NP 神经可塑性 1687 - 5443 2090 - 5904 Hindawi出版公司 10.1155 / 2016/5836143 5836143 研究文章 识别小说ENU-Induced突变的老鼠 Tbx1与人类先天性胸腺发育不全综合症 陈 Jiaofeng 1 张 雪 2 李 杰 1 首歌 Chenmeng 1 http://orcid.org/0000 - 0002 - 7767 - 5714 贾 宜昌 2 http://orcid.org/0000 - 0002 - 2784 - 7696 熊 魏 1 柴 Renjie 1 生命科学学院 清华大学 北京 中国 tsinghua.edu.cn 2 医学院的 清华大学 北京 中国 tsinghua.edu.cn 2016年 26 12 2016年 2016年 09年 09年 2016年 22 11 2016年 28 11 2016年 2016年 版权©2016 Jiaofeng陈等。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

迪格奥尔格综合征患者(DGS),由于删除包含几十个基因在染色体22,经常携带心血管问题,听力损失与慢性中耳炎。删除区域内部,转录因子 TBX1高度怀疑。此外,类似的DGS表型被发现 Tbx1杂合的基因敲除小鼠。使用G1主导ENU-induced突变和筛选策略,在这里我们发现了一个产生突变p。W118R T-box TBX1, DNA结合域的转录活动。内耳功能的突变小鼠显示缺陷,包括头盘旋的辗转反侧,加上增加听力阈值由听力测定。因此,我们的结果进一步证实了致病的基础 Tbx1DGS,指出DNA结合活动的关键作用的TBX1耳朵功能,并提供了额外的动物模型研究了DGS疾病机制。

 中国国家自然科学基金 31571080 31522025 31571097 81371361 清华大学的研究资金 1。介绍

两个主要类型的听力损失,导电和感音神经性,都是由基因突变引起,影响听觉系统的结构和功能。目前,70多名nonsyndromic耳聋基因已经被鉴定( 1]。通常nonsyndromic耳聋基因转导等更具体参与听觉功能,ciliogenesis、细胞代谢、离子稳态( 2]。例如, GJB2是一个主要的耳聋基因( 3],编码为组件支持细胞缝隙连接具体的耳蜗和控制钾循环( 4]。 Lhfpl5被发现表示特别的头发束耳蜗毛细胞( 5),调节转导复杂的位置和通道控制( 6]。此外,更多的位点与nonsyndromic耳聋致病基因虽然尚未特征( 1]。

然而,更普遍的是,一个耳聋总是伴随着其他类型的表型障碍(s),这是一种综合征耳聋。例如,Pendred综合征是最常见的耳聋综合征表现耳蜗发育异常和感音神经性听力损失,与弥漫性甲状腺肿大( 7]。Pendred综合症是chloride-iodide运输蛋白引起的故障 8]。开创综合症患者持有深刻的听力损失和色素性视网膜炎( 9]。因此,小说耳聋基因的识别和注释之后升值大大在研究领域和临床社区。战略基于正向遗传学和反向遗传学的方法广泛应用于搜索小说耳聋基因。

耳聋基因特征,大量的编码结构蛋白或体内平衡调节器主要与nonsyndromic耳聋。它可能不是很难理解,考虑到耳蜗是这样一个复杂的纸机赋予耳朵听力功能。更重要的是,转录因子和非编码RNA分子广泛操纵耳朵的发展,常常导致综合征耳聋。特点,一群主要转录因子参与神经发育除了内耳发育和形态发生。例如,转录因子等 Bmb4, Jag1, Islet1, Lfng, Fgf16, Prox1, Tbx1调节规范prosensory补丁( 10]。这些转录因子表达在指定时间和空间模式在彼此互动。

老鼠 Tbx1变异显示减少的表达 Bmp4从而导致缺乏感觉上皮细胞形成的 11]。在早期内耳发育, Tbx1是一个非常重要的转录因子( 12],也是发病的候选基因之一del22q11 /先天性胸腺发育不全综合症(DGS) / velocardiofacial综合症(vcf)(以下简称DGS) [ 13- - - - - - 15]。通常,DGS病人携带的半合子的删除1.5 3 Mb地区人类22号染色体上,其中包括24个基因。DGS很复杂,通过大量的表型包括颅面畸形如外耳缺陷和听力障碍除了心血管问题[ 16, 17]。据报道,大部分的DGS病人携带传导性听力损失与慢性中耳炎( 18, 19]。然而,一个小(15%)感觉神经性听力丧失的类型与未知的机制( 18]。此外,平衡问题是观察DGS患者( 20.]。最近的研究给了强有力的证据 Tbx1是一个关键基因在DGS的发病机制 21- - - - - - 23]。

在这项研究中,我们利用一个基于化学诱变N-ethyl-N-nitrosourea (ENU表示)筛查和鼠标线特征 ENU706携带耳聋的表型和显性遗传不平衡的。听力测定的分析表明,听力阈值的 ENU706杂合的老鼠被平均升高约30分贝控制老鼠的比较。然而,听力阈值在每个杂合的老鼠随机提升为每个耳朵。遗传分析指出 Tbx1致病基因是耳朵的问题。一个以前未报告的产生突变,p。W118R,击中一个保守氨基酸TBX1 T-box地区,DNA结合域负责 Tbx1转录活动。在T-box域,非常接近我们老鼠突变,另2人DGS突变,p。F148Y和p。在家庭情况下H194Q,之前被发现。因此,我们的数据进一步证实的致病作用 Tbx1DGS,查明其DNA结合活性的机械协会和听力损失,并提供额外的动物模型研究DGS疾病机制。

 2。材料和方法

所有程序依法进行研究机构动物保健和使用委员会的指导方针的清华大学。老鼠的被用于这项研究。

2.1。代ENU表示变异的老鼠

ENU-mutagenesis协议和主要表型屏幕前面描述的( 25]。简而言之,男性C57BL / 6 j小鼠注射ENU表示的剂量100毫克/公斤体重为三周每周一次。恢复生育能力后,女性天真的C57BL / 6 j小鼠交配。后代G1老鼠申请神经表型分析,包括学习和记忆、运动障碍,听力损失,和步态分析。受影响的G1创始人是培育天真的C57BL / 6 j建立突变的家庭。后代老鼠携带的遗传表型被全部外显子捕获识别突变负责。

 2.2。Whole-Exome分析

其实单核苷酸多态性(SNP)在全基因组水平研究[ 26]。总之,捕获的外显子组测序老库是由SeqCap EZ库(罗氏)。DNA-seq数据进行生物信息学分析识别造成的潜在变异ENU表示通过比较突变与C57BL / 6 j数据库(影响)。所有的候选人必须满足四个条件:(1)支持读取次数> 4;(2)支持读取次数/这个轨迹的深度> 0.2;(3)影响样本的变异出现杂合的但不影响样品;(4)根据ANNOVAR注释,这是一个产生其实突变。

 2.3。听力测定

听觉脑干反应(ABR)测试是用来评估老鼠的听觉阈值在本研究如前所述 27]。测量应用小鼠年龄超过30天。检查听力发育影响发展,随着年龄增长,老鼠测试300天。在测量之前,pentobarbitone的老鼠被腹腔注射麻醉。然后鼠标被转移到一个隔音室(Shengnuo、上海)听力测定。听力测定的评价做了TDT RZ6系统(Tucker-Davis技术)。电极被放置到皮下的老鼠。地面插入电极附近的后腿,参比电极是仅次于耳廓,和活跃的电极插入顶点。一个EC1相关专业扬声器放置在外部通过开展管耳道。平衡点击刺激应用每秒,每个时间为0.1毫秒,开始在90分贝和强度降低10分贝一步。 Stimuli and recordings were performed with the BioSigRZ software provided with the TDT workstation. The number of acquisition trials was set at 512 for averaging. Auditory thresholds were analyzed for both ears of mutant mice and single ears of wild-type mice. Wild-type mice were examined for another ear if there was an abnormal hearing. The hearing threshold was defined once a visible ABR emerged in recorded traces with graded click stimuli. Our setup determined the median threshold of wild-type C57BL/6J as 20 dB SPL. This baseline was elevated a bit with aging of mice.

 2.4。扫描电子显微镜

内耳解剖在磷酸盐缓冲剂(0.1 Na2HPO4h·122啊,0.1不2阿宝4h·22O, PH值7.4)和转移到固定的缓冲区(2.5%戊二醛、0.1磷酸盐缓冲剂)。当时戳一个洞顶端通过耳蜗迷宫让固定剂冲洗前样本固定在一夜之间在4°C。内在的耳朵被磷酸缓冲洗10分钟3次和fine-dissected去除螺旋韧带,赖斯纳氏膜、盖膜。样品被30分钟的孵化10/20/30/50/70/80/95/100%乙醇脱水,紧随其后的是冷冻干燥(日立es - 2030)和黄金涂层(日立e - 1010)。范样本成像与广达200。

 2.5。电生理学

耳蜗毛细胞与正直的显微镜观察(奥林巴斯BX51WI)。硼硅酸盐玻璃长丝(萨特)拉拔与PC-10吸管机(Narishige)和抛光与mf - 830 microforge (Narishige) 3 - 5莫姆阻力。头发束偏转与玻璃吸管安装在一个p - 885压电堆栈(物理学Instrumente)。全细胞电流在100千赫采样EPC 10 USB膜片钳放大器由Patchmaster软件(HEKA)。细胞外的解决方案包含144氯化钠(mM), 0.7不2阿宝41.3,5.8氯化钾,CaCl20.9 MgCl2,5.6葡萄糖,和10 H-HEPES, pH值7.4。细胞内的解决方案包含140氯化钾(mM), 1 MgCl20.1 EGTA 2 Mg-ATP 0.3 Na-GTP和10 H-HEPES, pH值7.2。毛细胞voltage-clamped−70 mV。

 2.6。数据分析

数据分析是由软件包括Excel(微软),棱镜(GraphPad)和伊戈尔Pro 6 (WaveMetrics)。

 3所示。结果与讨论 3.1。一代和遗传的映射<斜体> ENU706 < /斜体>鼠标线

为了确定负责鼠标神经表型的遗传突变,我们设立了一个G1主导诱变筛选(图 1(一))。的 ENU706出现明显的表型盘旋在G1创始人(图 1 (c))。天真的C57BL / 6 j穿越后,我们发现家庭中占主导地位的遗传表型复发(图 1 (b)),满足预期的孟德尔式比例(图 4 (c))。

突变体的识别 ENU706ENU-mutagenesis筛查。(a)的策略对C57BL / 6 j小鼠ENU表示屏幕。男性的创始人鼠标与雌性老鼠注入诱变剂和交叉。G1老鼠来表型筛查主要表型。(b)的家族血统 ENU706线。(c)代表的形象盘旋在杂合的行为 ENU706鼠标。从综合征着手的特征是继承了占主导地位的方式。的一些杂合的突变小鼠显示颅面发育异常包括(d)细长的牙齿和(e)不对称的脸。

 3.2。<斜体> ENU706 < /斜体>线具有中度听力损失

ENU706杂合的老鼠绕(图 1 (c))和头部扔早在月老所观察到的行为,是一个典型的前庭问题的表型。一般来说,一半的老鼠绕(图 4 (c)左栏),进一步证实了显性遗传突变导致失衡的风格。绕常伴有听力损失在动物遭受赤字内耳功能。然后,我们评估了听力阈值的殖民地 ENU706老鼠。单击ABR测试用于评估听觉阈值。控制野生型老鼠开始响应单击声音低至20分贝(图 2(一个)(左),这是一个典型的值正常听力。而在一个 ENU706杂合的鼠标,听力阈值是50分贝的左耳和右耳60分贝(图 2(一个),对吧)。建议这个突变小鼠有中度听力损失,可能每只耳朵上不同的影响。值得注意的是,不同的听力阈值对耳朵的老鼠通常是不相同的。我们观察到在一些极端情况下,鼠标一只耳朵正常(20分贝),但与另一个耳朵完全失聪(70分贝)。确定导电或感音神经性听力损失,ABR反应的延迟进行了分析。ABR亚微秒级慢于发病 ENU706杂合的鼠标(图 2 (b)),但是interpeak似乎没有改变(图 2 (c))。外科检查显示中耳炎 ENU706如果他们有听力损失(数据杂合的老鼠 2 (d)和 2 (e))。一般来说,这种零星的听力损失与性别无关(图 3(一个)(图)或年龄 3 (b)) ENU706老鼠。事实上,听力阈值显著升高20 dB的平均 ENU706老鼠(图 3(一个))。一致地, ENU706老鼠也会共享一个平行发展的趋势与野生动物但听阈升高(图 3 (b))。进一步调查是否有神经性因素参与了听力损失,我们检查了耳蜗毛细胞转导反应。我们的电生理数据显示的转导电流没有明显的变化 ENU706杂合的鼠标(图 3 (c)),所以他们的头发包(图 3 (d))。

的 ENU706老鼠拥有中度听力损失。(一)一个代表性的案例显示,点击ABR在控制和测试 ENU706老鼠。控制鼠标拥有听觉阈值低至20分贝。一个 ENU706鼠标有50分贝在左耳听力阈值和60分贝在右耳听力阈值。(b)的发病ABR反应是0.36毫秒后突变比控制鼠标。(c)之间的持续时间山峰I和II不是突变而发生明显变化的控制。痕迹分析(b)和(c)来自相同的录音(a)所示。(a)、(b)和(c)、控制是黑色和所示 ENU706红色的。不同的控制(d),杂合的 ENU706小鼠高架ABR反应有中耳炎(e)。

的 ENU706在头发细胞转导小鼠没有明显的缺陷。(一)ABR阈值是box-whisker策划4类:野生型雄性(WT M, 20.0±2.4分贝,8男性测试,8右耳朵+ 1左耳),杂合的男性( ENU706+ /−M, 38.7±3.9分贝,11男性测试,11右耳朵,和8左耳朵),野生型女性(WT F, 23.0 ± 4.5 分贝8女性测试9右耳朵,和1左耳),杂合的女性( ENU706+ /−F, 47.9 ± 4.5 13分贝,13个女性测试,右耳朵,和10左耳朵)。“ n “如果两个耳朵测量人数计算两次。数据显示为±SEM。统计学意义( p ∗ ∗ < 0.01 )是由学生的双尾未配对 t 以及。(b) ABR阈值被谋害的年龄。显示的数据汇集从左和右耳朵(20 WT, 20老鼠进行测试,右耳朵,和3左耳朵; ENU706+ /−24老鼠测试,24右耳朵,和19左耳朵)。(c)外毛细胞的转导电流测量 ENU706杂合的老鼠和控制同窝出生(面板中显示手机号)。数据显示为平均数±标准差。一组机械变形量从100−400 nm - 900 nm纳米步骤应用于头发束生成转导电流在毛细胞。在所有的面板,控制是黑色和所示 ENU706红色的。(d)扫描电镜显示apical-middle外毛细胞的头发束在一个相对正常 ENU706杂合的老鼠。比例尺:5 μm。

目标基因的遗传分析 ENU706表型。(一)在一个环绕整个基因组序列识别104个snp ENU706突变小鼠,其中93个snp是杂合的,85个snp的其实。(b)前三候选基因 Tbx1, Bmp7, Slc38a1。T-to-C突变的 Tbx1的高渗透了吗 ENU706杂合的小鼠盘旋的表型。(c) T-to-C突变的基因分型 Tbx1显示有24个杂合的老鼠的44个老鼠在这个殖民地。表型分析显示,21岁 ENU706杂合的老鼠盘旋和20 ENU706杂合的老鼠高架ABR在所有24 Tbx1+ /−老鼠。(d)典型的DNA色谱显示T-to-C突变的 ENU706杂合的老鼠。注意反向引物用于测序。 ∗ 是指T-to-C突变。

 3.3。< /斜体> <斜体> Tbx1基因与内耳的问题

确定致病基因与占主导地位的听力损失和盘旋表型,我们执行一个whole-exome测序。初步分析表明,有104个snp + 13插入和删除(indels)基因编码区域。考虑到遗传特征符合孟德尔遗传定律(图 4 (c)1条),纯合子snp被排除。85 93提出了杂合的snp在初步分析验证链接到听力损失。基于我们之前的数据挖掘经验,31个选择85个snp的研究(图 4(一))。然后,我们应用PCR测序验证每个31个候选基因的SNP颠换。原来3的31个snp的热门候选人出现高的基因型和表现型之间的一致性。3基因 Tbx1, Bmp7, Slc38a1,在这 Tbx1和 Bmp7之前与听力障碍。 Tbx1提出了DGS的候选基因发病机理包括听力障碍( 28]。我们发现一个T→C颠换 Tbx1基因在大多数盘旋 ENU706杂合的老鼠。 Bmp7也被发现与开发相关的内耳和指定音质耳蜗轴( 29日]。发现了T→C颠换 Bmp7基因在几 ENU706杂合的老鼠。Slc38a1基因,G→a突变,有时观察到的纯合子突变等位基因(图 4 (b))。PCR测序结果的比较和表型盘旋,我们推测 Tbx1是高度可能的目标基因进行突变T / T→T / C ENU706老鼠(23 24盘旋的老鼠)。在所有的44个老鼠繁殖,24 T / T→T / C SNP的变化 Tbx1基因(数据 4 (c)和 4 (d))。在24 Tbx121 + /−老鼠,盘旋,20升高ABR(图 4 (c))。R变化的突变导致了W TBX1 T-box地区118个氨基酸的蛋白质(图 5(一个)),在不同的物种(图非常保守 5 (b)),TBX paralogues(图 5 (c))。

保护在TBX1发现产生的突变分析 ENU706突变的老鼠。(一) ENU706突变导致W118R转换。F148Y、H194Q G310S突变,DGS病人之前报道,也表示 24]。(b)跨物种W118是高度保守的。蛋白质NCBI id, NP_035662.1 ( m .骶),NP_542377.1 ( 智人),XP_016795078.1 ( p .穴居人),XP_015005141.1 ( m .解剖),NP_001101792.1 ( r形),XP_002694701.2 ( b .金牛座),XP_015131167.1 ( g .背带)和NP_899182.1 ( d .鱼类)。(c) Trp氨基酸也在5 TBX paralogues高度保守的。蛋白质NCBI id, NP_542377.1 (Tbx1) NP_005985.3 (Tbx2) NP_005987.3 (Tbx3) NP_001308049.1 (Tbx4)和NP_000183.2 (Tbx5)。 ∗ 是指W118 (b)和Trp氨基酸(c)。

 4所示。讨论

在这项研究中所有的证据 Tbx1与听力的问题吗 ENU706我们生成的老鼠。 ENU706老鼠进行适度的听觉阈限海拔+前庭问题,引起的单侧的SNP T-box地区颠换 Tbx1。 Tbx1作为一个转录因子,有关中产和内耳发育和形态发生,包括导电和感音神经性听力损失( 18, 19]。也是候选基因有关的发病机制del22q11 / DGS vcf [ 14]。最近的研究表明 Tbx1很可能与听力缺陷DGS病人和工程突变小鼠 21- - - - - - 23]。此外,我们注意到一些综合征表型 ENU706杂合的老鼠(图 1 (d)和 1 (e)人类和老鼠)模仿DGS特征报道。的 ENU706纯合子小鼠没有找到活在我们的育种群体,也发生在 Tbx1基因敲除小鼠( 15]。

在我们的基因识别、突变 BMP7和 Slc38a1基因偶尔出现; BMP7特别是以前确定的关键耳蜗轴规范。这两个基因并不可能的致病基因 ENU706老鼠。 BMP7在2号染色体和Slc38a1在15号染色体而Tbx1染色体16。后期交叉ENU706老鼠,从第四代,没有携带 BMP7和 Slc38a1突变了但仍然拥有DGS表型。听到背后的机制缺陷包括导电和感音神经性听力损失已经被我们的听力测定(解决数字 2 (b)和 2 (c)(图)和电生理学的录音 3 (c))。这些数据表明,这是一个更有可能传导性听力损失 ENU706突变体。研究精确的基因功能、染色体工程 Df1 / +老鼠和单基因敲除 Tbx1 / +老鼠使用。杂合的损失 Tbx1导致重大心脏结构异常所观察到的类似 Df1 / +老鼠和 Lgdel / +老鼠( 16]。慢性中耳炎也是一个功能DGS的临床诊断 28]。中耳炎的发病机制被认为是产生的多种原因,如赤字的炎症间隙 30., 31日)或中耳腔粘膜( 32, 33]。我们的工作是一个让人想起研究 Df1 / +和 Tbx1 / +老鼠,包括显性遗传,盘旋,部分听力损失。最近的一份报告中进一步描述,一个缺陷在早期肌发生从而导致中耳炎DGS的小鼠模型 23]。他们的数据表明 Tbx1杂合的老鼠显示,听力损失主要是通过咽鼓管问题与肌肉的问题。然后它使的听觉阈值给定的两个耳朵之间是不同的 ENU706鼠标(图 2(一个))。它也伴随着观察的听力损失 ENU706老鼠是温和和零星的(数据 3(一个)和 3 (b))。然而,我们的工作指出,一个单点突变负责大部分的DGS的听觉特性。有趣的是,另一个基因, Comt的删除区域的DGS患者的染色体也与听力损失( 34]。

在早期开发中, Tbx1作为转录因子表达的第一个咽囊的内胚层的衬里和减数分裂的咽弓( 28]。T-box领域提出了为T-box重要蛋白质二聚和DNA结合活性。据报道,F148Y和H194Q T-box域功能实际上诱导的影响,加上G310S T-box[边界的 35]。我们推测W118R ENU706老鼠和其他T-box突变也可能有一个功能。更有趣的是,最近的研究表明,它还结合染色质可能函数epigenetically [ 36]。另一项研究提出,皮质的发展是由中胚层的表达 Tbx1( 37]。,提高TBX1函数的复杂性。这 ENU706老鼠于是提供了一种新的小鼠模型的精细解剖TBX1功能发展和生理学。

 5。结论

进一步了解的分子和生理相关性听力感觉和听力障碍,我们已经开始着手建立一个基于正向遗传学的耳聋基因小鼠的屏幕。它也是一个主要目标在我们的共同努力来确定疾病和神经系统疾病有关的基因。在这项研究中,我们为一个新的突变 Tbx1基因,导致W118R氨基酸改变TBX1 T-box地区的蛋白质。这个单点错义突变诱导一个健壮的高度保守的地区失衡影响小鼠的表型进行中度听力损失。更有趣的是,缺乏以显性遗传方式,与先前的研究是相一致的 Tbx1有缺陷的 Df1 / +老鼠和 Tbx1 / +老鼠。因此我们的研究提供了一个替代模型来研究 Tbx1功能和可能有助于剖析特定领域和组织DGS TBX1功能研究。

 相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

 作者的贡献

Jiaofeng陈和雪张了同样的工作。

 确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(31571080和31571080有熊;31571097和81371361宜昌Jia)和清华大学的研究基金(有熊,宜昌贾庆林)。

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