文摘

客观的。肠上皮细胞屏障功能障碍是与溃疡性结肠炎(UC)的发展。本研究旨在探索DNMT3a对肠上皮细胞屏障功能的影响在加州大学的发展和底层机制。方法。老鼠能有3.5%的葡聚糖硫酸钠(DSS)饮用水中诱导结肠炎。主要肠上皮细胞(iec)隔离和治疗与脂多糖(LPS)建立在体外炎症模型。我们发现小鼠临床症状,组织病理学损伤,肠上皮细胞屏障功能,B细胞分化,DNA甲基化水平,细胞因子的生产。随后,从iec DNMT3a B细胞分化的影响被cocultural实验探索。结果。DSS治疗显著降低体重和结肠长度、疾病活动指数(DAI)增加,加重组织病理学损伤。此外,紧密连接的差别DSS诱导治疗对这些(TJ)蛋白质、抗炎细胞因子(il - 10和TGF -β)和抗炎B细胞的数量(CD1d +)在肠上皮组织,同时调节促炎细胞因子(il - 6和TNF -α)、促炎B细胞(CD138 +)和DNA甲基化水平。进一步在体外结果显示,DNMT3a沉默或TNFSF13超表达在iec部分废除LPS-induced上皮屏障功能障碍的结果,以及废除IEC-regulated B细胞分化的影响,而si-TACI转染逆转这些影响。此外,DNMT3a沉默TNFSF13甲基化水平降低和诱导CD1d + B细胞分化,和si-TNFSF13转染逆转B细胞分化的趋势,但并不影响TNFSF13甲基化水平。结论。我们的研究表明,DNMT3a诱发肠上皮细胞屏障功能障碍加重UC进程通过TNFSF13-mediated肠上皮细胞和B细胞的相互作用。

1。介绍

溃疡性结肠炎(UC)是一种炎症性肠病主要发生在结肠粘膜(1,2]。主要临床表现的患者有慢性腹泻,大便带血粘液脓3]。一般来说,该病容易复发,患者会增加癌症的风险(4,5]。加州大学主要发生在直肠和乙状结肠,严重情况下甚至影响整个结肠(6]。免疫异常被认为是加州大学的主要致病因素之一(7]。口服抗炎药,如氨基水杨酸,是临床治疗的主要药物,没有取得令人满意的疗效8]。最近,虽然已经取得一些进展通过关注免疫反应和炎症发病机制(9,10),准确的调节机制还没有完全体现。因此,它是特别重要的调查加州大学的发病机理发现新的治疗靶点。

肠道上皮是一种物理屏障所需的营养吸收,在体内平衡中扮演着重要角色在先天免疫(11]。肠上皮细胞(iec)吸收营养和对病原体的反应,作为一个屏障协调免疫反应(12]。相邻iec之间的结缔组织形成一种肠道屏障,阻止有害物质或病原体进入身体。在加州,肠道粘膜产生大量炎性细胞因子,进而IEC细胞凋亡影响的程度紧密连接蛋白(TJ),导致肠粘膜屏障功能受损(13,14]。B细胞及其子集分化为浆细胞参与炎症反应通过释放抗炎细胞因子(15]。例如,监管(Breg)细胞分泌TGF - Bβ和il - 10抑制炎症的发展,保护肠道屏障功能(16]。因此,加州大学的发病机制与B细胞分化,子群不平衡,和细胞因子的生产,这需要进一步阐明。

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰在哺乳动物和与转录镇压密切相关17,18]。比较分析的全基因组DNA甲基化测序结果显示,基因甲基化水平UC患者和健康对照组之间是不同的,表明DNA甲基化起着重要的作用在UC的诊断和治疗19]。目前,它已经表明DNMT1, 3种能阻碍DNMT3b DNMT3a,是证实基因编码的蛋白质与DNA甲基转移酶活性在哺乳动物20.]。DNMT3a是一种新的DNA甲基转移酶的分子量130 kda,在脊椎动物和建立高度保守的DNA甲基化通过unmethylated CpG网站(20.- - - - - -23]。TNFSF13(肿瘤坏死因子超家族成员13)是一种细胞proliferation-inducing配体,对于B细胞发育是至关重要的24]。TNFSF13可以由多种细胞产生,如T细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞和iec (25,26]。先前的研究声称,通过释放TNFSF13 iec可以调节B细胞分化和细胞因子(27]。然而,DNMT3a TNFSF13在加州大学的作用尚不清楚。

生物信息学分析结果显示,加州大学组织的B细胞数量增加可以增强DNA甲基化水平,表明这是加州大学的发展密切相关。基于生物信息学的结果和之前的证据,我们探索的影响DNMT3a在肠上皮细胞屏障功能和调节B细胞分化在加州大学的发展,以更好地了解疾病的监管网络。

2。材料和方法

2.1。小鼠结肠炎模型建立

雄性C57BL / 6小鼠,年龄6 - 8周,体重在18到22岁的g从郑州大学动物中心购买,并被关在笼子里的特定病原体免费(SPF)环境与正常免费食物和水。在研究过程中,老鼠一直在 12 h光暗周期。老鼠收到3.5% DSS(美国议员生物医学36-50 kD)饮用水连续7天,紧随其后的是普通饮用水连续3天。老鼠在假针灸组常规饮用水连续10天。动物研究是郑州大学动物伦理委员会的批准。

2.2。组织学分析

疾病活动指数(DAI)分数发现每日连续7天来评估结肠炎的伤害。戴包含测量体重,粪便一致性和大便出血。 。每个分数评估如下:减肥(0,没有;1、1 - 5%;2、6 - 10%;3、11 - 15%;4、超过15%);凳子分数:(0,正常;1 - 2、便溏;3 - 4、腹泻);大便出血(hemoccult测试):(0,-;1、积极; 2, blood present in the stool; 3, blood visibly and blood clotting on the anus; 4, gross bleeding). After the mice were sacrificed, all the colons (from the cecum to proximal rectum) were immediately removed. A tweezer was used to remove the adipose tissue and lymph nodes around the colon. Then, the colon was photographed and the length was measured. The next step, the colons were rinsed with cold PBS buffer to eliminate the fecal matter, and a 1-2 cm bowel was taken at the same location in each group. The shearing colonic tissue was fixed and stained with hematoxylin-eosin (H&E) solution as previously described [28,29日),病理变化在显微镜下测定(尼康,东京,日本)。

2.3。隔离iec和文化

iec被孤立的跟着前面的描述(30.]。小鼠肠道是纵向切割成2 - 3毫米长度与冷生理盐水清洗后。总之,肠上皮组织是刮冰载玻片和粘膜拭子resuspended在寒冷的PBS。离心机在上皮材料 ,其次是洗两次冷PBS血细胞减少污染。孤立的iec在DMEM培养(美国Gibco)含10%胎牛血清(的边后卫,Gibco), 2.5% penicillin-streptomycin-fungizone, 1%庆大霉素(美国热费希尔)6-well板块(美国康宁公司)在37°C公司为5%2。细胞被亚文化和通道每三天,和3 - 4通道细胞被用于以下实验。

2.4。CD19 + B细胞的隔离和文化

B细胞被孤立的野生型小鼠的脾脏。短暂,脾脏清洗与PBS和捣碎的准备单个细胞悬液,然后通过过滤70μm细胞过滤器(BD生物科学)。接下来,CD19 + B细胞被孤立使用磁贴上biotin-conjugated CD19抗体和antibiotin微(Miltenyi生物技术,德国)根据制造商的指导方针。孤立的CD19 + B细胞培养在RPMI-DMEM含有10%的边后卫和1%的青霉素和链霉素6-well板块(美国康宁公司)在37°C公司为5%2。细胞是亚文化,通过每周两次,第三次,或者fourth-passage细胞用于以下实验。

2.5。细胞转染

iec或CD19 + B细胞被播种在12-well板块(美国康宁公司)的密度 1毫升完整的文化中过夜。转染,si-DNMT3a或si-NC(负控制),pc-TNFSF13(包含EGF标签),或pc-NC(负控制,包含EGF标签)转染或cotransfected iec利用lipofectamine RNAiMAX试剂(美国表达载体)。转染的协议是指制造商的指示。CD19 + B细胞转染,si-TACI或其消极控制si-NC转染到CD19 + B细胞使用IEC转染试剂和方法一样。所有siRNAs和向量被Genepharma合成有限公司有限公司(上海,中国)。转染24小时后,有限合伙人(1μg / mL)被添加到文化媒介的iec和刺激48 h。细胞和细胞上清液收集下列检查。

2.6。Coculture iec和CD19 + B细胞

了解iec对B细胞分化的影响,CD19 + B细胞与iec cocultured cocultural系统(24-well Transwell板与上、下冠军,康宁,美国)在完成特定的iec和CD19 + B细胞的转染。200年μL iec的密度 cell / mL被安置在参议院,和500年μL CD19 + B细胞( 细胞/毫升)中培养低室。接下来,有限合伙人(1μg / mL)被添加到文化媒介的iec和刺激48 h。cocultured细胞在37°C和5%孵化有限公司2。随后,IEC细胞上清液、IEC和CD19 + B细胞收集进行进一步检测。

2.7。定量实时聚合酶链反应

根据指令,结肠组织的总RNA提取使用试剂盒试剂(美国表达载体)。互补脱氧核糖核酸合成与PrimeScript™逆转录工具包(豆类)和实时qPCR反应进行了使用SYBR绿色PCR试剂盒(Sangon生物技术,中国上海)罗氏LightCycler®480系统根据指令。基因的相对mRNA水平量化使用2- - - - - -ΔΔCt方法。β肌动蛋白是用作内部控制。引物序列的信使rna定量补充表中列出1。

2.8。西方墨点法

结肠组织和iec的总蛋白提取与里帕缓冲区。离心机在溶菌产物 15分钟,蛋白质浓度检测与BCA工具包(美国Bio-Rad)。接下来,蛋白质分离通过sds - page和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。膜被5%的脱脂牛奶在室温下2 h和初级抗体孵育anti-occludin (ab216327, abcam,英国),anti-ZO-1 (ab96587 abcam) anti-DNMT3a (ab188470 abcam) anti-TNFSF13 (ab108206 abcam) anti-TCAI (ab239370 abcam)和反β肌动蛋白(ab8226 abcam)一夜之间在4°C。然后,PVDF膜HRP-conjugated二级抗体孵育。最后,乐队被可视化增强化学发光(ECL)工具包和凝胶成像系统。

2.9。免疫荧光分析

结肠组织和iec收集和固定在4%多聚甲醛,然后进行常规脱蜡和水化。然后,immunofluorescent染色。主要抗体的部分被孵化antioccludin (ab216327 abcam) anti-ZO-1 (ab221547 abcam)和anti-DNMT3a (ab188470 abcam)一夜之间在4°C。完全用PBST洗净后,部分是孵化Alexa萤石488/594-labeled二级抗体室温1小时。细胞核与DAPI染色(1μBeyotime g / mL,中国)。获得的图像是由荧光显微镜(日本尼康)。

2.10。流式细胞术

从小鼠的脾脏B细胞分离。完成各种治疗后,细胞收集PBS和洗冷,然后执行fluorescence-activated细胞分选仪(流式细胞仪)分析。细胞被染色和荧光素isothiocyanate-conjugated anti-CD16/32(美国BioLegend)和孵化15分钟在黑暗中在4°C。为CD19 + CD5 + CD1d嗨B细胞染色,anti-CD19的抗体,anti-CD5, anti-CD1d添加和孵化为30分钟在黑暗中在4°C。CD138 + CD19 + B细胞染色,抗体anti-CD19 anti-CD138被添加和孵化为30分钟在黑暗中在4°C。在1500 r和5分钟两次洗涤后,分析了彩色细胞通过流式细胞术(贝克曼,CA)。确定生活的孤立的iec,碘化Propidium ReadyProbes试剂(生命技术)被用来孵化与iec 15分钟,由流式细胞仪和荧光强度进行了分析(31日]。确认iec的纯度,细胞被沾anti-CD326 (E-AB-F1181UD Elabscience,武汉,中国)30分钟和流式细胞术分析(贝克曼,CA) [32]。至于评价转染的效率EGF-labeled pcDNA-TNFSF13或pcDNA荧光率测定在流式细胞术(贝克曼,CA)。

2.11。酶联免疫吸附试验(ELISA)

鼠标和B细胞收集上层清液和血清样本用于ELISA检测。的浓度il - 6、il - 10, TNF -α,TGF -β使用相应的ELISA试剂盒进行评估(美国eBioscience)根据制造商的指示。吸光度测量在450 nm微型板块ELISA读者。

2.12。全基因组DNA甲基化检测

基因组DNA的甲基化肠上皮组织的老鼠在虚假的和DSS-induced结肠炎集团通过甲基化DNA定量检测设备(荧光、Abcam、英国)制造商的指示。DNA在肠上皮组织中提取使用通用基因组DNA提取工具包(豆类,北京)。最后,吸光度测量和读15分钟内450海里。

2.13。Methylation-Specific聚合酶链反应(MSP)分析

肠上皮组织和iec的甲基化DNA检测到使用EZ DNA Methylation-Gold™工具后的标准协议。TNFSF13引物合成了甲基化和unmethylated Genescript有限公司(中国南京)。MSP的周期参数如下:95°C 5分钟,其次是20、30和40个周期,95°C 30年代,50 - 60°C 30年代,30年代和72°C,最后延长7分钟在72°C。PCR产品是3%琼脂糖凝胶电泳和染色0.5执行μ克/毫升溴化乙锭。光密度是评估数量4.6.2(美国Bio-Rad)。

2.14。测量Transepithelial电阻(te)

层的完整性评估了iec te测量使用Millicell-ERS 2 V-Ohmmeter(美国微孔)后以前的描述32,33]。转染后si-DNMT3a或si-NC, iec resuspended成细胞悬液,播种Transwell板的密度 ,其次是有限合伙人的待遇。细胞悬液(0.3毫升, 细胞/)添加到顶端。低室播种与B细胞( )600毫升的媒介。孵化后5天,t值并通过公式计算得到: ,(Rsample:实验阻力;Rblank:空白阻力)。

2.15。统计分析

所有数据都表示为 。统计分析进行了SPSS 17.0 (IBM SPSS)和GraphPad棱镜6。单向方差分析分析是用来比较多个组之间的区别,和学生的 测试被用来分析两组之间的意义。 值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。临床症状和炎症细胞浸润与DSS-Induced结肠炎小鼠

DSS-induced小鼠结肠炎模型成立,临床症状观察。连续7天小鼠的体重检测,结果表明,体重逐渐下降在DSS组与虚假的组(图1(一))。此外,逐渐增加的戴在DSS-induced老鼠(图1 (b))。随后,小鼠安乐死和结肠组织收集。如图1 (c)在DSS,结肠长度显著缩短治疗组。与虚假的组织相比,我们发现DSS诱导显著病理损害表现中性粒细胞浸润,地穴扩张,杯状细胞减少(图1 (d))。

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图1
临床症状和炎症细胞浸润与DSS-induced结肠炎小鼠。老鼠注射3.5% DSS诱导结肠炎模型,和虚假的组仅接受常规饮用水( )。(a)和(b)每天戴体重和成绩评估。(c)老鼠牺牲,冒号(从近端直肠的盲肠)被收集。代表结肠癌样本的图像显示,结肠癌的平均长度测定。(d))染色进行近端结肠组织,代表图像的结肠病理异常展出。 与虚假的集团; 。
3.2。DSS治疗诱发肠上皮屏障功能障碍和DNMT3a水平

确定肠上皮屏障功能障碍的严重程度,的表情zonula occludens-1 (ZO-1)和occludin被检测到。免疫荧光染色结果显示,ZO-1水平和occludin的DSS治疗后显著降低(图2(一个))。同样,免疫印迹结果表明ZO-1和occludin的蛋白质含量降低的DSS组与虚假的组(图2 (b))。血清中炎性细胞因子的浓度进行测量,我们发现,il - 10和TGF -β水平相对较低,il - 6和TNF -α水平升高(图2 (c))。流式细胞术结果显示CD1d + B细胞的数量在肠上皮组织的DSS组减少,而CD138 + B细胞的数量增加(图2 (d))。此外,DSS治疗显著诱导DNA甲基化水平(图2 (e))。根据这个结果,我们进一步检测包含DNMT1的DNA甲基化转移酶水平,种能阻碍DNMT3b DNMT3a,。结果转达了DNMT3a的mRNA水平调节最三个转移酶(图中2 (f))。然后,我们评估了DNMT3a水平肠上皮组织,结果表明DSS显著诱导upregulation DNMT3a蛋白质水平(图2 (g))。这些数据都表明,肠上皮屏障功能障碍和DNMT3a水平诱导DSS-induced结肠炎。

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图2
DSS治疗诱发肠上皮屏障功能障碍和DNMT3a水平。小鼠的肠上皮组织的骗局和DSS小组收集。(a)和(b) ZO-1和occludin水平测量在肠上皮组织免疫荧光染色和免疫印迹。(c)包含L-10炎性细胞因子水平,TGF -β、il - 6和TNF -α在小鼠血清ELISA进行评估。(d) CD1d + B细胞的数量和CD138 + B细胞在肠道上皮组织由流式细胞仪检测。(e)测定总DNA甲基化水平。(f) DNMT1的表情,种能阻碍DNMT3b DNMT3a,被检测到。(g) DNMT3a蛋白质水平是由免疫荧光染色鉴定。 , , 与虚假的集团; 。
3.3。DNMT3a调节肠上皮屏障功能和B细胞分化

调查DNMT3a的作用在调节肠上皮屏障功能和B细胞分化,鼠标主要iec被孤立。首先,孤立的iec鉴定,结果表明,活细胞占85%(补充图1(一))和anti-CD326阳性细胞占88%(补充图1 (B)),这表明孤立的细胞主要是iec生活。接下来,si-DNMT3a或si-NC转染到iec然后用LPS诱导治疗炎症模型在体外。中存在的结果表明DNMT3a mRNA水平提高LPS处理时,虽然在si-DNMT3a转染表达下调,表明LPS处理和转染是有效的(图3(一个))。与此同时,LPS诱导upregulation DNMT3a蛋白水平,而si-DNMT3a转染表达下调(图3(一个))。接下来,iec与B细胞cocultured在cocultural系统中,然后加入有限合伙人对iec模仿在体外炎症模型。我们发现te的差别LPS诱导对这些基因,而DNMT3a沉默废除(图的影响3 (b))。同样,根据免疫印迹和免疫荧光染色结果,ZO-1 occludin蛋白质水平降低LPS处理时,虽然si-DNMT3a转染逆转这些结果(数据3 (c)和3 (d))。有限合伙人的待遇CD1d + B细胞的数量减少,CD138 + B细胞的数量增加,而si-DNMT3a转染部分废除有限合伙人(图的影响3 (e))。同样,il - 10和TGF -β水平相对较低的上层清液LPS-induced iec,而il - 6和TNF -α水平升高。然而,DNMT3a沉默逆转这些水平(图3 (f))。总的来说,这些发现表明,抑制DNMT3a缓解肠上皮屏障功能障碍和诱导抗炎B细胞(CD1d +)分化引起的有限合伙人。

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图3
DNMT3a调节肠上皮屏障功能和B细胞的分化。主iec肠道中分离的上皮组织的老鼠。小鼠脾脏B细胞被孤立的广式。然后,si-DNMT3a或si-NC转染进iec然后处理有限合伙人(1μg / mL) 48 h。细胞被分为4组:iec、iec + LPS, IECs-si-NC + LPS, IEC-si-DNMT3a +有限合伙人。(一)DNMT3a mRNA水平和蛋白水平在每组iec测量。(b) si-DNMT3a或si-NC转染后24 h, iec与b细胞在cocultural系统中,cocultured和有限合伙人(1μg / mL)添加到iec和培养48 h。四组被分配如下:iec + B, iec + B + LPS, IEC-si-NC + B + LPS, IEC-si-DNMT3a + B +有限合伙人。te的iec每组被检测到。(c)和(d) ZO-1 occludin蛋白质含量测定免疫印迹和免疫荧光染色。(e) CD1d + B细胞和CD138 + B细胞被流式细胞仪检测。(f) il - 10, TGF -β、il - 6和TNF -α水平细胞上清液检查。 与iec或iec + B组;# # , # # # 与IEC-si-NC +有限合伙人或IEC-si-NC + B + LPS组; 。
3.4。过度的TNFSF13 iec通过TACI诱导B细胞分化

我们下一个调查TNFSF13是否调节IEC诱导B细胞的分化。GSE81211数据集被用来屏幕高的基因DNA甲基化水平在溃疡性结肠炎和筛选基因的热图(图中显示4(一))。根据先前的研究,TNFSF13是肿瘤坏死因子配体家族的一员,由肠上皮分泌细胞和免疫细胞的分化中起着重要的作用,如B细胞(25,34]。我们的研究结果表明,TNFSF13 DNA甲基化水平升高在DSS-induced结肠炎肠上皮组织,在mRNA水平和蛋白质水平降低(图4 (b))。接下来,TNFSF13在iec中pc-TNFSF13转染然后cocultured B细胞。我们发现超表达的TNFSF13 TNFSF13的信使rna和蛋白质水平明显增加,而对TNFSF13 DNA甲基化水平没有显著的影响(图4 (c)和补充图1 (C))。跨膜催化剂和calcium-modulator还有配体(TACI), B细胞中表达,是一种受体TNFSF13 [35]。我们随后击倒TACI si-TACI转染B细胞,和结果表明,信使rna和蛋白质水平显著降低(图4 (d))。进一步的结果显示,B细胞TACI沉默CD1d + B细胞的数量减少,CD138 + B细胞的数量增加,和超表达TNFSF13 iec未能扭转这一结果(图4 (e))。此外,si-TACI转染诱导il - 10和TGF -β在差别水平对这些细胞上清液,而诱导upregulation il - 6和TNF -α的水平。有可能的是,pc-TNFSF13转染的iec未能扭转这些细胞因子(图的水平4 (f))。综上所述,这些数据表明,过度的TNFSF13 iec增强抗炎B (CD1d +)细胞分化通过TNFSF13 / TACI信号。

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图4
过度的TNFSF13 iec通过TACI诱导B细胞分化。(a) GSE81211数据集被用来分析DNA甲基化水平高的基因在加州大学,和筛选基因的热图中显示。(b)的小鼠肠上皮组织骗局和DSS小组收集。TNFSF13 DNA甲基化水平、mRNA水平和蛋白水平进行评估。(c) iec与pc-TNFSF13转染或治疗后pc-NC有限合伙人(1μg / mL) 48 h。细胞被分配成4组:iec、iec + LPS, IECs-pc-NC + LPS, IECs-pc-TNFSF13 +有限合伙人。甲基化水平和iec和蛋白质水平的mRNA水平TNFSF13上层清液的检查。(d) si-TACI或si-NC转染B细胞,TACI mRNA和蛋白水平检测。(e)接下来,iec有或没有pc-TNFSF13转染与B细胞有或没有cocultured si-TACI转染。分裂的组织如下:iec + B +有限合伙人(TACI通常表达于B细胞),iec + B-si-TACI +有限合伙人(TACI击倒在B细胞),IEC-pc-TNFSF13 + B +有限合伙人(TACI正常B细胞表达,TNFSF13在iec)中,和IEC-pc-TNFSF13 + B-si-TACI +有限合伙人(TACI击倒在B细胞,TNFSF13在iec)组。CD1d + B细胞的数量和CD138 + B细胞通过流式细胞仪测定。(f) il - 10, TGF -β、il - 6和TNF -α水平细胞上清液检查。 , 与虚假的或IEC或B + si-NC或LPS组;# # # 与IECs-pcNC +有限合伙人或有限合伙人+ si-TACI组。
3.5。DNMT3a通过TNFSF13-Mediated DNA甲基化调节B细胞分化

理解是否DNMT3a TNFSF13通过甲基化调节B细胞分化,si-DNMT3a转染进iec和TNFSF13甲基化水平测定。我们发现DNMT3a沉默TNFSF13甲基化水平降低,但增强TNFSF13信使rna和蛋白质水平(图5(一个))。接下来,si-DNMT3a和si-TNFSF13 cotransfected iec,我们发现DNMT3a沉默显著降低TNFSF13甲基化水平,但增加TNFSF13 mRNA和蛋白水平。然而,击倒TNFSF13逆转TNFSF13信使rna和蛋白质水平的数据后DNMT3a沉默但没有意义影响TNFSF13甲基化水平(图5 (b))。同时,DNMT3a沉默增强CD1d + B细胞分化但减少CD138 + B细胞分化,而引起的效应DNMT3a沉默被击倒的逆转TNFSF13(图5 (c))。DNMT3a沉默也抑制il - 6和TNF -的生产α在细胞上清液而增强il - 10的释放和TGF -β。可能,cotransfection si-DNMT3a和si - TNFSF13否定这些结果(图5 (d))。此外,我们增加了实验的转染si-DNMT3a或si-NC iec没有有限合伙人的待遇。结果显示存在和免疫印迹,DNMT3a表达显著降低,表明有效转染(补充图1 (D)- - - - - -1 (E))。的MSP检测结果显示,击倒DNMT3a TNFSF13甲基化水平没有显著影响(补充图1 (F))。在下面,iec si-DNMT3a或si-NC转染cocultured B细胞。我们发现DNMT3a无显著影响的可拆卸的紧密连接蛋白(ZO-1和occludin)水平和炎性细胞因子(il - 10, TGF -β、il - 6和TNF -α在B细胞上清液(补充图)水平1 (G)- - - - - -1 (H)),这意味着击倒DNMT3a TNFSF13没有显著影响甲基化没有有限合伙人的待遇。最重要的是,这些发现表明,抑制DNMT3a增强IEC-induced抗炎B (CD1d +)细胞分化在UC TNFSF13-mediated DNA甲基化模式。

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图5
DNMT3a通过TNFSF13-mediated DNA甲基化调节IEC-induced B细胞分化。(一)si-DNMT3a或si-NC转染进iec然后处理有限合伙人(1μg / mL) 48 h。细胞被分为4组:iec、iec + LPS, IECs-si-NC + LPS, IEC-si-DNMT3a + LPS组。甲基化水平和iec mRNA水平和蛋白水平的TNFSF13浮在表面的测量。(b) si-DNMT3a和si-TNFSF13 cotransfected iec然后处理有限合伙人(1μg / mL) 48 h。iec分组如下:iec + LPS, IEC-si-DNMT3a + LPS, IEC-si-DNMT3a-si-TNFSF13 + LPS组。甲基化水平和iec mRNA水平和蛋白水平的TNFSF13浮在表面的测量。(c) iec与si-DNMT3a cotransfected si-TNFSF13然后cocultured B细胞。iec处理有限合伙人(1μg / mL) 48 h。cocultural细胞分为3组:iec + B + LPS, IEC-si-DNMT3a + B + LPS, IEC-si-DNMT3a-si-TNFSF13 + B +有限合伙人。流式细胞术测定进行了探测CD1d + B细胞的数量和CD138 + B细胞。(d)炎性细胞因子在细胞上清液通过ELISA测定。 , 与空白或LPS组。空白:iec没有任何治疗;# # , 与有限合伙人+ si-NC或有限合伙人+ si-DNMT3a组。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们探索的影响和潜在机制DNMT3a结肠炎。我们首先发现了明显的临床症状,肠上皮细胞屏障功能障碍,和病理损伤小鼠DSS-induced结肠炎。的在体外结果显示,DNMT3a沉默或TNFSF13超表达部分废除DSS对肠上皮细胞屏障功能的影响和B细胞分化,而si-TACI转染逆转TNFSF13进行靶向治疗的效果。DNMT3a沉默增强TNFSF13表达和诱导CD1d + B细胞分化,而这些si-TNFSF13转染后结果正好相反。我们的研究结果加深了理解DNMT3a-mediated甲基化在加州大学通过TNFSF13 / B细胞分化TACI途径。

DSS是一种水溶性和antihemorrhagic硫酸多糖溶液的影响(36]。结肠炎的DSS-induced小鼠模型已广泛应用于基础研究了解病因和发病机制因其简单、稳定、重现性和可控性(37]。在这项研究中,DSS-induced老鼠体重显著损失,减少结肠长度、和明显的组织病理学损伤,表明动物模型成功建立了基于前面的研究(38]。肠道上皮屏障损伤和异常炎症反应的共同特征是DSS-induced结肠炎(39,40]。,TJ蛋白ZO-1和occludin的水平是必要的为了维护肠粘膜屏障功能和衰减加州大学(41,42]。我们的研究显示,DSS-induced结肠炎导致ZO-1和occludin水平的下降,抗炎细胞因子的水平,和CD1d + B细胞的数量,同时增加了促炎细胞因子水平,CD138 + B细胞的数量,和DNA甲基化水平,与先前的研究一致(43- - - - - -45]。

DNA甲基化是一个重要的和守恒的表观遗传标记与基因组稳定、不活跃转录和环境响应(46,47]。大量的研究表明,DNA甲基化起到预测和有针对性的治疗作用在各种疾病,包括加州大学(48- - - - - -50]。外周血单核细胞DNA的测序分析溃疡性结肠炎患者建议DNMT3a参与加州大学的规定(51),没有被确认在UC患者或模型。TNFSF13已被确定为一个关键调节器的B细胞发育和分化,从iec和TNFSF13可以释放26,52),而TNFSF13是否会影响iec和B细胞分化之间的相互作用在加州大学是未知的。在这项研究中,我们发现DSS诱导治疗upregulation DNA甲基化水平,DNMT3a水平,TNFSF13结肠组织中甲基化水平。已经证实,DNA甲基化参与调节细胞分化[53]。的在体外结果表明,DNMT3a沉默在iec TNFSF13甲基化水平降低,促进了CD1d + B细胞分化在LPS征服,和击倒TNFSF13 reversedCD1d + B细胞分化但TNFSF13甲基化水平没有显著影响。同时,我们探索的影响DNMT3a TNFSF13甲基化沉默,炎症反应在缺乏有限合伙人的待遇。不同于上面的数据,我们发现DNMT3a沉默TNFSF13甲基化无显著影响,紧密连接蛋白的水平,和炎性细胞因子水平。的可能原因是基底DNMT3a很低,和它击倒没有LPS刺激对TNFSF13甲基化调控几乎没有影响。TACI是TNFSF13和表达的受体B细胞(35]。在B细胞TACI沉默后,促炎CD138 + B细胞分化是增强的,并没有受到TNFSF13超表达。这些数据表明,DNMT3a诱导肠上皮细胞屏障功能障碍加剧UC进展通过TNFSF13 / TACI-mediated肠上皮细胞和B细胞的相互作用。据我们所知,本研究首次强调DNMT3a的作用在调节IEC屏障功能和IEC和B细胞之间的交互。此外,我们进一步揭示DNMT3a介导的机制之间的通信通过影响TNFSF13 iec和B细胞甲基化。类似于我们的数据,藤井裕久等人证明了另一个DNA甲基转移酶DNMT1表达增加在UC患者直肠上皮和参与加州大学发展的规定54]。Uzzanet al。澄清,TACI III型膜蛋白能够绑定TNFSF1 TNFSF1调节B细胞增殖和分化通过绑定TACI受体在炎症性肠病55]。应该注意的是,这些提供了证据支持我们的数据在某种程度上。

总之,我们的数据表明,DNMT3a调节DSS-induced结肠炎小鼠以及增加DNA甲基化水平和促炎细胞因子在结肠。此外,我们的研究提供了证据表明DNMT3a沉默防止炎症通过TNFSF13 / TACI信号通路增强抗炎CD1d + B细胞分化,抑制促炎反应在体外。我们的研究可能提供一种新颖的见解,加州大学的调查。然而,这项研究是初步的,并为更深层次的发现进一步的研究是必要的。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作得到了河南大学和大学的重点科研项目(排名20 a320064)和医学科学技术解决河南省(没有的关键项目。LHGJ20200376)。

补充材料

补充图1:识别的孤立的iec, pc-TNFSF13转染效率,DNMT3a沉默在LPS-induced炎症模型的影响。(一)孤立iec沾了碘化propidium ReadyProbes™试剂、荧光强度是衡量流式细胞术来评估生活iec的速度。(B) anti-CD326抗体与iec孵化,并通过流式细胞术积极率评估。(C)与fluorescence-labeled EGF pc-TNFSF13或pcNC转染iec,和通过流式细胞仪检测转染的效率。(D) si-DNMT3a或si-NC转染到iec, DNMT3a mRNA水平,DNMT3a蛋白质水平(E)和TNFSF13 (F)测定甲基化水平。(G)转染后si-DNMT3a或si-NC iec与B细胞cocultured,紧密连接蛋白水平(ZO-1和occludin),和炎性细胞因子水平(il - 10, TGF -β、il - 6和TNF -α在B细胞上清液测定。# # 与IEC-siNC组。补充表1:RT-qPCR引物序列。(补充材料)