获得性癫痫海马神经元培养模型中MicroRNA-132与p250GAP/Cdc42通路相互作用并与癫痫发生过程相关

摘要

越来越多的证据表明，癫痫是中枢神经系统突触重组和病理性兴奋环形成的结果;然而，调节这一过程的机制尚不清楚。我们推测microRNA-132 (miR-132)和p250GAP可能通过激活下游Rho GTPase家族在这一过程中发挥重要作用。我们使用无镁培养基诱导培养海马神经元的癫痫模型来验证这一假设。我们研究了miR-132是否通过p250GAP调节GTPase活性，发现在我们的实验模型中，Cdc42被显著激活。沉默miR-132抑制培养的癫痫神经元的电兴奋性水平，而沉默p250GAP则相反。此外，我们还验证了miR-132的作用体内在锂-匹罗卡pine诱导的癫痫小鼠模型中，沉默miR-132可以抑制树突状刺的异常形成和慢性自发性癫痫。最后，我们证实沉默miR-132对培养的癫痫神经元具有神经保护作用;然而，这种作用并没有通过p250GAP途径发生。一般来说，沉默miR-132可能通过miR-132/p250GAP/Cdc42通路通过调节树突状棘的形态和电生理来抑制自发性癫痫活动;因此，miR-132可能是抗癫痫药物开发的潜在靶点。

1.介绍

癫痫是一种神经系统疾病，其特征是反复发作，导致大脑神经元的异常和同步放电。大约三分之一的癫痫患者对药物没有反应，据说患有难治性癫痫。虽然癫痫复发的确切机制尚不清楚，但阐明正常大脑转变为能够产生复发性癫痫和维持癫痫状态的机制对于理解癫痫发生和开发新的癫痫治疗方法是至关重要的。

microrna作为60%蛋白质的转录后调节因子，是细胞中蛋白质水平的主要决定因素[1]．MicroRNA-132 (miR-132)在活跃的突触发生中显著上调，并在脊柱形成和成熟中发挥重要作用[2- - - - - -5]．miR-132还调节急性脑损伤后的炎症反应和神经元凋亡[6- - - - - -8]．多项研究表明，急性脑损伤后癫痫发生过程中miR-132持续上调[9- - - - - -13]．因为突触功能障碍和重组是癫痫灶中最重要的组织病理学改变[14]，我们旨在研究miR-132是否通过调节突触重组在癫痫发生中发挥作用。

p250GAP是miR-132的靶点，在神经元突触的NMDA受体复合物中富集[2]．p250GAP是一种Rho家族GTPases激活蛋白，可以通过抑制下游Rho家族GTPases(包括RhoA、Rac1和Cdc42)的活性与多种突触蛋白相互作用[2，15，16]．它是一种重要的细胞骨架调节剂，受神经元活动相关信号通路的调节，导致细胞骨架的解聚和树突棘密度和体积的减少。在中枢神经系统中，p250GAP主要调节Rac1和Cdc42的活性。本研究旨在探讨miR-132及其靶蛋白p250GAP在癫痫发生中的可能分子机制。我们还旨在确定p250GAP如何调节GTPases在癫痫的病理过程中。

2.材料和方法

２.１.动物

本研究采用成年雄性（8-12周）C57BL/6小鼠，将小鼠置于恒温动物室内(°C)和12小时的光/暗循环，免费获得食物和水。所有实验步骤均按照国际动物使用指南和中国重庆医科大学动物护理委员会指南进行。

２.２.海马神经元培养

培养17 ~ 19日龄胚胎小鼠的海马神经元(细胞每平方厘米)在涂有聚l -赖氨酸(目录编号P1399, Sigma，美国)的板上，如前所述[17]．然后将神经元保存在含有B27(目录编号17504-044,Gibco, USA)和0.5 mM l -谷氨酰胺(目录编号G3126, Sigma)的神经基础培养基中(目录编号21103-049,Gibco, USA)。大约每3-4天更换1/3到1/2的培养基。10微摩尔的胞嘧啶β第3天加入- d -阿拉伯呋喃糖苷(目录编号C1768, Sigma)在体外(DIV3)抑制胶质细胞生长。用神经元特异性标记物MAP2 (Catalog number 11267, Abcam, USA)在DIV7对培养的神经元进行染色，以评价培养神经元的纯度。仅使用纯度大于98%的培养细胞进行后续实验。

2．3.培养海马神经元诱发自发性复发性癫痫样放电(sred)

DIV10时，将神经元置于无镁(MGF)培养基(145 mM NaCl, 10 mM HEPES, 2.5 mM KCl, 2 mM CaCl)中诱导sred₂添加10 mM葡萄糖和0.001 mM甘氨酸，用氢氧化钠将pH调至7.3，蔗糖将渗透压调至280-320 mOsm)，搅拌3 h。对照组采用非镁无培养基(non-MGF)，即在MGF培养基中添加1mm的MgCl₂．sred通常使用膜片钳记录在12-24小时内观察到，并可持续培养神经元的生命。这种海马神经元培养模型已经被认为是一种有用的模型在体外耐火材料SE的型号[18]．

２.４.细胞转染

使用miR-132拮抗剂(ant-132)沉默miR-132的表达水平。以非靶向乱码序列(Scr)作为对照(目录编号miR30000067-1-10, RiboBio, China)。使用慢病毒(LV-shp250GAP)沉默p250GAP表达，并选择相同的表达GFP的慢病毒载体(LV-GFP)作为对照(目录号LVCON077, GeneChem，中国)。神经元转染按厂家说明书进行，转染10 h后完全换掉培养基。

2．5．膜片箝记录

使用膜片钳放大器通过全细胞电流钳记录测量神经元的膜电位。将细胞培养皿安装在倒置显微镜（IX-51，Olympus，Japan）的台上，并用含有110的细胞内溶液填充膜片钳 嗯，卡斯普，30岁 毫米KCl，10 mM EGTA，10 赫普斯，5岁 mM Na ATP，1 毫米CaCl₂， 2毫米氯化镁₂， 10 mM TEACl，用CsOH调节pH至7.3，蔗糖调节渗透压至280-300 mOsm。实验在室温(22-24°C)下进行。胞内液中移液管抗性为2-4 MΩ。在建立gigaseal后，移液管的电阻和电容进行了电子补偿。全室电容补偿后，只在串联电阻<20 MΩ时进行记录。为了优化锥体神经元记录的成功率，我们根据锥体的大小和锥体体选择相亮细胞。培养的神经元树突小，轴突长，胞体直径20-26μ选择M进行电生理记录，以避免空间钳伪影。常规使用60-80%串联电阻补偿，持续监测，并根据需要进行调整。整个细胞的阻力和静息膜电位也在实验前和实验期间进行了监测，只有当这些参数保持稳定时，细胞才被接受用于研究。使用EPC-10放大器(HEKA，德国)在电流箝位模式下进行全细胞记录。采用美国Axon公司的Clamp-fit 10.0软件进行数据收集和分析。

2.6。SYBR-Green实时荧光定量PCR (qRT-PCR)

逆转录(RT)反应使用PrimeScript™RT试剂盒(目录编号RR047A，中国TaKaRa)。mirna特异性茎环引物用于miR-132的RT。样品在37°C下运行15分钟，在85°C下运行5秒，然后在4°C下保持。RT产物在运行实时PCR前未稀释保存在−20°C。Real-time PCR采用Bio-Rad Real-time PCR系统。SYBR®预混Ex Taq™2号(中国塔卡拉)。PCR混合物含有12.5μSYBR Premix Ex Taq II, 1μL (10μM PCR正向引物，1μL (10μM PCR反引物μL (RT反应溶液)和8.5μddH的L₂O. Real-time PCR在以下条件下进行:第1阶段，95°C for 30 s;阶段2,40个循环，95°C 5 s和60°C 30 s;第三阶段，分离。使用的引物为(miR-132 RT) 5 ' - gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgaccgaccacca -3 '、(miR-132正向引物)5 ' -GCGGCGGTAACAGTCTACAGCC-3 '和(miR-132反向引物)5 ' -ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3 '。采用Bio-Rad CFX Manager软件进行数据分析;这些数据用平均数表示±标准差(SD)。

2.7。免疫印迹(WB)

使用全蛋白提取试剂盒（目录号P0013，Beyotime，中国）提取总蛋白。使用增强型双金鸡氨酸蛋白（BCA）分析试剂盒（目录号P0012s，Beyotime，中国）测定总蛋白浓度，并将样品储存在−使用前温度为20℃。WB分析如前所述进行[8]．一抗为山羊抗p250gap(1: 1000，目录编号138167,Santa Cruz, USA)和兔抗cleaved caspase-3(1: 150，目录编号9661,CST, USA)。

2.8。Rac1和Cdc42激活的测量

根据生产商的方案，使用Rac1/Cdc42 activation Assay Kit(目录编号17-441,Millipore，美国)测量Rac1和Cdc42的激活。本试验使用Rac/Cdc42的下游效应物p21活化蛋白激酶(PAK1)，从样品中分离出活性的gtp结合形式的Rac/Cdc42。PAK1的p21结合域(PBD)作为GST融合蛋白表达，并偶联到琼脂糖珠上。沉淀蛋白后，进行免疫印迹，用特异性单克隆抗体和酶标二抗检测活化的Rac1和Cdc42。

2.9。tdt介导的dUTP镍端标记(TUNEL)方法

采用TUNEL检测试剂盒(目录号:11684817910，瑞士罗氏)，按照说明书检测培养海马神经元的凋亡水平。简单地说，将皮质神经元置于新鲜制备的4%甲醛溶液磷酸盐缓冲盐水(PBS)中固定20分钟，0.2% Triton X-100渗透5分钟后，与50孵育μ取TUNEL反应混合物在37℃黑暗中浸泡60分钟，然后用PBS (pH 7.4)冲洗3次，每次5分钟。将载玻片与DAPI在室温黑暗下孵育5 min，荧光显微镜下观察细胞核。凋亡指数以tunel阳性神经元数量与总神经元数量之比表示。

2.10。颞叶癫痫(TLE)实验小鼠模型和Ant-132干预

匹罗卡品模型已被广泛应用于模拟人体TLE。SE诱导:腹腔注射匹罗卡品(300 mg/kg, 0.1 mL/10 g，腹腔注射，Sigma)。在匹罗卡品第一剂前30 min给予硫酸阿托品(1 mg/kg, i.p.)。出现4 - 5阶段癫痫发作(雷辛量表)的小鼠[19在我们的研究中，我们认为匹罗卡品给药后2小时内点燃。在SE发病1 h后给予地西泮(10 mg/kg，静注)终止惊厥。所有小鼠在SE后恢复48 h，然后在脑室内注射2μL生理盐水(TLE组)、Scr-132 (TLE+Scr-132组)或ant-132 (TLE+ant-132组)。蚂蚁132的剂量为1nmol，用双蒸馏水稀释。

2.11.通过连续视频监控分析自发发作

用闭路视频系统每天记录与匹罗卡品癫痫相关的自发性复发性癫痫(SRS)的慢性期动物24小时，检测第6周的4级和5级癫痫发作。一位对这项研究一无所知的观察者回顾了这些视频。癫痫发作采用改良的六点雷辛量表进行计数。排除评分低于2分的临床事件。

2.12。Golgi-Cox染色

采用Hito Golgi-Cox OptimStain试剂盒(目录号HTKNS1125, Hitobiotec Inc.， USA)观察树突棘。在我们的实验中，蚂蚁-132处理组和Scr-132对照组小鼠的脑组织被切成100-μ在低温恒温器(德国徕卡)上进行冠状切片，并按照制造商的说明进行染色。

2.13。树突棘的形态分析与密度量化

对于形态测量，每个数据点至少分析了15个神经元μ选取每个神经元树突的M。IMARIS FilamentTracer模块(Andor Technology;贝尔法斯特，北爱尔兰)用于检测，量化和特征脊柱结构。丝状伪足定义为平均头宽≤平均颈宽的树突状突出物。细棘定义为两倍平均颈宽<棘长，平均颈宽≤最大头宽的树突状突出物。粗短刺定义为长度< 1的树突状突出物μ蘑菇刺被定义为树突状的突出物，平均头宽>平均颈宽。为了评估树突突计数的可靠性，最初进行了一项盲法研究[20.]．每个实验至少重复三次，使用独立的制剂。

2.14。数据分析

所有数据均表示为平均值±SD。使用SPSS Statistics for Windows, Version 20.0 (Armonk, NY, USA)进行统计分析。实验组之间的差异采用单因素方差分析(ANOVA)进行比较t-试验用于比较。被认为具有统计学意义。

3.结果

３．１．miR-132和p250GAP的表达与突触发生和电生理活性相关

据报道，成熟miR-132在新生大鼠海马第一周的表达水平较低，第2-4周的表达水平显著升高，这也是啮齿动物脊柱发育和成熟的关键时期[15]．在我们的研究中，C57BL/6小鼠出生后第1天至第30天miR-132和p250GAP的表达水平与前人研究相似(图)1(一)）.我们评估了miR-132和p250GAP在培养海马神经元成熟过程中的时间表达水平。miR-132在DIV5到DIV13时升高并维持在较高水平，而p250GAP蛋白在DIV5时升高而在DIV15时降低(图)1 (b)）.这一结果提示miR-132和p250GAP的表达可能与脊柱生理性成熟和突触发生的过程有关。

观察MGF处理后6 h、3 d、5 d、7 d miR-132和p250GAP的表达水平，以确定培养神经元电生理活性是否影响miR-132和p250GAP的水平。结果表明,mir - 132是调节6 h - 7 d magnesium-free介质处理后,与统计学意义6 h, 3 d,和7 d,而p250GAP蛋白表达下调6 h - 7 d magnesium-free介质处理后,与统计学意义在3 d、5 d,和7 d(数字1 (c)和1 (d)）.

结果表明，miR-132在未成熟大脑突触发生活跃期表达增加。此外，海马神经元SRED模型中miR-132的上调提示，病理性电兴奋性也可能影响miR-132的表达，这可能与癫痫发生过程中中枢神经系统的病理性突触发生有关。

３.２．miR-132通过p250GAP调控海马神经元SRED模型中Cdc42的激活

我们使用miR-132和RNA干扰特异性拮抗剂下调miR-132和p250GAP的表达(图)2(一个)和2 (b)).通过对miR-132的qRT CPR确认转染效率（图2 (c))和WB为p250GAP(图2 (d)）.经ant-132处理后，p250GAP的表达水平显著上调，这表明在我们培养的癫痫海马神经元中，p250GAP的表达水平受到miR1-132的负调控(图)2 (e)）.

Rac1和Cdc42被认为是树突分枝和突触可塑性的两个重要促进因子，而RhoA的作用方式则相反[16]．有报道称p250GAP主要调节中枢神经系统中Rac1和Cdc42的激活[16]．神经元棘和突触的病理可塑性在癫痫的病理过程中起重要作用;因此，我们通过研究Rac1和Cdc42的激活水平，探讨miR-132/p250GAP通路是否在我们培养的海马神经元SRED模型中调控Rac1和Cdc42。检测Rac1和Cdc42的激活水平。

首先，我们发现与对照组海马神经元相比，经mgf处理的海马神经元中Rac1和Cdc42的激活水平显著升高(图)3.(a1)和3.(a2))。为了确定在我们培养的海马神经元中，miR-132/p250GAP通路是否以及如何调控Rac1和Cdc42，我们评估了当miR-132或p250GAP表达被抑制时，培养海马神经元中Rac1和Cdc42的激活水平。结果表明，转染ant-132或LV-shp250GAP对Rac1活性没有显著影响(图)3.(b1)和3.(b2))，而转染ant-132后Cdc42活性明显受到抑制，转染LV-shp250GAP后Cdc42活性升高(图)3.（c1）及3.(c2))。此外，我们在mgf处理的培养海马神经元SRED模型中获得了类似的结果，但miR-132或p250GAP的表达被抑制(图)3.(d1),3.(d2),3.(e1),3.(e2))。

我们的数据表明，p250GAP可能主要作为Cdc42在培养的神经元癫痫模型中的GAP。

３．３．miR-132通过p250GAP影响海马神经元SRED模型神经元电兴奋性

为了阐明miR-132和p250GAP对神经元兴奋性的影响，我们对MGF培养基处理的培养海马神经元进行了电生理评估。我们的实验表明，ant-132处理显著降低AP频率，表明ant-132可以显著抑制SRED模型培养海马神经元的神经元电兴奋性(图)4(a2) -4(a4))。相比之下，ant-132和LV-shp250GAP联合治疗显著增加了AP频率(图)4(a5),4(a6))。

3．4．miR-132/p250GAP通路对培养神经元的神经保护作用

已知在急性脑损伤后沉默miR-132过表达具有神经保护作用[8，20.];因此，我们提出miR-132是否通过p250GAP途径调控神经元凋亡。我们首先在DIV7用ant-132横切培养的神经元，然后在DIV10诱导SRED模型。接下来，我们分别沉默miR-132和p250GAP的表达水平，研究p250GAP是否参与了miR-132的神经元凋亡作用。TUNEL染色(图5(一个)和5 (b))和WB检测cleaved caspase-3水平(图5 (c))，观察细胞凋亡水平。我们的结果表明，无论p250GAP的表达水平是否受到抑制，miR-132沉默均可降低神经元凋亡。这表明miR-132沉默具有神经保护作用，但这种作用可能通过p250GAP以外的其他途径发生。

3．5．miR-132沉默降低锂-匹罗卡品模型中的SRS在活的有机体内

然后我们研究了miR-132抑制是否能抑制慢性癫痫发作体内使用锂-匹罗卡品模型。SE后48 h注射蚂蚁132 i.c.v。第6周连续进行7 d的视频监控。通过比较Scr-132对照组，对慢性发作频率进行量化和统计分析(图)6(一))和蚂蚁-132组(图6 (b)）.我们的行为研究的统计分析表明，ant-132治疗可以保护实验小鼠防止慢性复发性癫痫发作，并可以显著降低自发性癫痫发作频率(图)6 (c)）.

3.6. miR-132沉默降低慢性癫痫小鼠脊髓重塑

一般来说，蘑菇状和粗短的刺代表更成熟和稳定的刺，而细刺和丝状伪足往往更可塑性和不成熟(图)7 (b)） ［21]．树突状树的维持中断和脊髓的发生是癫痫的两个重要的神经生理学特征。行为学观察完成后，将Ant-132处理组(EP+Ant-132)、Scr-132处理组(EP+Scr-132)和非干预对照组(EP)的所有脑组织切除并进行高尔基染色，进一步研究Ant-132处理对树突棘形态的影响(图)7(一)）.对实验小鼠海马齿状回(DG)和CA1区棘的总数和不同形态进行量化和统计分析，探讨实验小鼠海马棘密度和形态的差异。我们发现蚂蚁-132处理可以降低脊柱密度，提高稳定脊柱的比例(图)7（c）)，提示ant-132治疗可能有助于抑制癫痫病理状态下脊柱重塑。

4.讨论

本研究获得了四个主要发现。首先，miR-132和p250GAP的表达改变体内和在体外提示mir -132介导的p250GAP活性可能与脊柱的重塑过程有关。第二，miR-132/p250GAP调节获得性癫痫海马神经元培养模型中Cdc42的活性，这可能是癫痫发生过程中树突棘重塑的原因，因为Cdc42是一种重要的细胞骨架调节因子，据报道它可以触发被称为丝状足的外周刺状突起的生长[22]．第三，蚂蚁-132可以降低神经元的电兴奋性在体外通过p250GAP和ant-132可以减少慢性反复发作的发生体内．最后，在我们培养的神经元实验模型中再次验证了ant-132的神经保护作用，我们发现这种作用不是通过p250GAP途径发生的。

miR-132是一种活性依赖基因，通过调节其靶标p250GAP的翻译参与突触形成[2]．未成熟脑中的生理突触形成和/或双库库林诱导的突触活动增加可以改变miR-132和p250GAP的表达水平。相反，miR-132和p250GAP表达改变可显著影响树突棘密度和头部大小[2]．癫痫是多种急性脑损伤后突触可塑性和兴奋性回路形成的病理过程，可改变神经元活动[14，15]．我们提出mir -132调控的p250GAP也参与了癫痫的病理过程。尽管miR-132在几种癫痫模型中都观察到上调体内［2- - - - - -5]目前，还没有研究阐明miR-132在癫痫过程中的分子机制。

我们已经证实了miR-132及其靶蛋白p250GAP在培养海马神经元癫痫模型中的作用。p250GAP蛋白可以调控Rho GTPase家族成员，包括RhoA、Rac1和Cdc42，并介导肌动蛋白的细胞骨架组织。Rac1/Cdc42促进树突分枝和生长;之前的研究进行体内对p250GAP调节Rac1和Cdc42 gtp负载状态的能力结果不一致[16，22]．在这里，我们研究了树突状生长促进因子Rac1/Cdc42的激活水平，进一步证明，在癫痫放电异常神经元活性的条件下，miR-132和p250GAP主要调控Cdc42的激活水平。提示Cdc42可能是进一步研究miR-132与癫痫作用更合适的靶点。虽然沉默miR-132或p250GAP对Rac1的激活水平没有显著影响，但在我们培养的癫痫海马神经元中，Rac1的激活水平也上调;Rac1是否参与了癫痫发生过程还需要进一步的研究。

多项研究表明，在异常神经元活动的条件下，miR-132可能调节脊髓密度和树突长度的显著增加体内［2，15]．在我们的研究中，我们试图通过对ant-132处理的匹罗卡pine诱导的慢性癫痫小鼠树突棘的形态学分析，检测miR-132对癫痫发生过程中棘突重塑的影响。用蚂蚁-132治疗显著增加了海马DG和CA1区域的蘑菇状树突棘的比例，这两个区域是导致癫痫的病理突触形成的关键区域。因为蘑菇状粗短的树突刺被认为更成熟和稳定，而其他形状的树突刺，如丝状伪足和细刺，则不成熟，可塑性更强[23，24我们的实验结果表明，在癫痫发生过程中，蚂蚁132可能有助于稳定和维持海马树突棘的正常功能。

用蚂蚁-132治疗可降低SRS体内．我们对培养神经元的电生理研究也证实，ant-132可以抑制无镁培养基处理的神经元的AP频率，如果沉默p250GAP，这种作用可以逆转。这些结果提示，ant-132可能通过p250GAP通路调节神经元电兴奋这一癫痫形成过程中的重要病理变化。

有研究报道过表达miR-132可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡[8，21，25];然而，其潜在的分子机制尚不清楚。我们的研究证实，在培养海马神经元的癫痫模型中，miR-132上调可促进神经元凋亡，即使p250GAP被抑制，ant-132的神经保护作用仍然存在，提示ant-132的神经保护作用还涉及其他途径。

5.结论

总之，我们发现miR-132及其靶点p250GAP的表达与癫痫的发生有关。沉默miR-132可以减少慢性反复发作。miR-132可能通过调节p250GAP的表达、下游Cdc42的激活以及树突棘的适当形式和功能来发挥作用，这可能影响神经元的神经电活动和癫痫的发生。ant-132治疗具有神经保护作用；然而，这种效应不是通过p250GAP途径介导的。需要进一步的研究来揭示详细的机制。

相互竞争的利益

作者宣称不存在相互竞争的利益。

作者的贡献

(1)袁金贤对本研究贡献最大。(2)陈杨梅构思设计实验。黄(3)Jinxian元,豪鑫周,Xi Liu蜀Ou,徐道,李会员和马港进行了实验。(4) Jinxian Yuan分析数据并撰写论文。

致谢

基金资助:国家自然科学基金资助项目(no。81171225也没有。81571259致陈杨梅)。

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