NP 神经可塑性 1687 - 5443 2090 - 5904 Hindawi 10.1155 / 2020/1484087 1484087 研究文章 Bulleyaconitine抑制内脏伤害感受和脊髓突触可塑性通过刺激小胶质Dynorphin释放 黄 剩男 1 2 魏 金宝 1 2 黄 Lan-Ting 1 居 Pei-Jun 1 https://orcid.org/0000 - 0002 - 7428 - 9359 程ydF4y2Ba 龚京红 1 https://orcid.org/0000 - 0001 - 5557 - 0076 王 Yong-Xiang 2 易 明 1 上海精神疾病重点实验室 上海市精神卫生中心 上海交通大学医学院 上海 中国 shsmu.edu.cn 2 王的实验室 学院的药店 上海交通大学 上海 中国 sjtu.edu.cn 2020年 23 5 2020年 2020年 05年 01 2020年 14 02 2020年 11 03 2020年 23 5 2020年 2020年 版权©2020剩男黄等。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

背景。内脏疼痛是最常见的一种类型的疼痛,尤其是在腹部与胃肠疾病相关联。Bulleyaconitine (BAA),隔绝 乌头bulleyanum,规定在中国治疗慢性疼痛。本研究旨在评估机制BAA发自肺腑的镇痛效应。 方法。慢性内脏过敏的老鼠模型成立的结肠灌注2,4,6-trinitrobenzene磺酸(TNBS)在产后一天10 coapplication异形的间歇性的慢性压力(HeICS)。 结果。慢性内脏过敏的老鼠模型展现出非凡的腹部戒断反应和后爪机械痛觉过敏,由单一剂量依赖性弱皮下BAA(30和90年的政府 μ克/公斤)。与小胶质抑制剂预处理二甲胺四环素,dynorphin抗血清, κ阿片受体拮抗剂BAA-induced内脏镇痛效应和机械antihyperalgesia完全阻塞。自发兴奋性突触后电流(sEPSCs)在脊髓背角神经元板二世用全细胞膜片箝记录。频率(但不是振幅)从TNBS-treated老鼠明显高于天真的老鼠。BAA (1 μ米)的频率显著降低sEPSCs从TNBS-treated老鼠但不是天真的老鼠。BAA-inhibited脊髓突触可塑性被二甲胺四环素,dynorphin抗血清,和 κ阿片受体拮抗剂。Dynorphin也抑制脊髓突触可塑性 κ阿片receptor-dependent方式。 结论。这些结果表明,BAA产生发自内心的镇痛效应通过刺激脊髓小胶质释放dynorphin,激活突触前 κ阿片受体传入神经元,抑制脊髓突触可塑性,突出小说小胶质细胞和神经元之间的相互作用模式。

 上海精神疾病重点实验室开放的格兰特 16-K01 上海工业转化项目 15401901300 中国国家自然科学基金 81571326 81673403 1。介绍

内脏痛是指痛引起的有害刺激激活痛觉受器的内部器官如胸部和腹部。这是最常见的一种类型的诊所,尤其是腹部疼痛通常与胃肠疾病有关,如肠易激综合症、功能性消化不良、炎症性肠病。结肠炎症的病人糖分会让初级传入神经元造成内脏疼痛( 1]。此外,压力在生活中也能导致内脏过敏或疼痛 2- - - - - - 4]。目前,慢性内脏痛仍难以治疗临床[ 5- - - - - - 7]。因此,调查人员正在致力于寻找更有效的方法减轻内脏疼痛。Bulleyaconitine (BAA)是一种二萜生物碱分离 乌头bulleyanum”,属于“aconitine-like生物碱。平板电脑的配方、肌内注射和软凝胶胶囊,它已被用于治疗慢性疼痛自1985年批准在中国( 8, 9]。BAA展品体细胞镇痛效应在痛苦的过敏症,许多啮齿动物模型包括formalin-induced主音痛觉过敏( 9),脊神经结扎paclitaxel-induced神经性疼痛,和骨癌疼痛( 10, 11]。然而,antinociceptive BAA对内脏痛的影响尚未系统研究。

各种建议被假定为机制antinociceptive BAA或其类似物的影响。压敏电阻器(Nav)钠通道,如Nav1.7 Nav1.8,和Nav1.9频道,承诺目标分子治疗神经性疼痛和其他慢性疼痛 12- - - - - - 15]。与导航的互动渠道被广泛报道的antinociceptive BAA及其类似物的影响。先前的研究表明,依赖政府的封锁Nav1.7和Nav1.8渠道传入神经元的建议有助于BAA-induced长期皮肤的镇痛效应在大鼠佐剂( 8]。最新的研究表明,BAA减毒引起的背根神经节神经元的兴奋过度use-dependent封锁了神经损伤的tetrodotoxin-sensitive Nav1.3和Nav1.7频道( 11]。此外,它提出了激活的下行抑制传输通过去甲肾上腺素和5 -羟色胺与antinociceptive BAA的影响及其类似物mesaconitine 3-acetylaconitine, lappaconitine [ 9, 16, 17]。相比之下,我们实验室最近表明,BAA及其类似物乌头碱,bullatine, lappaconitine,皮下注射或鞘内,封锁了脊神经ligation-induced神经性疼痛的刺激脊髓小胶质的表达dynorphin ( 10, 18- - - - - - 20.]。

目前的研究旨在评估BAA的antinociceptive效应模型的内脏过敏和测试的假设机制BAA内脏镇痛效应是通过刺激脊髓小胶质的延伸dynorphin答:我们第一次建立的大鼠模型结肠过敏的结肠灌注TNBS (2、4、6-trinitrobenzene磺酸),紧随其后的是异形的断断续续的慢性压力的应用(HeICS),然后测试BAA的内脏antinociceptive效果。后来,小胶质抑制剂二甲胺四环素,dynorphin抗血清, κ阿片受体拮抗剂nor-NBI了干预BAA镇痛效应。此外,据报道,BAA抑制C-fiber-stimulated长期潜力和增强脊髓突触传递从paclitaxel-induced神经性老鼠 21]。我们假定dynorphin释放小胶质细胞激活突触前 κ阿片受体传入神经元导致抑制脊髓突触可塑性和中枢敏感化。因此最后,自发兴奋性突触后电流的记录(sEPSCs)脊髓背角,利用全细胞膜片钳技术,建立了从TNBS-treated老鼠来测试可能抑制BAA对脊髓突触可塑性的影响。

 2。材料和方法 2.1。药品和试剂

Bulleyaconitine (BAA)、二甲胺四环素和nor-binaltorphimine盐酸盐(nor-BNI)从Zelang购买生物制药(中国南京)原液生物技术(上海,中国),和Abcam(英国剑桥),分别。TNBS (2、4、6-trinitrobenzene磺酸)和5 ′ -guanidinonaltrindole (5 ′ -GNTI)获得Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。Dynorphin(- 17)的YGGFLRRIRPKLKWDNQ被丹帮派肽合成有限公司(杭州)纯度不低于98%。兔子dynorphin抗血清是购自凤凰制药(伯林盖姆、钙、美国),以其特异性dynorphin(100%),而不是dynorphin B (0%), β脑内啡(0%), α-neo-endorphin(0%)、或leu-enkephalin(0%),根据制造商的说明。也使得其特异性抗原的吸收从其他实验室测试 22, 23]。所有的试剂和药品被稀释或溶解在0.9%生理盐水或人工脑脊液(ACSF)除了TNBS溶解在10%乙醇/ 90%生理盐水。

 2.2。动物

女性Sprague-Dawley小狗有一个培育的老鼠妈妈是来自Qianbi生物科技公司(上海,中国)。这些小狗老鼠断奶年龄在22天,然后每笼住三个。动物们被安置在一个受控的环境中(12/12小时光暗周期,23°C),接收水和食物 随意。研究人员盲目行为测试。研究协议是实验动物委员会批准后,上海交通大学医学院动物保健国立卫生研究院的指导方针。

 2.3。诱导新生儿结肠炎症

诱导新生儿炎症,TNBS(130毫克/公斤,相当于为大约2.86毫克22-gram幼崽,200年解散 μl盐水含有10%乙醇)是通过2厘米注入雌性幼崽在产后第十天的结肠。新生儿小狗老鼠轻度麻醉在结肠灌注2%异氟烷。对照组的幼崽和同样体积的生理盐水灌注。防止泄漏的冒号,小狗被安排在一个低着头的姿势和肛门都关闭了大约2分钟 24, 25]。

 2.4。异形的断断续续的慢性压力(HeICS)

HeICS协议涉及日常和多个压力证明诱发焦虑行为和成年鼠的内脏过敏( 26- - - - - - 30.]。四种随机安排的压力实验,即。,water avoidance stress, cold restraint stress, forced swimming stress, and electricity foot shock, in a variable schedule for consecutive 2 weeks were applied to rats previously subjected to the TNBS or to saline rats. The four kinds of stress experiments were circled to the same rat in sequence and a stress experiment was conducted in the morning and afternoon, respectively. The control group rats were kept undisturbed except for changing cages. For the water avoidance stress, the rats were placed for 2 hours on a cylinder ( 6 厘米 直径 × 15 厘米 高 )作为一个岛屿中间的塑料容器( 60 × 60 × 60 厘米 )2 - 3厘米内注满水。强迫游泳应激,老鼠被迫在一个塑料容器(20分钟游泳 21 厘米 直径 × 55 厘米 高 )满25厘米深度低于容器的顶部与水的温度 25 ± 1 ° C 。寒冷的约束应力,老鼠被限制在一个透明的塑料容器( 5 直径 × 10 厘米 长 与10 ~ 15洞),确保正常呼吸。限制容器被放置在一个冰箱在4°C 45分钟。电电击,老鼠被放置在恐惧条件框( 15 高 × 16 宽 × 20. 厘米 长 ),电冲击电流是0.5 mA连续10秒,重复30次的间隔1分钟。

 2.5。大鼠鞘内注射

鞘内注射方法进行如前所述[ 31日, 32]。总之,老鼠和2%异氟烷麻醉的腰部,左大腿的侧面是剃。一个50 μl汉密尔顿与27-gauge针注射器连接之间插入L5和16种脊椎,直到鞘内空间的尾巴抽搐。车辆的药物或注射10卷 μl

 2.6。评估内脏运动的响应分级结直肠扩张

内脏过敏是评价分级响应结直肠扩张(如前所述 33]。对于合规,一夜之间,气球(7 - 8毫米直径)被夸大的乳胶的前一天腹部撤军反射评估。老鼠,禁食24小时前,与异氟烷麻醉和气球涂glycerinum插入到结肠和固定的尾巴从肛门2 - 3厘米。气球是通过一个三通管连接到桌面血压计。老鼠有30分钟以适应环境后醒了过来。气球然后在四个不同的膨胀压力(20、40、60和80毫米汞柱)的分级结直肠扩张。各压力膨胀保持20秒的间隔5分钟,重复了三遍。结直肠扩张后,老鼠在每个压力逐渐表现出腹部戒断反应。腹部撤军反射的评级标准如下:0,老鼠的行为没有显著变化;1、老鼠不移动或只有简单的头部动作; 2, the abdominal muscles began to contract; 3, the low abdominal walls were lifted off the bottom of the box or significantly contracted and flattened; and 4, the abdominal walls were accompanied the bodies and pelvises were arched or the testicles were lifted.

 2.7。测试机械痛觉过敏

评估机械痛觉过敏,老鼠带进考场,放置在一个有机玻璃框,这是在一个金属网格( 0.5 × 0.5 厘米 )。然后老鼠适应测试环境至少30分钟。后爪撤军阈值测量使用公元2450年电子·冯·弗雷的头发(IITC生命科学,森林山、钙、美国)。电子手持传感器数量15单丝垂直地使用内侧表面的后爪力逐渐增加(从0.1到90 g),直到大鼠后爪突然舔或收回。最低的力量,产生戒断反应记录自动视为爪子撤军阈值。三个重复测量在每个时间点的间隔大约3分钟,及其阈值取平均值。

 2.8。脊髓切片制备

方法获得大鼠脊髓切片准备是前面描述的 34]。总之,还是老鼠深麻醉和L4-L6腰椎放大很快被转移到可于和ice-cold-modified ACSF含有(80毫米)氯化钠,氯化钾的2.5,1.25不2阿宝40.5 CaCl23.5 MgCl225 NaHCO3抗坏血酸钠75蔗糖,1.3,和3.5丙酮酸钠,pH值7.4和310 - 320 mOsm同渗重摩。打开硬脑膜和削减背根后,脊髓是削减到400年 μm片在VT1000S vibratome(德国徕卡)。片被孵化大约1小时35°C可于解决方案包含(125毫米)氯化钠,氯化钾2.5,2 CaCl21 MgCl21.25不2阿宝426 NaHCO33.0,25 d -葡萄糖,1.3抗坏血酸钠,丙酮酸钠,pH值为7.2和310 - 320 mOsm测量同渗重摩。脊髓切片被转移到一个水下灌注记录室和可于前3毫升/分钟的录音解决方案全细胞记录。

 2.9。全细胞膜片箝记录

全细胞记录是在脊髓背角神经元进行玻璃微电极,这是由薄壁、玻璃毛细管套管(1.0毫米,0.5毫米ID;萨特仪器,诺瓦托、钙、美国)与水平拉出器(p - 87、萨特仪器)。他们的同渗重摩是7 - 12米 Ω当他们满吸管的解决方案包含以下(毫米):130葡萄糖酸钾,4 Na2三磷酸腺苷5氯化钾,20消息灵通的,0.5 NaGTP,和0.5 EGTA, pH值为7.3和310 - 320 mOsm测量同渗重摩。gigaseal形成后(密封阻力:2-50 G Ω),膜破裂获得全细胞电压钳位配置。

sEPSC录音,10 μM荷包牡丹碱和2 μ米马钱子碱被添加到溶液中防止抑制反应。脊髓背角神经元电压夹在板二世-70 mV。系列电阻为所有脊髓背角神经元记录在这项研究是在30米 Ω。数据获取和分析利用Axoclamp 200 b放大器和pCLAMP软件(轴突仪器,福斯特城、钙、美国)。应用的药物都是通过交换灌注的解决方案包含一个已知的药物浓度。

 2.10。统计分析

所有数据了 的意思是 ± 标准 错误 的 的意思是 (SEM)。单向和双向方差分析重复测量之后,费舍尔的事后分析被用于比较每组的方法。 P < 0.05 被认为是具有统计学意义的差异。

 3所示。结果 3.1。TNBS灌注和HeICS Application-Induced内脏伤害感受和机械触诱发痛

小狗的四组老鼠受到结肠灌注生理盐水或TNBS结肠炎症在产后第十天,和4周后两周的HeICS紧随其后,其中包括水避免压力、冷克制压力,强迫游泳应激,脚和电休克(图 1(一))。腹部戒断反应分级结直肠扩张和后爪撤军对机械刺激阈值测定HeICS上次后的应用程序。如图 1 (b)结直肠膨胀的气球通货膨胀引起腹部戒断反应与压力有关的方式(20 - 80毫米汞柱)。与TNBS灌注或应用HeICS明显解除结直肠distension-induced压力响应曲线,控制老鼠(相比 P < 0.05 重复测量双向方差分析之后,费舍尔的事后分析)。更重要的是,双与TNBS灌注治疗,随后HeICS应用加剧了腹部超敏反应分数,这是更大的比TNBS治疗或HeICS单独应用程序( P < 0.05 通过重复测量双向方差分析之后,费舍尔的事后分析)。此外,后爪撤军阈值测量通过使用电动·冯·弗雷毛。TNBS治疗和HeICS应用程序每个相比显著降低爪子撤军阈值控制老鼠。更重要的是,双治疗TNBS灌注和HeICS应用后爪撤军阈值下降,这是仅低于TNBS灌注或HeICS应用( P < 0.05 通过单向方差分析以及Fisher事后分析)。因此,老鼠双重挑战TNBS灌注和HeICS应用程序随后被用来测试antinociceptive BAA的影响。

时间表的内脏过敏试验协议(a)。腹部戒断反应分级结直肠扩张(b)和后爪撤军对机械刺激阈值(c)控制,TNBS, HeICS和TNBS + HeICS-treated老鼠。内脏过敏协议包括结肠灌注TNBS产后第十天,和4周后两周的HeICS紧随其后,其中包括水避免压力、冷克制压力,强迫游泳应激,脚和电冲击。并给出了数据 意味着 ± 扫描电镜 ( n = 8 在每组)。 ∗ 和#表示 P < 0.05 生理盐水相比控制和TNBS HeICS,或TNBS + HeICS治疗,分别由单向或双向方差分析重复测量之后,费舍尔的事后分析。

 3.2。皮下BAA内脏产生镇痛效应

三组TNBS + HeICS-treated老鼠收到一个皮下注射生理盐水(1毫升/公斤)或BAA(30或90 μ克/公斤)。基于我们之前的发现,BAA在神经性老鼠表现出峰值antihypersensitivity效应1小时后皮下管理( 10),BAA的内脏antinociceptive效果评估1小时后注射。如图 2(一个)结直肠膨胀的气球通胀诱导与压力有关的腹部撤军过敏症saline-treated老鼠。皮下注射的BAA (30 - 90 μ克/公斤)剂量依赖性降低压力响应曲线( P < 0.05 通过重复测量双向方差分析之后,费舍尔的事后分析)。同样,BAA的机械antihyperalgesic效果也是衡量注射后1小时。双重治疗后爪TNBS + HeICS生产机械痛觉过敏,这是剂量依赖性降低BAA注入( P < 0.05 通过单向方差分析以及Fisher事后分析;图 2 (b))。

bulleyaconitine的剂量依赖性抑制作用(BAA, 30和90年 μg / kg),皮下注射,TNBS灌注+ HeICS application-induced内脏过敏机械痛觉过敏(a)和(b)在大鼠。内脏过敏协议包括结肠灌注TNBS产后第十天,4周后两周的HeICS紧随其后,其中包括水避免压力、冷克制压力,强迫游泳、和电电击。并给出了数据 意味着 ± 扫描电镜 ( n = 8 在每组)。 ∗ 和#表示 P < 0.05 生理盐水相比控制和TNBS + HeICS治疗,分别由单向或双向方差分析重复测量之后,费舍尔的事后分析。

 3.3。BAA-Induced内脏镇痛效应是通过刺激脊髓小胶质Dynorphin的表达式

BAA及其类似物bullatine lappaconitine被证明特别刺激dynorphin脊髓小胶质细胞的表达( 10, 18]。测试是否BAA内脏microglia-dependent方式镇痛效应产生,小胶质细胞抑制剂二甲胺四环素( 35, 36)是应用。四组TNBS + HeICS-pretreated老鼠收到两治疗后持续压力应用。这两个治疗腹腔内注射生理盐水(1毫升/公斤)和二甲胺四环素(30毫克/公斤)2小时后的皮下注射生理盐水(1毫升/公斤)或BAA (90 μ克/公斤)。腹部和后爪行为测试1小时后进行注入。相比saline-treated老鼠,皮下注射的BAA抑制TNBS + HeICS-induced腹部戒断反应。尽管二甲胺四环素的腹腔内注射没有明显影响基线腹部戒断反应,其预处理完全阻塞BAA-induced腹部内脏镇痛效应( P < 0.05 通过重复测量双向方差分析之后,费舍尔的事后分析;图 3(一个))。二甲胺四环素的抑制作用也证实BAA-induced机械antihyperalgesia后爪子( P < 0.05 通过单向方差分析以及Fisher事后分析;图 3 (b))。

皮下的封锁效应,小胶质抑制剂二甲胺四环素(30毫克/公斤(a, b)),鞘内,dynorphin抗血清(1:10稀释,10 μl (c, d)),和皮下 κ阿片受体拮抗剂nor-BNI(10毫克/公斤(e, f)),在皮下注射bulleyaconitine——(BAA, 90 μ克/公斤)诱导内脏镇痛效应和机械antihyperalgesia TNBS + HeICS-treated老鼠。内脏过敏协议包括结肠灌注TNBS产后第十天,4周后两周的HeICS紧随其后,其中包括水避免压力、冷克制压力,强迫游泳应激,脚和电冲击。并给出了数据 意味着 ± 扫描电镜 ( n = 6 在每组)。 ∗ 和#表示 P < 0.05 生理盐水相比控制和TNBS + HeICS治疗,分别由单向或双向方差分析重复测量之后,费舍尔的事后分析。

测试是否BAA内脏产生镇痛效应通过刺激dynorphin的表达,dynorphin一抗血清( 10, 18)是应用。六组TNBS + HeICS-pretreated老鼠收到两治疗后持续压力应用。这两个治疗鞘内注射生理盐水(10 μl),空白的兔血清(1:10稀释,10 μl),或dynorphin抗血清(1:10稀释,10 μl), 0.5小时后的皮下注射生理盐水(1毫升/公斤)或BAA (90 μ克/公斤)。腹部和后爪行为测试1小时后进行注入。皮下注射生理盐水控制相比,BAA产生显著的内脏antihypersensitivity效果。鞘内注射空白血清或抗血清dynorphin内脏过敏并没有显着影响的基线阈值。然而,预处理和鞘内注射的dynorphin抗血清(但不是空白血清)完全抑制皮下注射BAA-induced腹部内脏镇痛效应( P < 0.05 通过重复测量双向方差分析之后,费舍尔的事后分析;图 3 (c))。完整的抑制作用的dynorphin抗血清也证实BAA-induced机械antiallodynia后爪子( P < 0.05 通过单向方差分析以及Fisher事后分析;图 3 (d))。

Dynorphin已知产生镇痛效应的作用 κ阿片受体( 37- - - - - - 39]。因此,我们进一步测试了BAA还对内脏antihypersensitivity效应 κ阿片受体通过使用 κ阿片受体拮抗剂nor-BNI [ 40]。四组TNBS + HeICS-pretreated老鼠收到两治疗后持续压力应用。这两个治疗皮下注射生理盐水(1毫升/公斤)或nor-BNI(10毫克/公斤),2小时后,皮下注射生理盐水(1毫升/公斤)或BAA (90 μ克/公斤)。腹部和后爪行为测试1小时后进行注入。如数据所示 3 (e)和 3 (f),皮下注射nor-BNI没有明显影响基线内脏过敏成绩或TNBS + HeICS-treated大鼠后爪机械痛觉过敏。然而,其预处理完全阻塞BAA-induced腹部内脏镇痛效应和后爪机械antihyperalgesia ( P < 0.05 通过单向或双向方差分析重复测量费雪的事后分析)紧随其后。

 3.4。BAA TNBS-Enhanced减少脊髓背角神经元的突触传递

如图 1 (c)甚至在我们之前的研究中,老鼠在TNBS治疗组显示一个明显的和内脏疼痛表现型的优秀性能,与对照组相比。此外,在脊髓背角sEPSCs板二世在4周神经元记录。因此,为了简化建模方法在随后记录sEPSCs,我们比较脊髓背角天真的老鼠和老鼠TNBS-pretreated之间的突触传递。两组收到的小狗大鼠结肠灌注生理盐水和TNBS分别诞生的第十天。18天后,老鼠被杀,规模化、脊髓被移除。sEPSCs被记录在背角板二世神经元利用全细胞膜片钳。所示的代表人物的痕迹 4(一)和 4 (b)并使用pCLAMP软件数据进一步分析 4 (c)和 4 (d)的频率sEPSCs TNBS-treated背角神经元的老鼠明显高于从天真的大鼠( P < 0.05 通过单向方差分析以及Fisher事后分析)。然而,没有明显变化的振幅sEPSCs天真和TNBS-treated老鼠之间。结果表明一个增强脊髓突触传导和突触可塑性成立于对TNBS诱导的内脏过敏状态。

bulleyaconitine (BAA 1的影响 μM)代表的痕迹自发兴奋性突触后电流(sEPSCs) (a, b)和总结频率(c)和振幅(d)在脊髓背角sEPSCs板二世从天真和TNBS-treated老鼠神经元。内脏过敏协议包括结肠灌注TNBS产后第十天。4周后,大鼠的脊髓被移除被杀,sEPSC全细胞膜片箝记录。并给出了数据 意味着 ± 扫描电镜 ( n = 12 在每组)。 ∗ 和#表示 P < 0.05 相比天真+ ACSF组和TNBS + ACSF组,分别由单向方差分析之后,费舍尔的事后分析。

此外,BAA的抑制作用,溶解在ACSF灌注的解决方案,在sEPSCs进行了测试。如图 4灌注的1 μM BAA 10分钟的频率显著降低sEPSCs背角神经元从TNBS-treated老鼠( P < 0.05 通过单向方差分析以及Fisher事后分析)。然而,BAA未能改变的频率sEPSCs背角神经元从天真的老鼠。相比之下,BAA治疗没有显著变化的振幅sEPSCs从天真的老鼠或者TNBS-treated老鼠。

 3.5。二甲胺四环素,Dynorphin抗血清5 < inline-formula > < mml:数学xmlns: mml = " http://www.w3.org/1998/Math/MathML " id = " M40 " > < mml: msup > < mml: mrow / > < mml: mrow > < mml:莫>′< / mml:莫> < / mml: mrow > < / mml: msup > < / mml:数学> < / inline-formula > -GNTI阻塞BAA和Dynorphin A-Induced抑制脊髓突触可塑性

确认的因果作用的小胶质表达dynorphin BAA-induced抑制脊髓突触可塑性的,小胶质抑制剂二甲胺四环素和dynorphin抗血清是受雇于sEPSC记录分析。如数据所示 5(一个)- - - - - - 5 (c)1,灌注 μM的BAA 10分钟的频率显著降低sEPSCs不改变振幅。然而,预处理(30分钟前)灌注二甲胺四环素(10 μ米)( 41),溶解在ACSF灌注解决方案,完全阻塞BAA-inhibited增强sEPSCs在脊髓背角神经元的频率从TNBS-treated老鼠( P < 0.05 单向方差分析之后,费舍尔的事后分析),尽管它并没有显著改变增强突触传递的基线值。同样,灌注的dynorphin抗血清(1:50稀释),溶解在ACSF灌注的解决方案,也并未显著改变基线突触传递。然而,它的预处理(30分钟前)完全逆转BAA-induced抑制增强sEPSCs在脊髓背角神经元的频率从TNBS-treated老鼠( P < 0.05 通过单向方差分析之后,费舍尔的事后分析)但没有明显影响的振幅sEPSCs(数字 5 (d)- - - - - - 5 (f))。

封锁的影响小胶质抑制剂二甲胺四环素(1 μM (A - c)), dynorphin抗血清(1:50稀释(d-f))在bulleyaconitine (BAA - 1 μ米)抑制增强自发兴奋性突触后电流(sEPSCs)背角板二世从TNBS-treated老鼠神经元。(a, d)代表sEPSCs的痕迹。内脏过敏协议包括结肠灌注TNBS产后第十天。4周后,大鼠的脊髓被移除被杀,sEPSC全细胞膜片箝记录。并给出了数据 意味着 ± 扫描电镜 ( n = 8 − 12 在每组)。 ∗ 和#表示 P < 0.05 相比ACSF组和BAA治疗组,分别由单向方差分析之后,费舍尔的事后分析。

进一步探索的活动之间的联系 κ阿片受体和BAA-inhibited增强脊髓突触传递,封锁的具体影响 κ阿片受体拮抗剂5 ′ -GNTI [ 42, 43]了。中表现出的数据 6(一)- - - - - - 6 (c)带浴室的预处理(30分钟前)的应用5 ′ -GNTI (1 μM),溶解在ACSF灌注解决方案,完全阻塞BAA-inhibited增强的频率(但不是振幅)在脊髓背角神经元sEPSCs TNBS-treated老鼠( P < 0.05 单向方差分析之后,费舍尔的事后分析),尽管它并没有显著改变基线突触传递。此外,灌注外生dynorphin (1 μ米)( 4415分钟在脊髓背角神经元显著抑制增强sEPSCs频率(但不是振幅),这是完全被灌注的预处理(30分钟前)5 ′ -GNTI (1 μ米)( P < 0.05 通过单向方差分析以及Fisher事后分析;数据 6 (d)- - - - - - 6 (f))。

封锁的影响 κ阿片受体拮抗剂5 ′ -GNTI (1 μbulleyaconitine A - M) (BAA - 1 μM (A - c))和dynorphin(达因- 1 μ米(d-f)抑制增强自发兴奋性突触后电流(sEPSCs)背角板二世从TNBS-treated老鼠神经元。(a, d)代表sEPSCs的痕迹。内脏过敏协议包括结肠灌注TNBS产后第十天。4周后,大鼠的脊髓被移除被杀,sEPSC全细胞膜片箝记录。并给出了数据 意味着 ± 扫描电镜 ( n = 12 在每组)。 ∗ 和#表示 P < 0.05 相比ACSF集团和英国机场管理局或动力学治疗组,分别由单向方差分析之后,费舍尔的事后分析。

 4所示。讨论

早期不良经历可以改变神经和内分泌系统反应压力在以后的生活中,即表现为增强内脏疼痛和皮肤的刺激反应( 45- - - - - - 47]。有一个不可避免的人体的表面反应之间的关系和内部器官的变化。先前的研究也证明内脏病变有相应的反应在身体表面,如内脏疼痛,伴有辐射疼痛在身体表面,即。,称为疼痛。有一种相声不同组织和器官。自主神经的内脏可以混合的痛神经部分脊髓,导致内脏病变通常反映在表面积的痛苦负责脊髓,提到的“牵涉性痛。”内脏病变往往伴随着痛苦,和有机内脏疼痛可以经常发现一个更固定的皮肤敏感的区域。痛觉过敏也可以解释为从患病内脏传入神经纤维的形成和身体部位,也进入脊髓后根和收敛于同一神经元的脊髓丘脑束。因此,除了内脏运动的响应分级结直肠扩张,后爪机械痛觉过敏主要是用来评估慢性过敏症动物模型。老鼠在我们当前的研究收到TNBS灌注在产后第十天,和HeICS应用后发达非凡的腹部皮肤痛觉过敏和后爪机械痛觉过敏。在这个模型中慢性内脏过敏,皮下管理BAA剂量依赖性降低腹部戒断反应和后爪机械痛觉过敏。结果表明,BAA产生发自内心的镇痛效应模型中慢性内脏过敏引起的组合TNBS + HeICS治疗和扩大其镇痛频谱。 BAA and its analogs aconitine, bullatine, and lappaconitine have been extensively reported to exhibit antinociception in various somatic painful hypersensitivity models, such as spinal nerve ligation- and paclitaxel-induced neuropathic pain, formalin- and complete Freund’s adjuvant-induced inflammatory pain, bone cancer pain, and diabetic pain [ 10, 18, 19, 21]。应该注意,尽管我们没有测试它在当前的研究中,英国机场管理局及其类似物已被证明有轻微或小抑制性影响正常痛阈值的天真的大鼠后爪或侧单边周围神经创伤性神经性老鼠( 10, 11, 21]。所有的结果综合表明,乌头生物碱特别BAA产生特定的镇痛效应在躯体和内脏过敏状态。

我们进一步证明BAA内脏产生镇痛效应的刺激脊髓小胶质dynorphin a的表达,结果也证明了这一结论。(1)我们之前的研究显示,英国机场管理局及其类似物乌头碱,bullatine,和lappaconitine特别刺激dynorphin的表达在星形胶质细胞和小胶质细胞的主要文化而不是从新生儿和成年大鼠神经元,尽管后者也表达了两种类型的细胞和分泌dynorphin A .此外,鞘内注射乌头碱尤其是BAA特别刺激小胶质(但不是星形或神经元)的表达dynorphin侧和侧脊髓的神经性老鼠( 10, 18, 19, 48]。(2)内脏antinociceptive BAA的影响,鉴于皮下注射,完全是被小胶质细胞抑制剂二甲胺四环素的预处理与腹腔内注射。(3)特别,鞘内注射的预处理dynorphin抗血清完全减毒皮下BAA-induced发自肺腑的镇痛效应。(4)Dynorphin的内源性配体 κ阿片受体( 49, 50]。与皮下注射的预处理 κ阿片受体拮抗剂nor-BNI完全阻塞BAA-induced发自肺腑的镇痛效应。此外,BAA-induced机械antihyperalgesia在大鼠后爪模型内脏过敏也减毒的应用二甲胺四环素,dynorphin抗血清,和nor-BNI,一样在脊神经ligation-induced神经性老鼠( 10]。这些结果表明,脊髓小胶质的表达dynorphin调和内脏和躯体antihypersensitivity效果。

中枢敏感化是一个关键的角色在慢性疼痛的病理障碍,指增加突触效能或传入神经元突触可塑性的神经损伤后脊髓背角,外围有害刺激,或组织损伤或炎症 51- - - - - - 54]。有害刺激后的长期突触可塑性是一个关键的电生理基础中枢敏感化,这是主要的相关神经递质谷氨酸的释放和激活的n -甲基- d(门冬氨酸)受体在突触后神经元 52, 54, 55]。突触传递的增加使痛阈下降,扩张的疼痛反应,疼痛敏感性noninjured地区的传播。临床上,中枢敏化导致内脏疼痛过敏,皮肤和肌肉。维持中枢敏感化是一个重要的潜在的慢性疼痛机制包括持续的炎症和神经性疼痛( 55, 56]。我们证明了频率(但不是振幅)的sEPSCs背角板二世神经元从TNBS-treated老鼠明显高于天真的老鼠,这表明新生儿内脏炎症引起TNBS建立脊髓突触可塑性和中枢敏感化,这是与以前的报告一致,结肠炎症导致中枢敏化( 54, 57, 58]。

一致的发现BAA专门抑制增强sEPSCs或mEPSCs背角板二世神经元paclitaxel-induced神经性老鼠(朱et al。( 21]),我们的研究表明,BAA显著降低在脊髓背角神经元突触可塑性TNBS-treated老鼠但没有显著影响突触传递天真的老鼠。结果表明,BAA专门抑制脊髓突触可塑性和中枢敏感化,这可能是BAA的基础特别减弱腹部内脏伤害感受和后爪机械痛觉过敏引起TNBS和HeICS的组合应用程序。我们进一步证明BAA减少脊髓突触可塑性通过刺激小胶质的表达dynorphin,二甲胺四环素的灌注,dynorphin抗血清,和具体 κ阿片受体拮抗剂5 ′ -GNTI完全阻塞BAA-inhibited增强脊髓突触传递。Dynorphin内源性阿片神经递质,可以产生在脊髓和大脑的许多地方如纹状体、海马、下丘脑( 59]。它通过突触前 κ阿片受体,减少Ca2 +端依赖谷氨酸分泌从而抑制突触传递,减少海马的神经可塑性,下丘脑弓状核、丘脑的后室旁核,和其他核( 60- - - - - - 63年]。此外, κ阿片受体激动剂A和U69593 dynorphin在脊髓神经元对自发钙振荡起到抑制作用主要由glutamatergic神经传递,这完全是被选择性 κ受体拮抗剂nor-BNI。与突触前的作用机制报告一致 κ阿片受体的表达 κ阿片受体在脊髓glutamatergic丰富神经元突触前室的相对丰度( 64年]。事实上,我们证实dynorphin抑制增强突触前谷氨酸传播在脊髓背角板二世神经元 κ阿片receptor-dependent方式。

综上所述,我们的研究结果说明一个特定的模式之间的相声小胶质细胞和神经元在脊髓背角BAA产生发自内心的镇痛效应,即。,BAA刺激小胶质细胞表达和秘密dynorphin通过Gs /营/ PKA / p38 β/信号转导分子机制( 48),通过小胶质神经元突触和作用于突触前 κ阿片受体在传入神经元。在突触前的激活 κ阿片受体,增强突触谷氨酸传输和顺向突触后神经元NMDA电流减少内脏过敏状态,导致抑制中枢敏感化和镇痛效应。图解BBA antinociceptive通路的内脏过敏呈现在图 7。

示意图说明脊髓小胶质dynorphin / κ阿片受体/突触可塑性通路bulleyaconitine (BAA)产生镇痛效应的内脏过敏状态。BAA刺激脊髓小胶质细胞通过Gs / / PKA / p38营地 β/信号转导通路分子表达和秘密dynorphin,通过小胶质神经元突触和作用于突触前 κ阿片受体。在突触前 κ阿片受体的激活、增强的神经元突触前谷氨酸传输和顺向突触后NMDA电流减少内脏过敏状态,导致抑制中枢敏感化和发自肺腑的镇痛效应。

 缩写 ACSF:

人工脑脊液

 英国机场管理局:

Bulleyaconitine一

 HeICS:

异形的断断续续的慢性压力

 导航:

压敏电阻器钠

 sEPSC:

自发兴奋性突触后电流

 TNBS:

2、4、6-trinitrobenzene磺酸。

 数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 作者的贡献

YXW JC构思和设计实验。SNH JW,激光,PJJ进行实验。SNH、JC和JW分析数据。YXW JW, JC准备。剩男黄和金宝魏同样这项工作。

 确认

本研究在一定程度上支持中国的国家自然科学基金(JC # 81571326和# 81673403 YXW),上海工业平移项目YXW(# 15401901300),精神障碍和上海重点实验室开放格兰特(16-K01 YXW)。

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