子弹头碱A通过刺激小胶质细胞释放吗啡A抑制内脏痛觉和脊髓突触可塑性

抽象的

背景．内脏疼痛是最常见的疼痛类型之一，特别是腹部与胃肠疾病有关。散装群岛A（BAA），孤立的Aconitum炸药这种药在中国是用来治疗慢性疼痛的。本研究旨在探讨BAA内脏抗刺激作用的机制。方法．于出生后第10天采用结肠灌注2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)联合应用异型间歇性慢性应激(HeICS)建立大鼠慢性内脏超敏反应模型。结果．慢性内脏过敏的大鼠模型表现出显着的腹部腹部戒断反应和机械痛觉痛觉痛觉，其通过单一皮下施用BAA（30和90）进行剂量依赖性衰减 μ克/公斤)。预处理用小胶质细胞抑制剂米诺环素，抗血清，和κ-阿片受体拮抗剂完全阻断baa诱导的内脏镇痛和机械性镇痛过敏。采用全细胞膜片钳方法记录脊髓背角板II神经元自发兴奋性突触后电流(sEPSCs)。tnbs处理大鼠的频率(而非振幅)明显高于naïve大鼠。BAA (1μM)明显降低tnbs处理大鼠sEPSCs的频率，但naïve大鼠没有。baa抑制的脊髓突触可塑性被二甲胺四环素、抗肾上腺皮质激素A和抗血清阻断κ-opioid受体拮抗剂。Dynorphin A也抑制了脊柱突触可塑性κ-opioid受体依赖的方式。结论．这些结果表明，BAA通过刺激脊髓小胶质细胞释放抗啡肽A，激活突触前，从而产生内脏抗刺激感受κ- 传入神经元的致磷受体，抑制脊柱突触塑性，突出了微胶质细胞和神经元之间的新型相互作用模式。

1.介绍

内脏疼痛是指由伤害性刺激引起的疼痛，以激活内脏器官（如胸部和腹部）中的伤害感受器。它是临床上最常见的疼痛类型之一，尤其是腹部疼痛，通常与胃肠道疾病有关，如肠易激综合征、功能性消化不良和炎症性肠病。患者的结肠炎症使初级传入神经元致敏，引起内脏疼痛[1］.此外，生活中的压力也可以诱导内脏过敏或疼痛[2- - - - - -4］.目前，慢性内脏疼痛仍然很难在临床上进行治疗[5- - - - - -7］.因此，研究人员致力于寻找更有效的方法来减轻内脏疼痛。子弹头碱A (buyaconitine A, BAA)是一种二萜生物碱Aconitum炸药，属于“乌头碱类”生物碱。在片剂、肌肉注射、软凝胶胶囊等剂型中，自1985年在中国批准以来，一直用于治疗慢性疼痛[8，9］.BAA在许多疼痛超敏的啮齿动物模型中表现出躯体抗刺激作用，包括福尔马林诱导的强直性痛觉过敏[9]、脊髓神经结扎-紫杉醇诱导的神经性疼痛和骨癌性疼痛[10.，11］.然而，BAA对内脏疼痛的镇痛作用尚未得到系统的研究。

已经假设了各种建议，用于BAA或其类似物的抗伤害作用的机制。依赖依赖性钠（NAV）频道，如Nav1.7，Nav1.8和Nav1.9频道，是治疗神经病疼痛和其他慢性疼痛的靶分子[12- - - - - -15］.与Nav通道的相互作用被广泛报道与BAA及其类似物的抗伤害作用有关。以往的研究表明，传入神经元中Nav1.7和Nav1.8通道的状态依赖性阻断被认为是baa诱导大鼠长期皮肤抗接种的一种佐剂[8］.最新的研究表明，BAA可降低背根神经节神经元的高兴奋性，该神经损伤是由使用依赖的河豚毒素敏感的Nav1.3和Nav1.7通道的封锁所引起的。11］.此外，有人提出，去甲肾上腺素和5 -羟色胺的下行抑制传递的激活与BAA及其类似物新乌头碱、3-乙酰乌头碱和高乌头碱的抗伤害感受作用有关[9，16，17］.相反，我们的实验室最近证实，BAA及其类似物乌头碱、bullatine和lapiconitine，通过刺激脊髓小胶质细胞表达dynorphin A，可阻断脊髓神经结扎诱导的神经性疼痛[10.，18- - - - - -20.］.

目前的研究旨在评估BAA的antinociceptive效应模型的内脏过敏和测试的假设机制BAA内脏镇痛效应是通过刺激脊髓小胶质的延伸dynorphin我们首先建立大鼠模型结肠过敏的结肠灌流TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)，然后应用异型间歇性慢性应激(HeICS)，然后测试BAA的内脏抗伤害感受作用。之后，小胶质细胞抑制剂米诺环素，抗吗啡A抗血清，和κ采用-阿片受体拮抗剂nornbi干预BAA镇痛。此外，据报道BAA可抑制c纤维刺激的长期电位，增强紫杉醇诱导的神经病大鼠脊髓突触传递[21］.我们假设从小胶质细胞释放的抗啡肽A会激活突触前κ- 传入神经元的致磷蛋白受体，导致抑制脊柱突触可塑性和中央敏感性。因此，通过使用全细胞膜片钳技术，从TNBS处理的大鼠建立了脊髓背角的自发兴奋后突触电流（SEPSCs）的记录，以测试BAA对脊柱突触塑性的可能抑制作用。

2.材料和方法

2.1。药物和试剂

子弹头碱A (BAA)、二甲胺四环素和降双萘托啡胺二盐酸盐(nor-BNI)分别购自泽朗生物制药(南京)、原叶生物技术(上海)和Abcam(剑桥)。2,4,6-三硝基苯磺酸 -瓜丹诺蒙德（5. -GNTI）是从Sigma-Aldrich（圣路易斯，Mo，USA）获得的。yggflrrirpklkwdnq的ygnorphin a（1-17）由Dan Gang Peptides Co.（杭州，中国）合成，其纯度不低于98％。兔Dynorphin A抗血清是从凤凰药物（伯灵名，CA，USA）购买的，其特异性对达尔胺A（100％），但不是Dynorphin B（0％），β脑内啡(0%),α-新内啡肽(0%)，或亮氨酸脑啡肽(0%)，根据制造商的描述。其他实验室的抗原吸收试验也证实了其特异性[22，23］.除TNBS在10%乙醇/90%生理盐水中溶解外，所有试剂和药物均在0.9%生理盐水或人工脑脊液中稀释或溶解。

２.２.动物

雌性Sprague-Dawley幼鼠，母鼠为养育母鼠，来自钱比生物技术公司（中国上海）。这些幼鼠在22日龄时断奶，然后每笼饲养三只。动物被安置在受控环境中（12/12） hr明暗循环，23°C），接收水和食物随意．研究人员对行为测试感到蒙羞。该研究方案由国立健康研究院的动物护理指南，上海交通大学医学院实验动物委员会批准。

２.３.新生儿结肠炎症的诱导

为了诱导新生儿炎症，将TNBS (130 mg/kg，相当于约22克幼犬的2.86 mg)溶于200毫升μ将含有10％乙醇的盐水含有10％乙醇的盐水中2厘米在后期10天的雌性幼崽中注射到雌性幼崽中。在结肠灌注期间用2％异氟醚温和地麻醉新生儿幼豆大鼠。对照组的幼崽以相同体积的盐水灌注。为了防止从冒号中渗漏，幼崽抬头姿势，肛门关闭约2分钟[24，25］.

2.4. 异型间歇性慢性应激（HeICS）

HeICS协议涉及日常和多种应激源，已被证明在成年大鼠中诱发类似焦虑的行为和内脏超敏感[26- - - - - -30.］.对TNBS大鼠和生理盐水大鼠连续2周进行了4种随机安排的应激实验，即回避水应激、冷约束应激、强迫游泳应激和足电刺激。将四种应激实验按顺序圈到同一只大鼠身上，分别在上午和下午进行应激实验。对照组大鼠除换笼外不受干扰。对于水回避应激，大鼠被放置在一个圆柱体上2小时( ）作为塑料容器中间的一个岛( ）在离顶部2-3厘米的地方充满了水。在强迫游泳应激中，老鼠被强迫在一个塑料容器中游泳20分钟( ）填充到25 容器顶部以下厘米深度，水温为 ．对于冷约束应力，大鼠被限制在一个透明的塑料容器中( ）有10~15个孔，确保正常呼吸。抑制容器置于4°C冰箱中45分钟。对于脚电击，老鼠被放置在恐惧调节箱( )，电击电流为0.5 mA，持续10秒，以1分钟为间隔重复30次。

2.5. 大鼠鞘内注射

鞘内注射方法如前所述[31，32］.简单地说，用2%异氟醚麻醉大鼠，切除左大腿背部和外侧表面的腰区。一个50μl汉密尔顿注射器连同27号针插入L5和L6椎体之间，直至到达鞘内间隙，如尾部抽动所示。药物或载具的注射量为10μl

2.6。内脏运动对分级结直肠扩张的反应评价

通过对先前描述的响应进行响应来评估内敏感性，如前所述[33］.依从性方面，气囊(直径7-8毫米)膨胀过夜以拉伸乳胶在前一天进行腹部回退反射评估。先禁食24小时，异氟醚麻醉大鼠，将涂有甘油的球囊插入结肠，在离肛门2- 3cm处与尾部固定。气球通过t型管与台式血压计相连。大鼠醒来后有30分钟的时间适应环境。然后在4种不同的压力(20,40,60,80mmhg)下进行结直肠扩张。每个压力下的膨胀维持20秒，间隔5分钟，重复3次。结肠扩张后，大鼠在每种压力下逐渐表现出腹部退缩反应。腹部回退反射评分标准如下:0，大鼠行为无明显变化;1、大鼠不动或仅做简单的头部运动; 2, the abdominal muscles began to contract; 3, the low abdominal walls were lifted off the bottom of the box or significantly contracted and flattened; and 4, the abdominal walls were accompanied the bodies and pelvises were arched or the testicles were lifted.

2.7。验证机械痛觉

为了评估机械痛觉过敏，研究人员将大鼠带入试验室，并将其放置在金属网格上的有机玻璃盒子中( )．然后使大鼠适应试验环境至少30分钟。用2450分光光度计测量后爪后退阈值 CE Electronic Von Frey hair（美国加利福尼亚州伍德兰山IITC生命科学公司）。使用带有15号单丝的电子手持式传感器，垂直于后爪的内侧表面，力逐渐增加（范围为0.1至90 g） 直到老鼠突然舔或缩回它们的后爪。自动记录产生退出响应的最低力，并将其视为paw退出阈值。在每个时间点以大约3分钟的间隔进行三次重复测量，并取其阈值的平均值。

2.8。脊髓切片制备

大鼠脊髓切片制备方法已在前面介绍[34］.简单地说，将4周龄大鼠深度麻醉，将L4-L6腰大肌迅速转移到预氧、冰冷改性ACSF中，其中(在mM中)含有80 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH₂宝₄，0.5 cacl.₂3.5 MgCl₂，25纳科_3.，75蔗糖，1.3钠抗坏血酸和3.5辛基钠，pH 7.4和310-320 mOSM的渗透压。打开硬脑膜并切割背根部后，将脊髓切成400 μ在vt1000s vibraatome（徕卡，德国）的m切片。然后在35℃下在含有（以mM）125 NaCl，2.5kCl，2 CaCl的预氧化溶液中在35℃下孵育约1小时。₂1 MgCl₂1.25不₂宝₄26 NaHCO_3.pH值为7.2，测得的渗透压为310-320 mOsm。将脊髓切片转入水下记录室，以3ml /min的预充氧记录液灌注后进行全细胞记录。

2.9. 全细胞膜片钳记录

采用薄壁玻璃微细管(1.0 mm OD, 0.5 mm ID;Sutter Instruments, Novato, CA, USA)与水平拉器(P-87, Sutter Instruments)。其渗透系数为7-12 MΩ当它们填充含有以下的移液管溶液时（mm）：130钾葡萄糖酸钾，4 na₂ATP，5kCl，20 HEPES，0.5 nagTP和0.5 EGTA，pH为7.3，测定的渗透压为310-320 mOSM。在血清形成后（密封电阻：2-50克Ω)，膜破裂，获得全细胞电压钳结构。

sEPSC记录，10μM Biculline和2 μ在浴液中加入马钱子碱以防止抑制反应。脊髓背角神经元在-70 mV钳位。本研究记录的脊髓背角神经元串联电阻均在30 M以内Ω．使用Axoclamp 200B放大器和pCLAMP软件(Axon Instruments, Foster City, CA, USA)获取数据并进行分析。两种药物都是通过交换含有已知药物浓度的灌注溶液来应用的。

2.10。统计分析

所有数据如下所示： (SEM)。采用单因素和重复测量的双向方差分析，然后采用Fisher的事后分析来比较各组的均数。 被认为具有统计学意义的差异。

3.结果

3．1.TNBS灌注和HeICS应用诱发内脏痛觉和机械异位痛

在后期10天，4周后，对几组幼犬大鼠灌注生理盐水或TNBS结肠炎症，然后4周后的历史，其中包括水避免压力，冷抑制应力，强制游泳压力和电力冲击（图1(一))．在最后一次使用HeICS后，测量腹部对分级结肠扩张的退缩反射和对机械刺激的后爪退缩阈值。如图所示1 (b)，球囊膨胀的结直肠膨胀诱导以压力依赖性方式（20-80mmHg）引起腹部戒断响应。与对照大鼠相比，灌注与TNB或Heics的应用显着提升结直肠差异诱导的压力响应曲线（ 通过重复测量的双向方差分析和Fisher的事后分析)。更显著的是，两次TNBS灌注后应用HeICS加重了腹部超敏反应评分，该评分高于单独应用TNBS或HeICS ( 通过重复测量的双向方差分析，然后是Fisher的事后分析)。此外，用Von Frey电毛测量后爪缩回阈值。与对照组大鼠相比，TNBS治疗和HeICS应用均显著降低了爪脱阈值。更显著的是，TNBS灌注和HeICS双重处理降低了后肢撤足阈值，低于TNBS灌注和HeICS单独处理( 通过单因素方差分析和Fisher的事后分析)。因此，我们随后用TNBS灌注和HeICS双重刺激大鼠来测试BAA的镇痛作用。

3.2。皮下施用BAA产生的内脏抗闭合症

TNBS+ heics处理的三组大鼠分别皮下注射生理盐水(1ml /kg)或BAA(30或90)μ克/公斤)。根据我们之前的研究发现，神经病变大鼠皮下注射BAA后1小时，其抗超敏作用达到峰值[10.]，在注射1 h后评价BAA的内脏镇痛作用。如图所示2(一个)，球囊膨胀引起的结直肠膨胀在盐水处理的大鼠中引起压力依赖性的腹部戒断超敏反应。皮下注射BAA(30和90μG /kg)剂量依赖性降低压力-响应曲线( 通过重复测量的双向方差分析，然后是Fisher的事后分析)。同样，在注射后1小时测定BAA的机械抗痛觉作用。TNBS+HeICS后爪双重治疗产生机械性痛觉过敏，BAA注射可剂量依赖性地减轻( 通过单因素方差分析和Fisher后置分析;数字2 (b))．

３．３．baa通过刺激脊髓小胶质细胞Dynorphin A的表达而诱导内脏镇痛

BAA及其类似物蛋白醛和汉古霉素已被证明特异性刺激脊髓微胶中的表达[10.，18］.为了测试BAA是否以小胶质细胞依赖的方式产生内脏抗接种感受，小胶质细胞抑制剂米诺环素[35，36)是应用。四组TNBS+ heics预处理大鼠在最后一次应激后分别给予两次处理。两组分别腹腔注射生理盐水(1ml /kg)或米诺环素(30mg /kg)， 2小时后皮下注射生理盐水(1ml /kg)或BAA (90μ克/公斤)。在最后一次注射后1小时进行腹部和后爪行为测试。与盐水处理的大鼠相比，皮下注射BAA抑制TNBS + Heics诱导的腹部戒断反应。虽然腹腔内注射米诺环素没有显着影响基线腹部戒断反应，但其预处理完全阻断了腹部中的BAA诱导的内脏抗闭合体（ 通过重复测量的双向方差分析，然后是Fisher的事后分析;数字3（a）)．在BAA诱导的机械抗静电中，米诺环素的抑制作用在后爪（ 通过单因素方差分析和Fisher后置分析;数字3 (b))．

为了检测BAA是否通过刺激胆啡肽A的表达产生内脏抗刺激作用，胆啡肽A抗血清[10.，18)是应用。6组TNBS+ heics预处理大鼠在最后一次应激后分别给予两次治疗。这两种治疗方法均为鞘内注射生理盐水(10μl），空白兔血清（1：10稀释，10 μl)，或抗血清(1:10稀释，10μl)， 0.5小时后皮下注射生理盐水(1ml /kg)或BAA (90μg/kg）。在最后一次注射后1小时进行腹部和后爪行为测试。与生理盐水对照组相比，皮下注射BAA可产生显著的内脏抗过敏作用。鞘内注射空白血清或强啡肽A抗血清对基线内脏超敏阈值没有显著影响。然而，鞘内注射强啡肽A抗血清（而非空白血清）的预处理完全抑制皮下注射BAA诱导的腹部内脏抗伤害作用( 通过重复测量的双向方差分析，然后是Fisher的事后分析;数字3 (c))．甲酚A抗血清对baa诱导的后爪机械性抗异位痛有完全抑制作用( 通过单因素方差分析和Fisher后置分析;数字3 (d))．

抗吗啡A是已知的通过作用于κ-阿片受体[37- - - - - -39］.因此，我们进一步检测BAA是否也具有内脏抗超敏作用κ使用的容纳受体κ-opioid受体拮抗剂NOR-BNI [40］.四组TNBS+ heics预处理大鼠在最后一次应激后分别给予两次处理。两组分别皮下注射生理盐水(1ml /kg)或降bni (10mg /kg)， 2小时后皮下注射生理盐水(1ml /kg)或BAA (90μ克/公斤)。在最后一次注射后1小时进行腹部和后爪行为测试。如图所示3 (e)和3 (f)，皮下注射norbni对TNBS+ heics治疗大鼠的基线内脏超敏评分和后爪机械性痛觉过敏均无显著影响。但其预处理完全阻断了baa引起的腹部内脏镇痛和后爪机械性镇痛过敏( 通过单向或重复测量的双向方差分析，然后是Fisher的事后分析)。

3．4．BAA减少tnbs增强的脊髓背角神经元突触传递

如图所示1 (c)甚至在我们以前的研究中，TNBS治疗组的大鼠在与对照组相比，在内脏疼痛表型中表现出明显和优异的性能。此外，在4周内记录脊髓背角膜II神经元中的SEPSCs。因此，为了简化随后记录SEPSCs的建模方法，我们比较了Naïve大鼠和TNBS预处理大鼠之间的脊髓背孔突触传递。两组幼犬分别接受了常规盐水和TNB的结肠灌注，在第十天的出生日内。十八天后，杀死大鼠，除去脊柱扩大。通过使用全细胞贴片夹子，将SEPSCS记录在背角膜II神经元中。如图中的代表迹线所示4(一)和4 (b)并进一步分析图中的PCLAMP软件4 (c)和4 (d)， tnbs处理大鼠背角神经元sEPSCs的频率明显高于naïve处理大鼠( 通过单因素方差分析和Fisher的事后分析)。然而，naïve和tnbs处理的大鼠sEPSCs的振幅没有显著变化。结果表明，在TNBS诱导的内脏超敏状态下，脊髓突触传递或突触可塑性增强。

进一步检测ACSF灌注液中溶解的BAA对sEPSCs的抑制作用。如图所示4，灌注1μM BAA处理10分钟可显著降低tnbs处理大鼠背角神经元sEPSCs的频率( 通过单因素方差分析和Fisher的事后分析)。然而，BAA未能改变naïve大鼠背角神经元sEPSCs的频率。相比之下，BAA处理没有显著改变未处理大鼠和tnbs处理大鼠sEPSCs的振幅。

3．5．二甲胺四环素，甲酚A抗血清，5 -GNTI阻断BAA-和Dynorphin a诱导的脊髓突触可塑性抑制

为了确认在BAA诱导的脊柱突触塑性抑制中的微胶质表达的因果作用，在SEPSC记录测定中使用微胶质抑制剂米诺环素和Dynorphin A抗血清。如图所示5(一个)- - - - - -5（c），灌注1μBAA的m 10分钟显着降低了SEPSCs的频率而不改变振幅。然而，预处理（早些时候30分钟）灌注米诺环素（10 μ米)(41]，溶解于ACSF灌注液中，完全阻断BAA可抑制TNBS处理大鼠脊髓背角神经元中SEPSC的增强频率( 通过单因素方差分析和Fisher的事后分析)，尽管它没有显著改变增强突触传递的基线值。同样，灌注抗血清(1:50稀释)，溶解在ACSF灌注液中，没有显著改变基线突触传递。然而，其预处理(30分钟前)完全逆转了baa对tnbs处理大鼠脊髓背角神经元sEPSCs频率增强的抑制作用( 通过单因素方差分析和Fisher的事后分析)，但对sEPSCs的振幅没有显著影响(图5（d）- - - - - -5 (f))．

为了进一步探索激活κ-阿片类受体和baa增强了脊髓突触传递的抑制作用，具有特异性的阻断作用κ-阿片类受体拮抗剂 -gnti [42，43]了。如图所示6（a）- - - - - -6 (c)，预处理（早先30分钟），浴申请5 -GNTI (1μM） 溶解于ACSF灌注液中，完全阻断BAA可抑制TNBS处理大鼠脊髓背角神经元中SEPSC的增强频率（但不抑制振幅）( 通过单因素方差分析和Fisher的事后分析），尽管它没有显著改变基线突触传递。此外，灌注外源性强啡肽A（1 μ米)(44]处理15分钟后，脊髓背角神经元sEPSCs的频率(而非振幅)增强明显受到抑制，灌注5 -GNTI (1μm）（ 通过单因素方差分析和Fisher后置分析;数据6 (d)- - - - - -6（f）)．

4.讨论

早期不良经历可能改变晚年对压力的神经和内分泌反应，表现为对内脏疼痛和皮肤刺激的反应增强[45- - - - - -47］.人体的表面反应与内脏器官的变化有必然的关系。既往研究也证实，内脏病变在体表确实有相应的反应，如内脏疼痛，并伴有体表辐射疼痛，即所指疼痛。在不同的组织和器官之间有一种相声。内脏的自主神经可能在脊髓的某一段与疼痛神经混合，导致内脏病变，内脏病变通常反映在负责脊髓的体表区域的疼痛，这被称为“所指疼痛”。内脏病变常伴有牵涉性疼痛，器质性内脏疼痛常发现较固定的皮肤敏感区。痛觉过敏也可以解释为来自病变内脏器官和受累身体部位的传入神经纤维的形成，这些传入神经纤维从同一后根进入脊髓，并汇聚到脊髓丘脑束的同一神经元。因此，在动物模型中，除了内脏运动对分级结肠扩张的反应外，大多采用后爪机械性痛觉过敏来评估慢性过敏反应。本研究大鼠在出生后第10天接受TNBS灌注，HeICS应用后出现明显的腹部皮肤痛觉过敏和后爪机械性痛觉过敏。在这个慢性内脏超敏模型中，皮下注射BAA剂量依赖性地减少了腹部退缩反应和后爪机械性痛觉过敏。 The results indicate that BAA produces visceral antinociception in the model of chronic visceral hypersensitivity induced by the combination of TNBS+HeICS treatments and expand its analgesic spectrum. BAA and its analogs aconitine, bullatine, and lappaconitine have been extensively reported to exhibit antinociception in various somatic painful hypersensitivity models, such as spinal nerve ligation- and paclitaxel-induced neuropathic pain, formalin- and complete Freund’s adjuvant-induced inflammatory pain, bone cancer pain, and diabetic pain [10.，18，19，21］.应该注意,尽管我们没有测试它在当前的研究中,英国机场管理局及其类似物已被证明有轻微或小抑制性影响正常痛阈值的天真的大鼠后爪或侧单边周围神经创伤性神经性老鼠(10.，11，21］.综上所述，乌头生物碱特别是BAA在躯体和内脏超敏状态均能产生特异性的抗刺激作用。

我们进一步证明了通过刺激Dynorphin A的脊髓显微表达来产生的内脏抗妇生。该结论得到了以下研究结果。（1）我们以前的研究表明，BAA及其类似物穴位，珠三肽和汉古霉素特异性刺激了微胶质细胞的二肠病A的表达，但不具有新生儿和成年大鼠的星形胶质细胞或神经元，即使后两种细胞还表达和分泌的达氏霉素A.此外，鞘内注射征管穴位特别诱导神经疗法大鼠对侧和同侧脊髓中达尔啡虫A的显微刺激的微胶质（但不是星形细胞或神经元）表达[10.，18，19，48］.(2)经皮下注射小胶质细胞抑制剂米诺环素预处理后，BAA的内脏镇痛作用完全阻断。(3)特别是鞘内注射抗甲酚A抗血清预处理可完全减弱baa诱导的皮下内脏抗刺激作用。(4)敌敌菌A是一种内源性配体κ-阿片受体[49，50.］.预处理采用皮下注射κ-阿片受体拮抗剂norbni完全阻断baa诱导的内脏镇痛。此外，在内脏超敏模型大鼠中，baa诱导的后爪机械抗痛感也可通过应用二甲胺四环素、抗norphin A血清和降bni而减弱，与脊髓神经结扎诱导的神经病大鼠相同[10.］.所有这些结果表明，在脊髓小胶质细胞中表达的抗肾上腺素A介导了内脏和身体的抗过敏作用。

中枢敏化是慢性疼痛疾病病理的一个关键特征，它指的是神经损伤、周围伤害性刺激或组织损伤或炎症后脊髓背角传入神经元突触效能或突触可塑性的增强[51.- - - - - -54.］.毒性刺激后突触可塑性的延长是中枢增敏的关键电生理基础，这主要与突触后神经元神经递质谷氨酸的释放和n -甲基- d -天冬氨酸(NMDA)受体的激活有关[52.，54.，55.］.增加的突触传递导致疼痛阈值下降，疼痛响应的扩张，以及对非金属区域的疼痛敏感性的传播。临床上，中央致敏导致内脏，皮肤和肌肉中的疼痛超敏反应。保持中央致敏是一种重要的慢性疼痛的重要机制，包括持续炎症和神经病疼痛[55.，56.］.我们证明了TNBS处理的大鼠背角板II神经元中sEPSCs的频率(而不是振幅)明显高于naïve大鼠，这表明TNBS诱导的新生儿内脏炎症建立了脊髓突触可塑性和中枢敏化。这与之前结肠炎症导致中枢敏化的报告一致[54.，57.，58.］.

与BAA特异性抑制紫杉醇诱导的神经病大鼠背角板II神经元中增强的sEPSCs或mEPSCs的研究结果一致(Zhu et al. [21]），我们的研究表明，BAA在TNBS处理的大鼠中脊髓背角神经元的突触可塑性显着降低，但没有显着影响幼稚大鼠的突触传播。结果表明，BAA特异性抑制脊柱突触塑性和中央敏化，这可能是BAA特异性地衰减由TNB和Heics应用组合诱导的后爪中的腹部和机械痛觉中的内脏伤害的基础。我们进一步证明，BAA通过刺激Dynorphin A的微胶质表达，作为米诺环素，Dynorphin A抗血清和具体的刺激，降低脊柱突触塑性κ-阿片类受体拮抗剂 -GNTI完全阻止了BAA抑制的增强型脊柱突触传递。Dynorphin A是内源性阿片类药物神经递质，可以在脊髓和大脑的许多部分中制作，如纹状体，海马和下丘脑[59.］.它通过突触前行使κ-阿片受体，减少钙^２＋-依赖的谷氨酸分泌，从而抑制海马、下丘脑弓状核、丘脑后室旁核和其他核的突触传递和神经可塑性降低[60.- - - - - -63.］.此外,κ脊髓神经元中-阿片受体激动剂dynorphin A和U69593对自发钙振荡的抑制作用主要由谷氨酸神经传递驱动，而谷氨酸神经传递完全被选择性阻断κ受体拮抗剂nor BNI。与报道的κ-阿片受体的表达κ-阿片受体在脊髓谷氨酸神经元中富集，在突触前间隙中相对富集[64.］.实际上，我们确认达氏毒素A抑制了脊髓背角薄片II神经元中的增强突触谷氨酸盐传递κ-opioid受体依赖的方式。

综上所述，我们的结果说明了BAA在小胶质细胞和脊髓背角神经元之间的交互作用，即BAA通过g /cAMP/PKA/p38刺激小胶质细胞表达和分泌抗肾上腺素aβ/CREB信号转导机制[48，它通过小胶质神经元突触并作用于突触前κ-传入神经元中的阿片受体。突触前神经元激活后κ在内脏超敏状态下，增强的神经元突触谷氨酸传递和随之产生的突触后NMDA电流减少，导致中枢敏化和抗接种感受抑制。图中展示了BBA在内脏超敏反应中的抗伤害性感受通路7．

缩写

ACSF：	人工脑脊液
英国机场管理局:	Bulleyaconitine一
兴趣：	异型间歇性慢性应激
导航:	电压依赖性钠
SEPSC：	自发兴奋后突触电流
TNBS:	2,4,6-三硝基苯磺酸。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

的利益冲突

作者声明在这项工作中没有相互竞争的利益。

作者的贡献

YXW和JC构思和设计了实验。SNH，JW，LTH和PJJ进行了实验。SEN，JC和JW分析了数据。YXW，JW和JC准备了这篇论文。盛南黄和金宝威在这项工作中同样贡献。

致谢

本研究部分得到国家自然科学基金(#81571326 - JC和#81673403 - YXW)、上海市工业转化项目(#15401901300 - YXW)和上海市精神病重点实验室开放基金(16-K01 - YXW)的资助。

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