积( 20.- - - - - - 22]。这个条件支持治疗PD患者的胚胎神经元移植,在磅在移植胚胎神经元。四个独立验尸报告磅的存在 αsyn为主要组件和罢免在多巴胺神经元移植后10 - 22年( 23- - - - - - 26]。

尽管磅或LNs αsyn为主要组件可广泛分布在多个脑区,对神经损伤的敏感性似乎主要集中在SNc的多巴胺神经元( 27, 28]。到目前为止,涉及选择性神经退化的机制尚不清楚。死的发病机理仍然未知尽管许多不同和频繁的互动机制,包括线粒体功能障碍、蛋白质处理不当,炎症,氧化应激,遗传和环境因素,和正常老化,已经提出 29日- - - - - - 32]。这些因素并不一定局限于SNc多巴胺神经元,但包括神经元在大脑其他区域的其他类。SNc的初始风险因素或其他大脑区域不能区分基于h αsyn (A53T)转基因小鼠。因此,在这项研究中,AAV9-synapsin-human SNCA (A53T)病毒注入SNc的右侧。病变在正确的嗅球和纹状体注射后观察到7个月。

在SNc将纹状体多巴胺神经元和突触形成连接。是否连续表达的h α多巴胺神经元的syn SNc在纹状体突触功能的影响,所以CaMK的表达 β2和NR2B进行评估,CaMK β2与突触前囊泡的释放[ 33],NR2B与NMDA受体在突触后膜的功能 34),而分子分子与突触可塑性密切相关( 35]。考虑在纹状体多巴胺的功能投影与多巴胺受体的分布,D1R和D2R纹状体的水平测量。此外,在纹状体突触结构变化进行了分析使用电子显微镜结合半定量的方法,来评估的影响持续高表达的h αsyn在纹状体突触可塑性从功能和结构两个方面。GRP78和排骨是重要的监管机构在ER应激引起的蛋白质积累( 36]。本研究旨在揭示h的影响 αsyn (A53T) SNc在遥远的大脑区域,如纹状体和嗅球,其病理机制,高表达的h αsyn (A53T) SNc可能直接导致运动功能障碍和障碍的嗅觉灵敏度。

 2。材料和方法 2.1。动物

雄性C57BL / 6小鼠体重大约20 - 22 g从兰州大学实验动物中心购买。所有的动物都是在标准条件下22°C到25°C,湿度40% - -60%,12小时光周期与喂养和随意。老鼠被分为实验和对照组。实验小鼠注射AAV9-synapsin-human SNCA (A53T)正确的SNc和控制老鼠注射AAV9-synapsin-mCherry SNc的权利。所有动物实验协议是兰州大学动物伦理委员会的批准。

 2.2。试剂

异氟烷是来自RWD生命科学有限公司(中国深圳)。AAV9-synapsin-human SNCA (A53T)和AAV9-synapsin-mCherry由Ruizhen生物技术有限公司(山东、中国)。兔多克隆anti-Grp78, anti-TH, anti-p62抗体购自Abcam(英国剑桥)。兔多克隆anti-CHOP,反 β-camkII, anti-NR2B抗体购自Bioworld科技有限公司有限公司(中国南京)。鼠单克隆anti-GAPDH抗体购自Immunoway生物科技公司(美国德克萨斯州)。PVDF膜和电解研磨剂获得微孔(美国马Bellerica)。RNAiso + cDNA逆转录装备,和实时PCR (rt - PCR)混合从豆类购买生物技术有限公司有限公司(中国大连)。

 2.3。立体定向注射

立体定向注射病毒一般异氟烷麻醉下使用立体定向仪。AAV9-synapsin-mCherry-human SNCA (A53T)或AAV9-synapsin-mCherry (500 nl)注入正确的SNc(协调:美联社,−3.2毫米;毫升,1.2毫米;DV, 4.3毫米)的速度缓慢(125 nl /分钟)通过使用注射泵。注射针被撤回注入结束后5分钟。注射部位的准确位置和病毒传染性,在所有老鼠事后证实了准备部分。

 2.4。行为测试 2.4.1。开放的现场试验(OFT)

开放的现场试验(OFT)是由使用一个经常- 100仪器(罗鱼,成都,中国)。实验箱的大小 50 厘米 × 50 厘米 × 40 厘米。在实验过程中,老鼠被放置在实验箱,和冷冻时间、运动距离,和停留时间在中间区域的盒子都记录了5分钟。

 2.4.2。油缸测试

前肢不对称自发运动被使用缸测试评估基于前面的描述。动物被放置在一个透明的圆柱,其进展记录了10分钟。两个镜子被放置在圆筒促进所有前肢触摸的记录。前肢接触时间在10分钟记录和统计,和比例计算如下: 比 = 正确的 前肢 触摸 次 / 左 前肢 触摸 次 。

 2.4.3。极血统

0.5米长杆直径1厘米和包裹nonadhesive货架衬管放置在家里笼促进动物的控制。我们跟着蒂姆Arentsen等的方法。 37]。总之,动物接受两天的训练下杆的顶部到笼子里。动物得到了三个试验的第一天训练。他们低着头放置距离的1/3以上地板在第一次试验中,在第二轮审判2/3的距离,放置在顶部第三审判。第二天的训练,动物有三个试验下他们的头从上往下的。测试一天,动物们低着头被放置在顶部的杆和定时回到笼子里。动物和结束时间开始当实验者发布当一个后肢到达家里笼基地。

 2.4.4。嗅觉测试

嗅觉偏好测试是基于前面的描述和执行修改。底部的测试箱( 25 厘米 × 15 厘米 × 10 cm大小)满是木屑。小鼠禁食24小时前的实验。嗅觉进行了适应性训练如下:100 μl花生酱(0.6 g溶解在1毫升蒸馏水)被设置在一个 5 厘米 × 5 cm滤纸,放在测试箱的一侧。后返回的老鼠在原始笼在测试箱停留15分钟。5分钟后,老鼠被放置在测试箱又呆了15分钟。30分钟后,嗅觉测试进行。首先,与100年滤纸 μl蒸馏水葬在木屑,和老鼠的时间,直到发现滤纸被记录的控制。第二,与100年滤纸 μl花生酱代替,埋在木屑的时间,直到检测到滤纸的老鼠被记录。

 2.4.5。食物埋藏实验

食品埋葬测试的基于前面的描述。底部的测试箱( 25 厘米 × 15 厘米 × 10 cm大小)是覆盖着木屑,15块食物食物被埋在木屑。禁食24小时后,老鼠被放置在测试箱,和老鼠的时间发现所有的食物食物被记录。

 2.4.6。Three-Chambered社会方法任务

社交能力和社会认知three-chambered装置进行评估,如前所述。一个矩形框three-chambered明确的有机玻璃分为三个大小相等的钱伯斯( 45 厘米 × 20. 厘米 × 35 厘米)。墙上把房间有一个小矩形开口( 10 厘米 × 6.5 厘米),提供邻室。清晰的矩形有机玻璃大门被用来关闭开口。测试会话以短的习惯(即开始。,1 min) at the center chamber without access to either of the side chambers, followed by a 10 min habituation session in the entire empty box with access to all three chambers. The test mouse was briefly confined in the center chamber as the experimenter placed the stimuli. To evaluate the social approach behaviors in a live unfamiliar mouse (with the same weight, sex, and strain as the test mouse), a novel C57BL/6 mouse previously habituated to a grid enclosure (inverted wire pencil cup) was placed in one of the side chambers. A control novel object, an identical empty grid enclosure devoid of social odors, was placed in the other side chamber. The location of the novel object and the novel mouse alternated between the left and the right sides chambers across subjects. After the objects were positioned in the side chambers, the two doorways were simultaneously opened, and the test mouse was allowed access to all three chambers for 10 min. After 10 min of testing, the test mouse was shortly confined in the center chamber again. To assess social cognition, a novel C57BL/6 stimulus mouse was placed in the chamber that previously contained the empty grid enclosure. With the stimuli mice positioned in their respective enclosures, the doorways were opened, and the test mouse freely explored all three chambers for 10 min. The time spent in each chamber and time spent around the enclosures (near the novel object, novel mouse, or familiar mouse) was recorded by a video camera positioned directly above the testing apparatus and analyzed by an automated tracking system.

 2.5。脑组织的准备

在病毒注入15天,3个月后,三个老鼠随机选择从实验和对照组和病毒传染性和h αsyn表达测定。在注射后7个月,行为是首先测量,和每组的小鼠被随机分为三个部分,即动物( n = 8 ),将被用来准备的新鲜组织特定的大脑区域,动物( n = 8 ),将被用来准备的大脑部分,和动物( n = 3 ),将用于电子显微镜检查。

2.5.1。准备新鲜的脑组织

老鼠受到3%的腹腔内局部麻醉剂戊巴比妥钠(45毫克/公斤)。他们的大脑被删除,和正确的中脑和纹状体立体显微镜下分离,用液态氮冷冻,保存在冰箱在使用前−80°C。

 2.5.2。准备的大脑部分

老鼠受到3%的腹腔内局部麻醉剂戊巴比妥钠(45毫克/公斤)。他们打开胸腔时,0.9%生理盐水灌注是30转/分钟的速度为3分钟左心室,然后用4%多聚甲醛30转/分钟的速度为2分钟,然后18转/分钟的速度为10分钟。一夜之间整个大脑和4%多聚甲醛固定,放置在20%和30%蔗糖,直到沉入底部的容器。低温恒温器串行部分25 μ米厚度是由使用低温恒温器切片机。

 2.6。免疫荧光

十五天后病毒注入,SNc的大脑部分选择和孵化与多克隆兔anti-TH抗体(1:200)在37°C 1 h和一夜之间在4°C。冲洗了部分0.01磷酸盐(PBS)和孵化第二抗体(1:100)共轭和FITC 37°C 1 h。0.01米的部分被冲洗PBS和DAPI染色。的部分被使用荧光显微镜观察,TH-labeled神经元的数量,mCherry-positive神经元,TH和mCherry colabeled神经元在SNc数。简单地说,根据乔治paxinos的老鼠脑图谱,选择三个部分:前囱- 2.7,前囱- 2.95,前囱- 3.2,间隔250 μm。TH-positive细胞的数量在每个部分计算,平均价值三个部分代表SNc TH-positive细胞的数量的一个鼠标。

 2.7。免疫组织化学

SNc、纹状体和嗅球部分选择和淬火0.3%过氧化氢(H2O2)20分钟消除内源性过氧化物酶活性。几个洗0.01 PBS后,部分包含鼠标反在PBS孵化 αsyn (A53T)抗体(1:200),特里同X 0.3%, 0.1%的山羊血清24小时在4°C。孵化部分被清洗和孵化90分钟的生物素化的山羊antirabbit抗血清(1:200),其次是洗0.01 PBS。然后,部分与strep-avidin-biotin孵化过氧化物酶复杂(1:200)90分钟,沉浸在0.02% 3、3-diaminobenzidine含有0.01% H2O2在0.01 M PBS的发展。

 2.8。电子显微镜

在PBS戊二醛(3%)固定背侧纹状体和SNc后缀有1% OsO4 90分钟,与梯度乙醇脱水。样品被嵌入与环氧树脂812和聚合在72°C 48 h。四个超薄部分(50 - 70 nm)选择在每1.0 μ米间隔/鼠标,沾染了醋酸铅和铀酰,观察用JEM1230显微镜(日本东京)。捕获的图像Gatan形象系统(美国纽约)。

 2.9。免疫印迹

从每组四只老鼠被随机选择,与戊巴比妥麻醉,得到了正确的中脑和正确的纹状体和放置在冰冷的PBS。样品在液氮冷冻和均质和蛋白质分数是由使用一个萃取试剂含有蛋白酶抑制剂。总蛋白(30 μ在10% sds - page和g)分级分离转移到PVDF膜。玷污了膜anti-p62 (1: 1000), anti-Grp78 (1: 1000), anti-CHOP (1: 1000), anti-CaMk β2 (1:1000),anti-NR2B(1: 1000),和anti-GAPDH(1: 5000)抗体在一夜之间在4°C。与0.01 TBST洗涤后,细胞膜玷污了辣根过氧化物酶共轭二次抗体(1:5000),并通过使用增强化学发光免疫反应性的蛋白质乐队是可视化。

 2.10。实时聚合酶链反应

总RNA提取从右侧纹状体通过使用一个RNAiso +试剂(豆类生物技术,有限公司,大连,中国)按照制造商的指示。DNA污染被RNase-free DNase。1的互补脱氧核糖核酸合成 μg与M-MuLV RNA逆转录酶根据制造商的指示。定量rt - pcr是由使用PIKoREAl96检测器(美国热科学)。的mRNA水平根据DR1、DR2和一式三份样品分子reverse-transcribed cDNA评价SYBR绿色PCR主设备(美国Promega公司)按照制造商的指示。鼠标分子的引物5 ′ -GACAACCAGCAGCAGAGTGGAGATG-3 ′ (向前)和5 ′ -TGGATACCTGGGCTAATGTGG-3 ′ (反向)。鼠标根据DR1的引物5 ′ -GGTGGAGGAGGACTGGTGTCAA-3 ′ (向前)和5 ′ -CTTGGAAATCACTTTGCCTGGA-3 ′ (反向)。鼠标DR2的引物5 ′ -CCTTCATCGTCACCCTGCTGG-3 ′ (向前)和5 ′ -CTCCATTTCCAGCTC CTGAG-3 ′ (反向)。鼠标GAPDH引物5 ′ -GCGAGACCCCACTAACATCAA-3 ′ (向前)和5 ′ -GTGGTTCACACCCATCACAAA-3 ′ (反向)。化验是启动5分钟在95°C, 40 15秒的周期在94°C,和1分钟60°C。目标基因和GAPDH的阈值周期计算。根据DR1的放大,DR2,分子cDNA规范化GAPDH的表达。分子的相对mRNA表达水平,根据DR1、DR2计算通过使用2- - - - - - ΔΔCT方法。

 2.11。<斜体>β< /斜体>加染色

嗅球部分选择和冲洗0.01 PBS和1%多聚甲醛固定在室温下30分钟。的部分与0.01 PBS,冲洗沾 β加设备根据操作手册,并与1%中性红复染色5分钟。最后,部分是脱水和观察。

 2.12。统计分析

数据表示为 的意思是 ± 扫描电镜 。单向方差分析进行了多个组比较,图基的事后分析被用来评估的意义配对组。在所有的分析, p < 0.05 被认为是显著的。

 3所示。结果 3.1。高表达的h <斜体>α< /斜体> syn SNc

15天,3个月,7个月后病毒注入,mCherry-positive细胞侧SNc通过荧光显微镜观察,和h αsyn表达身体的同侧的SNc anti-h检测 αsyn (A53T)抗体。结果表明,mCherry-positive细胞可以观察,其中mCherry和TH colabeled细胞总数的大约85% mCherry-positive细胞(数字 1(一)和 1 (b)后15天)病毒注入。这些mCherry-positive细胞逐渐从15天增加到3个月,7个月后病毒注入。阳性细胞的数量是7个月后病毒注入高于3个月后(数字 1 (c)和 1 (d))。在病毒注射后3个月,h αSNc的syn表达显著增加注射AAV9-synapsin-mCherry-human SNCA (A53T)与动物相比注射AAV9-synapsin-mCherry(数字 1 (e)和 1 (f))。在病毒注射后7个月,h αSNc syn表达增加(数据 1 (g)和 1 (h))。这些结果表明,AAV9-synapsin-mCherry-human SNCA SNc (A53T)持续经营和生产h αsyn (A53T)的蛋白质。

外源性高h αSNc syn表达式。(a)代表图像显示mCherry-positive TH-positive, colabeled细胞在病毒注射后15天。(b)的比率colabeled细胞总SNc mCherry-positive细胞( n = 3 )。(c)代表图像显示mCherry-positive细胞SNc在15天,3个月,7个月后病毒注入。(d)在SNc mCherry-positive细胞的数量在15天,3个月,7个月后病毒注入( n = 3 )。(e)代表图像显示了h αsyn在SNc通过使用免疫组织化学表达病毒注射后3个月。(f)的定量分析h αSNc的syn表达病毒注射后3个月( n = 3 )。(g)代表图像显示了h αsyn在SNc通过使用免疫组织化学表达病毒注射后7个月。(h)的定量分析h αSNc的syn表达病毒注入(7个月后 n = 5 )。 ∗ ∗ p < 0.01 与对照组相比。

 3.2。病理特点,<斜体>α< /斜体> syn SNc

在7个月后注射AAV9-synapsin-mCherry-human SNCA (A53T)对SNc, SNc TH-positive细胞下降了约35%(数据 2(一个)和 2 (b))与对照组相比。SNc神经元在电子显微镜下观察,将身体,就像结构(图 2 (c))在h αsyn组。p62,适配器蛋白质调节自噬,使用白平衡检测,结果表明,p62的表达水平显著提高 αsyn组比对照组(数字 2 (d)和 2 (e))。Grp78的表达水平和切检测,结果表明,Grp78和切蛋白质的表达水平明显高于在h αsyn组比对照组(数字 2 (f)- - - - - - 2 (h))。这些结果表明,高表达的h αsyn SNc导致溶酶体降解异常,内质网压力,多巴胺神经元的损失。

h的病理特征 αsyn SNc在7个月后病毒注入。(一)代表图像显示了SNc TH-positive细胞。(b) SNc TH-positive细胞( n = 5 )。(c)代表的身体,就像结构图像,图像显示了包含SNc通过透射电子显微镜(注意:红色箭头表示的身体,就像在神经元结构)。(d) p62表达侧中脑组织利用免疫印迹分析。(e)的定量分析在侧中脑中p62表达式通过使用图像J软件( n = 4 )。(f) Grp78和切表达水平侧中脑组织利用免疫印迹分析。(g h) 09年Grp78和切表达水平的定量分析在同侧中脑使用图像软件,分别为( n = 4 )。 ∗ p < 0.05 和 ∗ ∗ p < 0.01 与对照组相比。

 3.3。影响h <斜体>α< /斜体> syn侧纹状体

在3个月后注射AAV9-synapsin-mCherry-human SNCA (A53T)或AAV9-synapsin-mcherry mCherry-positive纤维(图 3(一个))被发现在同侧纹状体。h αsyn表达式在同侧纹状体使用anti-h被检测到 αsyn抗体。h的表达水平 αsyn显著高于对照组(数字 3 (b)和 3 (c))。在注射后7个月,mCherry-positive神经纤维(图 3 (d)纹状体中发现的),h αsyn表达明显高于对照组(数字 3 (e)和 3 (f))。这些结果表明,神经元与高h αSNc的syn表达式可以在纹状体项目,导致增加h αsyn表情纹状体和形成的 αsyn病理学。

高h αsyn表达式在同侧纹状体。(一)代表图像显示mCherry-positive侧纹状体的神经纤维病毒注射后3个月。(b)代表图像显示了h αsyn在侧纹状体通过使用免疫组织化学表达病毒注射后3个月。(c)的定量分析h αsyn表达式侧纹状体的病毒注射后3个月( n = 3 )。(d)代表图像显示mCherry-positive侧纹状体的神经纤维病毒注射后7个月。(e)代表图像显示了h αsyn表达式在同侧纹状体通过使用免疫组织化学在7个月后病毒注入。(f)的定量分析h αsyn表达式在同侧纹状体在7个月后病毒注入。( n = 5 )。 ∗ p < 0.05 和 ∗ ∗ p < 0.01 与对照组相比。

 3.4。影响h <斜体>α< /斜体> syn在纹状体突触结构和功能

在7个月后注射AAV9-synapsin-mCherry-human SNCA (A53T)或AAV9-synapsin-mCherry,突触的变化plasticity-related分子和同侧纹状体突触结构被检测到。结果表明,D2R和信使rna分子水平降低(图 4(一))和CaMK的表达水平 β2和NR2B下降(数字 4 (b)- - - - - - 4 (e)在h) αsyn组与对照组相比。纹状体突触结构的变化被用电子显微镜观察和测量,和60不对称突触的突触前膜面积测量每组和结果表明,突触前膜区域的h αsyn组小于对照组(数据 4 (f)和 4 (h))。穿孔突触的比例计算,结果表明,穿孔突触的比例大约7%和28%的h α分别syn和对照组(数字 4 (g)和 4(我))。这些结果表明, αsyn病理学在纹状体导致的减少突触可塑性和纹状体的活动。

突触结构和功能的改变在7个月后病毒注入。(a) mRNA水平根据DR1、DR2同侧纹状体和分子( n = 3 )。(b) CaMK β2表达的同侧纹状体通过免疫印迹分析。(c) CaMK的定量分析 β2表达的同侧纹状体( n = 4 )。(d) NR2B表达在同侧纹状体通过免疫印迹分析。(e)同侧纹状体(NR2B表达的定量分析 n = 4 )。(f, g)代表的突触超微结构图像,图像显示了背侧纹状体通过透射电子显微镜(注意:红色虚线表示突触囊泡,白色虚线表明穿孔突触,白色箭头表示突触后膜,和蓝色箭头表示突触前膜面积)。(h)意味着面积60突触的突触前膜( n = 3 )。(我)比300多突触(穿孔突触的 n = 3 )。 ∗ p < 0.05 和 ∗ ∗ p < 0.01 与对照组相比。

 3.5。运动行为的变化

运动行为中检测出的小鼠注射AAV9-synapsin-mCherry-human SNCA (A53T)或AAV9-synapsin-mCherry在7个月后注射。小鼠的自发活动是衡量使用经常,和结果表明,运动的距离减少,固定时间增加(数据 5(一个)- - - - - - 5 (c)在h) αsyn组与对照组相比。运动能力是衡量使用极血统测试,结果表明,h所花费的时间 αsyn组比对照组(图 5 (d))。前肢的协调能力是衡量使用缸测试,结果显示,动物前肢举起执行的次数明显降低(图 5 (e)),animal-executed右前肢接触时间远远超过,当它完成倍(图左前肢联系 5 (f)在h) αsyn组与对照组相比。这些结果表明,h αsyn表达式(A53T)单边SNc造成轻微的7个月后小鼠运动功能障碍。

运动行为的变化在7个月后病毒注入。(a)代表图像,图像显示了开放领域的运动跟踪测试。(b)移动距离在5分钟之内。(c)内固定时间5分钟。(d)时间下杆的顶部。(e)的次数两个前肢触及到气缸壁在10分钟。(f)比例的左、右前肢触摸气缸壁在10分钟。 n = 15 , ∗ p < 0.05 , ∗ ∗ p < 0.01 与对照组相比。

 3.6。影响h <斜体>α< /斜体> syn嗅球

在3个月后注射AAV9-synapsin-mCherry-human SNCA (A53T)或AAV9-synapsin-mCherry mCherry-positive神经纤维(图 6(一)身体的同侧的嗅球)被发现。h αsyn表达侧嗅球被anti-h检测 αsyn抗体,结果表明,h αsyn表达明显高于对照组(数字 6 (b)和 6 (c))。七个月后病毒注入,mCherry-positive神经纤维(图 6 (d))被发现在同侧嗅球,h αsyn表达明显高于对照组(数字 6 (e)和 6 (f))。嗅球细胞老化检测通过 β加染色,结果显示的数量 β-gal-positive细胞位于嗅球僧帽细胞层的显著的高于h αsyn组比对照组(数字 6 (g)和 6 (h))。这些结果表明,高h αsyn表达式加速在嗅球僧帽细胞衰老。

高h α身体的同侧的嗅球的syn表达式。(一)代表图像显示mCherry-positive侧嗅球神经纤维在3个月后病毒注入。(b)代表图像显示了h αsyn在侧嗅球通过使用免疫组织化学表达病毒注射后3个月。(c)的定量分析h αsyn表达式在侧嗅球病毒注射后3个月( n = 3 )。(d)代表图像显示mCherry-positive侧嗅球神经纤维在7个月后病毒注入。(e)代表图像显示了h αsyn在侧嗅球通过使用免疫组织化学表达病毒注射后7个月。(f)的定量分析h αsyn表达式在侧嗅球病毒注入(7个月后 n = 5 )。(g)代表图像显示了积极的 β加染色在嗅球7个月后病毒注入。(h)的数量 β嗅球-gal-positive细胞病毒注入(后7个月 n = 5 )。 ∗ ∗ p < 0.01 与对照组相比。

 3.7。嗅觉功能的变化

在7个月后注射AAV9-synapsin-mCherry-human SNCA (A53T)或AAV9-synapsin-mCherry,辨别气味的能力评估。结果表明,时间的长度,老鼠发现了花生酱明显短于水,直到他们发现两组数据 7(一)和 7 (b))。这一结果表明,odor-based勘探的两组老鼠的能力是正常的。在食物埋藏实验中,时间的长度,老鼠发现所有的食物食物长在h αsyn组比对照组(图 7 (c))。基于记忆训练的顺序,发现气味记忆能力,结果表明,时间的长度,老鼠发现熟悉的气味是长在h αsyn组比对照组(数字 7(一)和 7 (d))。此外,社会行为的基础上嗅觉识别检测,结果显示,长时间的不熟悉的同种的老鼠比熟悉的同种的两组老鼠(数字 7 (e)和 7 (f)),而不熟悉的鼠标的时间的长度是短的h αsyn组比对照组(图 7 (g))。

嗅觉功能的变化在7个月后病毒注入。(一)嗅觉灵敏度测试的示意图。(b)延迟找到埋藏的气味。(c)延迟找到埋藏食物。(d)延迟找到埋藏的花生酱。(e) three-chamber社会测试的示意图。(f)时间在小说中老鼠居民熟悉的老鼠的居民,和中央室。(g)的时间比例在小说中老鼠居民室和所花费的时间在熟悉小鼠居民室在10分钟。 ∗ p < 0.05 和 ∗ ∗ p < 0.01 与对照组相比, n = 15 。

 4所示。讨论

的研究 αsyn已成为一个重要方面在PD研究当SNCA的参与(编码 α首次报道syn蛋白质)的基因突变在1997年家族世袭PD的发病机制( 38]。转基因动物模型已经建立。虽然研究动物模型在此基础上加深了对PD病理的理解,的功能 αsyn,尤其是突变 αsyn在帕金森病的病理形成,尚不清楚( 39- - - - - - 41]。高 αsyn表达式或PD在大脑的结果不能被确认为PD的病因。我们的研究发现,h αsyn表达式(A53T)在SNc增加3和7个月后单边注入AAV9-synapsin-mCherry-human SNCA SNc (A53T)。在注射后7个月,SNc的多巴胺能神经元数量减少可能是由于细胞内蛋白质聚合和内质网应激引起的h αsyn (A53T)。此外,内质网stress-dependent激活细胞凋亡。h αsyn (A53T)产生SNc神经元被运送到纹状体的投射纤维在纹状体突触结构和效率的影响,从而说明这种现象可能是运动功能障碍的关键机制。h αsyn (A53T)产生SNc神经元被运送到嗅球沿着投射纤维加速细胞老化的嗅球僧帽层,可能导致嗅觉灵敏度下降。

持续的高表达的h αSNc syn (A53T),特点是内质网应激,蛋白质聚合,异常自噬,内质reticulum-dependent诱导细胞凋亡,导致的病理形成 α在SNc syn。这种情况可能会导致多巴胺神经元的损失在SNc [ 42- - - - - - 44]。大脑区域特异性PD病理不断吸引了相当多的研究人员的注意。在不同的动物模型的研究表明多巴胺能神经元的损伤在SNc是明确的。这种情况可能是由于以下原因:第一,许多存在于多巴胺神经元突触连接SNc [ 45]。因此,神经元活动的频率很高,伴随着高代谢。此外,在中脑多巴胺神经元表达高单胺氧化酶,能产生许多氧自由基,导致神经元损伤( 46]。在这项研究中,我们排除了其他大脑区域的影响只感染SNc的SNc的病理形成神经元,这是很重要的在确定独立的表达的影响 αsyn SNc在帕金森病的病理形成。

尽管PD病理包括基底神经节的转基因动物模型,病理是否形成的纹状体多巴胺能神经元的损伤原因SNc不能证实因为纹状体神经元也表达h αsyn (A53T) h αsyn转基因小鼠。我们的研究证实了h的影响 αsyn (A53T)来自SNc在纹状体在单边SNc使用定向病毒注射。在注射后3和7个月, αsyn表示在纹状体的神经纤维。mCherry标签确认,这些纤维起源于SNc。这些结果表明,h αsyn (A53T)纹状体神经元来自SNc在投射纤维影响到纹状体的神经连接。此外,电子显微镜结果表明,突触结构的变化参与突触前膜的面积和穿孔突触在背侧纹状体的比例下降,表明突触活性降低。

嗅觉功能障碍是重要nonmotor帕金森病的症状。然而,嗅觉功能障碍是否由SNc神经元的病理仍不清楚。在这项研究中,h αsyn (A53T)被发现在同侧嗅球神经纤维的病毒注射后单边SNc。此外,mCherry标签确认这些神经纤维直接源于SNc,从而表明多巴胺能神经元变性的发病机制影响的SNc嗅球通过它投射纤维和加速细胞老化的嗅球僧帽细胞层,随后导致嗅觉灵敏度下降。

神经纤维投射到纹状体和嗅球的直接原因可能是运动机能的变化和嗅觉功能障碍在PD,分别。神经元与h αsyn (A53T)表达在当地的大脑区域影响遥远的脑区域的功能投射纤维。的病理沉积h αsyn不仅影响突触结构、突触可塑性和突触效率也加速老化神经在遥远的大脑区域,从而表明这一现象可能是一个重要的病理特性的h αsyn (A53T)。

以前的研究已经表明 αsyn可以分布在大脑区域( 47- - - - - - 49]。我们的研究表明,h αsyn (A53T)表示在SNc神经元可以到达遥远的脑区域投射纤维。大多数研究认为,AAV只存在于被感染的神经细胞,这表明大部分的h αsyn (A53T)在遥远的大脑区域直接传播沿投射纤维( 50]。然而,研究表明,AAV演示了一个transsynaptic效果,表明一些h αsyn (A53T)可能传播到遥远的大脑区域在多于两层的神经元 51]。因此,的主要方式 αsyn沿着神经纤维传播从一个地区到另一个地方。

有许多类型的SNCA基因突变,最高频率A53T, A30P, E46K。的 αsyn A53T突变蛋白,易于形成 α螺旋结构,导致纤维化和积累,导致功能障碍的恶化取决于autophagy-lysosomal通路( 52]。一致,h的表达 αsyn在纹状体和嗅球随着时间的增加在我们的实验。然而,很难区分的构象 αsyn体内。

 5。结论

的方向注入AAV9-synapsin-mCherry-human SNCA (A53T) SNc部分能导致PD-like病理学和症状。高表达的h αsyn (A53T)在SNc不仅导致SNc的发病机理也降低了纹状体突触活动,加速细胞老化在嗅球的投影SNc的纤维,造成发动机和nonmotor障碍在PD发病机制的发展。

 数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

 的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

 作者的贡献

陈Qing-Jun王,我顿时同样导致了这项工作。

 确认

这项工作在一定程度上是由中国国家自然科学基金(81570725和81570725)虹宇靖。

 补充材料

我们发现的表达 γ在嗅球-H2X免疫组织化学技术,僧帽细胞的阳性细胞水平与相类似 β加染色。结果表明,的数量 γ-H2X-positive细胞位于嗅球僧帽细胞层的显著的高于h αsyn组比对照组(图a和b S1)。图S1: (a)代表图像显示了积极的 γ-H2X嗅球在7个月后病毒注入。(b)的数量 γ-H2X-positive细胞嗅球在7个月后病毒注入。 ∗ ∗ p < 0.01 与对照组相比, n = 5 。我们已经提供了所有原始免疫印迹的照片。图S2:免疫印迹的原始图片。(一)表明对照组(B),则表明h αsyn (A53T)组。(一)在中脑p62的表达。(b) Grp78的表达和中脑砍。(c)在中脑Grp78的表达。(d)砍在中脑的表达。(e) CaMK的表达 β2侧纹状体。(f) GAPDH在同侧纹状体的表达。(g) CaMK的表达 β2侧纹状体。(h) NR2B的表达在侧纹状体。

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