一种新型ENU诱导小鼠突变的鉴定Tbx1与人类DiGeorge综合征有关

摘要

DiGeorge综合征（DGS）是由22号染色体上数十个基因的缺失引起的，患者常伴有与慢性中耳炎相关的心血管问题和听力损失TBX1此外，在患者中也发现了类似的DGS表型Tbx1杂合的基因敲除小鼠。利用enu诱变和G1显性筛选策略，我们在转录活性DNA结合区域TBX1的T-box中发现了一个非同义突变p.W118R。突变小鼠表现出内耳功能缺陷，包括头部晃动和打转，外加由测听仪确定的听力阈值增加。因此，我们的研究结果进一步证实了该病的致病基础Tbx1在DGS中，指出了TBX1的DNA结合活性对耳朵功能的关键作用，并为研究DGS疾病机制提供了额外的动物模型。

1.导言

传导性和感音神经性两种主要类型的听力损失是由影响听觉系统结构和功能的基因突变引起的。目前，已鉴定出70多个非综合征性耳聋基因[1］.通常，非正神耳聋基因更具体地参与听觉功能，例如转导，纤氯化，细胞代谢和离子稳态[2］.例如,GJB2是主要的耳聋基因[3.为耳蜗支持细胞中缝隙连接的一个组成部分编码，并控制钾的循环[4］.lhfpl5.在耳蜗毛细胞的毛束中有特异性表达[5]调节转导复合物的位置和通道门控[6]此外，更多的基因座与非综合征性耳聋有关，尽管致病基因尚未确定[1］.

然而，更常见的是，耳聋表型始终伴随着其他类型的疾病，这被认为是综合征耳聋。例如，PENDRED综合征是最常见的聋症综合征，表现出斜耳发育异常和感觉内听力损失，与弥漫性甲状腺扩大平行[7]Pendred综合征是由氯碘转运蛋白故障引起的[8］.Usher综合征患者既伴有严重的听力损失，又伴有视网膜色素变性[9］.因此，新的耳聋基因的鉴定和注释在研究领域和临床界受到高度重视。从战略上讲，基于前向遗传学和反向遗传学的方法被广泛应用于寻找新的耳聋基因。

对于所有表征的耳聋基因，它们的大量是编码结构蛋白或稳态调节剂，其主要与非合成症状耳聋。考虑到耳蜗是赋予听力功能的复杂组织机器，可能难以理解。更重要的是，转录因子和非编码RNA分子广泛操纵耳朵的发育，这些耳朵经常引起综合症耳聋。其特征在于，除了内耳发育和形态发生之外，一堆转录因子主要参与神经发育。例如，转录因子包括Bmb4，Jag1，Islet1，Lfng，Fgf16，Prox1，及Tbx1调节假误斑块的规格[10]这些转录因子以特定的时间和空间模式表达，相互之间相互作用。

老鼠Tbx1突变显示的表达减少Bmp4从而导致感觉上皮形成不足[11].在内耳发育早期，Tbx1是一种非常重要的转录因子[12]这也是del22q11/DiGeorge综合征（DGS）/velocardiofacial综合征（VCFS）（简称DGS）发病机制中的候选基因之一[13- - - - - -15］.通常，DGS患者在人类第22号染色体1.5-3 Mb的区域携带半合子缺失，其中包括24个基因。DGS很复杂，除了心血管问题外，还表现出许多表型，包括颅面异常，如外耳缺损和听力损害[16，17］.据报道，大多数DGS患者伴有慢性中耳炎相关的传导性听力损失[18，19］.然而，少数(15%)的听力损失属于感音神经性聋，其机制尚不清楚[18]此外，在DGS患者中观察到平衡问题[20].最近的研究提供了强有力的证据Tbx1是DGS发病机制中的关键基因[21- - - - - -23］.

在本研究中，我们利用基于化学诱变的n -乙基-n -亚硝基脲(ENU)筛选，并对名为ENU706它带有耳聋的表型和显性遗传的不平衡。听力分析表明，耳蜗的听觉阈值ENU706杂合子小鼠在30%左右升高 但是，每只杂合子小鼠每只耳朵的听阈都随机升高。遗传分析指出Tbx1是耳疾的致病基因。一个以前未报道过的非同义突变，p.W118R，击中了TBX1 T-box区域的一个保守氨基酸Tbx1转录活动。在T型框结构域中，非常接近我们的小鼠突变，另外2个人DGS突变，P.F148Y和P.H194Q先前在家庭病例中发现。因此，我们的数据进一步证实了致病作用Tbx1在DGS中，精确定位其DNA结合活性与听力损失的机制关联，并为研究DGS疾病机制提供额外的动物模型。

2。材料和方法

所有程序均按照清华大学机构动物护理和使用委员会的研究指南进行。本研究使用了雌雄小鼠。

2.1.ENU突变小鼠的产生

ENU突变方案和主要表型筛选已在前面描述[25]简言之，C57BL/6J雄性小鼠以100%的剂量注射ENU 根据体重，mg/kg，每周一次，连续三周。恢复生育力后，将小鼠与未出生的雌性C57BL/6J交配。后代G1小鼠用于神经表型分析，包括学习记忆、运动障碍、听力损失和步态分析。将受影响的G1代创始人培育成天真的C57BL/6J，以建立突变家族。携带遗传表型的后代小鼠被送去捕获整个外显子，以确定负责的突变。

2．2．Whole-Exome分析

在全基因组水平上检测外显子单核苷酸多态性（SNP）[26]简言之，外显子组捕获的测序文库由SeqCap EZ文库SR（Roche）产生。DNA seq数据经过生物信息学分析，通过将突变（受影响）与C57BL/6J数据库进行比较，识别由ENU引起的潜在变体。所有候选基因必须满足四个标准：（1）支持读取数>4；（2）支持读取数/该位点的深度>0.2；（3）该变异在受影响样本中表现为杂合子，但在未受影响样本中未表现出杂合子；（4）根据ANNOVAR的注释，它是一个非同义外显子突变。

２．３．听力测定

如前所述，本研究中使用听觉脑干反应(Auditory brainstem response, ABR)测量来评估小鼠的听力阈值[27］.将测量施用于比30天年龄的老鼠。为了检查对听力进展的发育效果，大鼠的年龄最长可达300天。在测量之前，通过I.P麻醉鼠标。注射五旬节。然后将鼠标转移到用于听力测定的声音腔室（Shengnuo，Shanghai）。使用TDT RZ6系统（Tucker-Davis Technologies）进行了听力评估。将电极置于鼠标底部。将接地电极插入后腿附近的后部，参考电极刚刚在柱后面，并且在顶点处插入有源电极。EC1近端扬声器通过导电管放置在外耳道上。 A balanced click stimuli were applied per second, each with a duration of 0.1 ms, starting at 90 dB SPL and decreasing at 10 dB SPL step in intensity. Stimuli and recordings were performed with the BioSigRZ software provided with the TDT workstation. The number of acquisition trials was set at 512 for averaging. Auditory thresholds were analyzed for both ears of mutant mice and single ears of wild-type mice. Wild-type mice were examined for another ear if there was an abnormal hearing. The hearing threshold was defined once a visible ABR emerged in recorded traces with graded click stimuli. Our setup determined the median threshold of wild-type C57BL/6J as 20 dB SPL. This baseline was elevated a bit with aging of mice.

２.４.扫描电子显微镜

内耳在磷酸盐缓冲液(0.1 M Na)中分离₂HPO₄h·12₂O、 0.1 M不₂人事军官₄·2H₂O, PH 7.4)转入固定缓冲液(2.5%戊二醛，0.1 M磷酸盐缓冲液)。在耳蜗顶端戳一个孔，让固定液冲过耳蜗迷宫，然后在4°C下固定过夜。内耳用磷酸盐缓冲液冲洗10分钟，共3次，细解剖去除螺旋韧带、Reissner膜、盖膜。样品在10/20/30/50/70/80/95/100%乙醇中孵育30分钟脱水，然后冷冻干燥(Hitachi ES-2030)和涂金(Hitachi E-1010)。用FEI Quanta 200对样品进行成像。

2．5．电生理学

直立显微镜(Olympus BX51WI)观察耳蜗毛细胞。用PC-10移管拉拔器(Narishige)拉拔硼硅酸盐玻璃(Sutter)，用MF-830微锻压(Narishige)抛光，使其电阻达到3-5 MOhm。用安装在P-885压电堆叠驱动器(物理仪器)上的玻璃吸管使头发束偏转。使用由Patchmaster软件(HEKA)操作的EPC 10 USB膜片钳放大器在100 KHz下采样全细胞电流。胞外溶液含(mM) 144 NaCl, 0.7 NaH₂人事军官₄， 5.8 KCl, 1.3 CaCl₂，0.9毫克升₂10个H-HEPES, pH 7.4。胞内溶液含(mM) 140 KCl, 1 MgCl₂，0.1 EGTA，2 Mg ATP，0.3 Na GTP和10 H-HEPES，pH 7.2。毛细胞被电压钳制在−70 mV。

2.6.数据分析

数据分析由Excel（Microsoft）、Prism（GraphPad）和IgorPro 6（WaveMetrics）等软件进行。

3.结果和讨论

3.1.基因的产生和遗传图谱ENU706鼠标线

为了确定导致小鼠神经表型的遗传突变，我们建立了G1显性突变筛查（图1）1(一)）.的ENU706线在G1创始者中出现明显的圆形表型(图1 (c)）.在与幼稚的C57BL/6J杂交后，我们发现显性遗传表型在该家族中再次出现(图)1 (b))，满足预期的孟德尔比率(图4（c））.

3.2.ENU706他有中度听力损失

ENU706杂合子小鼠有环(图1 (c))和在1个月大时就观察到的头部晃动行为，这是一种典型的前庭问题。一般来说，有一半的老鼠在绕圈(图)4（c），左栏），这进一步证实了突变导致了显性遗传方式的不平衡。内耳功能缺陷动物的盘旋常伴有听力损失。然后，我们评估了内耳功能缺陷动物群体的听力阈值ENU706小鼠。点击ABR测试用于评估听阈。对照野生型小鼠开始对低至20的点击声音作出反应 dB SPL（图2(一个)，左），这是正常听力的典型值ENU706杂合子小鼠，左耳听觉阈值为50db SPL，右耳听觉阈值为60db SPL(图5)2(一个)， 对）。它表明，这种突变小鼠具有中度的听力损失，并且在每只耳朵中可能会差异影响。值得注意的是，一个小鼠的耳朵的不同听力阈值通常不相同。我们在一些极端情况下观察到鼠标有一个耳朵正常（20dB拼接），但另一只耳朵深刻聋（70 db spl）。为了确定听力损失是导电还是感觉，分析了ABR反应的延迟。ABR的发病是亚脲硫化物较慢ENU706杂合子小鼠（图2（b）)，但对讲机似乎没有改变（图2（c））.外科检查发现中耳炎ENU706如果他们有听力损失，杂合小鼠（图2（d）和2（e）).一般来说，这种偶发性听力损失与性别无关（图3（a）)或年龄（数字3（b）)ENU706老鼠。实际上，听力阈值平均值约为20 dBENU706老鼠（图3（a））.一直，ENU706小鼠也有与野生型动物相似的进展趋势，但听力阈值升高(图)3（b））.为了进一步研究是否有感觉神经因子参与听力损失，我们检测了耳蜗毛细胞的机械转导反应。我们的电生理数据显示，机械转导电流没有明显的变化ENU706杂合子小鼠（图3（c）)，他们的发束也是如此（图3（d））.

3.3.Tbx1基因与内耳问题有关

为了确定与显性听力损失和环状表型相关的致病基因，我们进行了全外显子测序。初步分析表明，该基因编码区有104个SNPs和13个插入缺失(indelts)。考虑到遗传性状符合孟德尔定律(图4（c），第1栏），纯合的SNP被排除在外。然后在初步分析中提出了93个杂合子SNP中的85例，以验证以链接到听力损失。根据我们以前的数据采矿经验，选择了85个SNP中的31种被研究（图4（a））.然后应用PCR测序对31个候选基因进行SNP转位验证。结果表明，31个snp中有3个是基因型和表型高度一致的最佳候选snp。这3个基因是Tbx1，Bmp7，及Slc38a1,在这Tbx1和Bmp7与听力障碍有关。Tbx1已被认为是DGS（包括听力障碍）发病机制的候选基因[28].我们找到了一个T→中的C横截Tbx1基因在大部分盘旋ENU706杂合小鼠。Bmp7也被发现与内耳的发育有关，并指定音位耳蜗轴[29]A.T→C横断在细胞中被发现Bmp7少数基因ENU706杂合小鼠。对于SLC38A1基因，存在G→突变，并且在两个等位基因中观察有时纯合突变（图4（b）)通过比较PCR测序结果和循环表型，我们推测Tbx1是携带T/T突变的高度可能的靶基因→电汇ENU706小鼠（23个盘旋小鼠中的23个）。在所有44只育种小鼠中，24个具有T / T→T / C SNP变化Tbx1基因（图4（c）和4（d））.在24Tbx1+/−小鼠中，21只处于循环状态，20只ABR升高(图)4（c）)突变导致TBX1蛋白T盒区118个氨基酸的W到R变化（图5（a）)，这在不同物种中是非常保守的(图5（b）)和TBX旁白（图5（c））.

4.讨论

本研究中的所有证据表明Tbx1与儿童的听力问题有关ENU706我们制造的老鼠。ENU706小鼠出现中度听觉阈值升高和前庭问题，这是由T-box区半合子SNP突变引起的Tbx1．Tbx1，作为一种转录因子，与中耳和内耳的发育和形态发生有关，包括传导性和感音神经性听力损失[18，19]也是与del22q11/DGS/VCFS发病机制有关的候选基因[14］.最近的研究表明Tbx1很可能与DGS患者和工程突变小鼠的听力缺陷有关[21- - - - - -23]此外，我们确实注意到一些患者的一些综合征表型ENU706杂合的老鼠(图1 (d)和1（e）)模仿人类和小鼠的DGS特征。的ENU706在我们的繁殖群体中没有发现纯合子小鼠存活，这也发生在Tbx1基因敲除小鼠(15］.

在我们的基因鉴定过程中BMP7和Slc38a1基因偶尔会出现;BMP7特别是以前被认为是耳蜗轴规范的关键。这两个基因不太可能是ENU706老鼠。BMP7位于第2染色体，Slc38a1位于第15染色体，而Tbx1位于第16染色体。第4代晚期杂交的ENU706小鼠没有携带BMP7和Slc38a1突变不再存在，但仍具有DGS表型。我们的听力测试已经解决了听力缺陷（包括传导性和感音神经性听力损失）的潜在机制（图2（b）和2（c）)和电生理记录（图3（c）)这些数据表明，这更可能是一种传导性听力损失ENU706为了研究准确的基因功能，染色体工程Df1/+小鼠和单基因敲除Tbx1/+使用小鼠。杂合的损失Tbx1导致心脏的主要结构异常，类似于在Df1/+老鼠和Lgdel/+老鼠(16］.慢性中耳炎也是DGS的临床诊断特征之一[28]中耳炎的发病机制被认为是由多种原因引起的，如炎症清除功能的缺陷[30.，31]或者中耳腔的粘膜[32，33］.我们的工作是对Df1/+和Tbx1/+包括显性遗传、旋转和部分听力损失。最近的一份报告进一步描述了早期肌生成缺陷导致DGS小鼠模型中耳炎[23］.他们的数据显示Tbx1杂合小鼠主要通过与肌肉问题相关的咽鼓管问题显示听力损失。然后，听觉阈值在给定的两个耳朵之间是不同的ENU706鼠标（图2(一个)）.这也与观察到的听力损失ENU706小鼠是中度和零星的（图3（a）和3（b））.然而，我们的研究指出，单点突变是导致DGS大部分听力特征的原因。有趣的是,另一个基因,Comt的，在DGS患者的染色体缺失区也与听力损失有关[34］.

在早期开发中，Tbx1as转录因子在第一咽囊的内胚层衬里和咽弓的减数分裂中表达[28］.T-box结构域在T-box蛋白二聚化和DNA结合活性中起着重要作用。有报道称，T-box域的F148Y和H194Q实际上诱发了功能增益效应，并在T-box边界处产生了G310S [35]我们推测ENU706小鼠中的W118R也可能与其他T盒突变一样获得功能。更有趣的是，最近的研究表明，它还与可能具有表观遗传功能的染色质结合[36］.另一项研究提出皮层发育受中胚层表达的调控Tbx1［37］.这增加了TBX1函数的复杂性。这ENU706为精细分析TBX1在发育和生理中的作用提供了一个新的小鼠模型系。

5.结论

为了进一步了解听力感觉和听力损伤的分子和生理相关性，我们着手在小鼠中建立一个基于遗传学的耳聋基因筛查。这也是我们共同努力确定与神经疾病相关的疾病基因的一个主要目标。在这项研究中，我们描述了一种新的耳聋基因突变Tbx1基因，引起TBX1蛋白T-box区W118R氨基酸变化。这种高度保守区域的单点错义突变在受影响的小鼠中诱发了一种强大的表型失衡，这些小鼠也伴有中度听力损失。更有趣的是，这种缺陷是显性遗传的这与之前的研究一致Tbx1缺乏的Df1/+老鼠和Tbx1/+因此，我们的研究提供了另一种研究模型Tbx1在DGS的研究中，有助于解剖区域特异性和组织特异性TBX1的功能。

利益争夺

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

嘉肇陈和薛张同等为这项工作贡献。

致谢

国家自然科学基金(no . 31571080; no . 31522025);31571097、81371361、贾宜昌);清华大学科研基金(熊伟、贾宜昌)。

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37. G. floore, S. Cioffi, M. Bilio和E. Illingworth，“皮质发育需要中胚层表达Tbx1，一个在22q11.2缺失综合征中单倍不足的基因”大脑皮层，物品编号bhw076，2016年。浏览：出版商的网站|谷歌学者

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