高浓度的尿酸和血管紧张素II附加作用产生内皮损伤

抽象的

代谢综合征(MS)患者肾素血管紧张素(Ang)系统(RAS)激活与尿酸(UA)水平升高相关，导致内皮系统功能障碍。我们之前的研究表明，过量的UA可通过醛糖还原酶(AR)途径导致内皮损伤。这项研究首次表明，高浓度的Ang II在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中增加活性氧(ROS)成分，包括O₂^⋅-和H.₂O.₂，并进一步加重高UA (HUA)诱导的内皮系统损伤。在MS/高尿酸血症模型中，一氧化氮(NO)的生成减少，随后总抗氧化能力(TAC)下降，血清中内皮损伤标志物von Willebrand因子(vWF)的浓度增加。用过氧化氢酶和聚乙二醇共价连接超氧化物歧化酶(PEG-SOD)单独去除H₂O.₂和o.₂^⋅-或用AR抑制剂ePalrestat治疗减少了ROS和H.₂O.₂，增加NO水平和TAC，减少vWF释放。综上所述，这些数据表明，HUA和Ang II通过氧化应激和O的特异性消除共同作用，导致内皮功能障碍₂^⋅-和H.₂O.₂改善内皮功能。为预防或延缓代谢性疾病引起的内皮损伤提供了理论依据。

1.介绍

由于经济发展和改善的生活水平，成年人和儿童的肥胖正在增加。代谢综合征（MS）与肥胖，动脉粥样硬化，高血压，脂质代谢的扰动有关，胰岛素抵抗力[1］．血管紧张素（Ang）II是与MS相关的最良好的学习因素。内皮损伤的机制涉及氧化应激，氧化还原信号途径激活和细胞因子和炎症因子再激活[2］．MS与Heathericemia相关[3.-5.］．尿酸（UA）是一种抗氧化剂，其水平的增加是对内皮损伤的保护性[6.］．我们以前的研究发现，UA具有抗氧化能力;然而，高浓度的UA（HUA）也会导致内皮功能障碍[7.-12.］．

活性氧物质（ROS）的生产，内皮型一氧化氮（NO）合酶（eNOS）活性的减少，并且毫无释放的下降被认为包括内皮损伤的突出机制[13.］．代谢和病理过程都会产生ROS，清除能力减弱导致氧化剂和抗氧化剂失衡，导致氧化应激。HUA和Ang II是否通过氧化还原信号通路激活内皮损伤并阻止NO生成尚不清楚。有证据表明，醛糖还原酶(AR)途径与ROS的产生有关，在内皮损伤时被激活[7.那14.］．AR激活是否参与HUA和Ang II引起的内皮损伤中ROS的生成尚不清楚。

因此，在本研究中，我们使用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和构造的MS的模型。的ROS清除剂或抑制剂AR施用来检查的关系，并引起高尿酸血症和Ang II内皮损伤的作用机制。

2.材料和方法

2．1．动物

雄性自发性高血压(SHR)大鼠于大约10周龄时从北京维生河实验动物科技有限公司(中国北京)获得。实验方案由中国人民解放军总医院动物保护与使用委员会批准。所有动物同时被饲养在单独的不锈钢丝笼中，控制温度(22°C至24°C)和相对湿度(40-50%)，并保持12小时的黑暗和光照周期。

2.2。饮食和实验设计

所有动物最初提供高脂大鼠饲料1周和维持这种饮食。食物和水消耗自由采食。将大鼠随机分为5组6只大鼠。MS组消耗的食物随意;the MS with the HUA group was administered oxonic acid (250 mg kg^－1D.^－1）和UA（250 mg kg^－1d^－1）通过腹膜内注射连续10天;过氧化氢酶组（Hua +过氧化氢酶）接受了12 ku kg^－1d^－1过氧化氢酶(Sigma，美国)腹腔注射;SOD组(HUA+聚乙二醇共价连接超氧化物歧化酶(PEG-SOD))注射2 × 10^4. U kg^－1d^－1肌肉注射PEG-SOD (Sigma，美国);依帕司他组给予100 mg kg^－1d^－1EPALRESTAT（长江药业集团，江苏，中国）通过灌溉。在第10天，由戊巴比妥钠（40mg / kg）组成的腹膜内麻醉，收集血液，尿液和肾组织。

２.３.细胞培养

将HUVEC从YRbio（目录＃NC006，长沙，中国）在37℃下在湿润的培养箱中在5％CO购买并培养在补充有10％胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基₂的气氛。UA (Sigma，美国)和Ang II (Sigma，美国)在培养基中的最终浓度为600μ.mol / l和  mol/L, respectively. Cells were stimulated by HUA or Ang II for 24 h, and then, the supernatant or protein was harvested for assay. For the NO assay, the medium was replaced with Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM).

２.４.动物培养上清液和血清中NO水平的测定

在用化学物质或UA处理之前，用DMEM替换培养基。根据制造商的说明，将培养上清液或动物的血清进行离心并进行无水平评估，并进行无氧化氮测定试剂盒（Applygen Technologies）。终点化合物是没有₂^-[7.］．

2．5．细胞内活性氧测定

使用的ROS测定在前一项研究中引用[7.］．将细胞接种到35mm共聚焦培养皿(带有盖玻片)上，并将细胞分为对照、HUA、Ang II或HUA+Ang II组。24 h后，用总氧化应激指标氯甲基衍生物二氯二氢荧光素二乙酸酯(CM-H)孵育细胞₂中国南京，5μ.M)在37°C的黑暗中放置30分钟。PBS冲洗三次后，用激光扫描共聚焦显微镜(FV1000, Olympus, Tokyo, Japan)在激发波长488 nm和发射波长515 nm下观察绿色荧光。细胞内ROS成分的检测方法如下。对啊₂^⋅−，将细胞与4孵育 μ.mol/L Mito-SOX Red (Invitrogen) in the dark at 37°C for 10 min, and red fluorescence was observed at an excitation wavelength of 510 nm and an emission wavelength of 580 nm. For H₂O.₂， 30μ.mol / L BES-H₂O.₂(Seebio, China)在37°C黑暗条件下1h，在激发波长485 nm和发射波长515 nm下观察到绿色荧光。为^⋅OH，细胞用100μ.在黑暗中在37℃下摩尔/升磷氟胺（Invitrogen）在37℃下在488nm的激发波长和520nm的发射波长下观察到绿色荧光。为¹O.₂， 20μ.mol / L trans-1 - (2 -甲氧基乙烯基(methoxyvinyl, methoxyvinyl, methoxyvinyl, Invitrogen, methoxyvinyl, methoxyvinyl, pyrene, Invitrogen, Invitrogen)在37°C的黑暗中浸泡10分钟，在405 nm的激发波长和460 nm的发射波长下观察到蓝色荧光。对于ONOO^-，将细胞与10孵育 μ.mol/L dihydrohodamine 123 (Santa Cruz)在37°C的黑暗下放置30 min，在激发波长488 nm和发射波长520 nm下观察到绿色荧光。

2.6。Western Blotting.

对于蛋白质印迹[7.用RIPA裂解缓冲液(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5%脱氧胆酸盐，1% Nonidet P-40, 0.1% SDS, 1 mM PMSF和蛋白酶鸡尾酒1μ.g / mL)。用BCA试剂盒(Pierce)测定蛋白浓度。蛋白质样品(50μ.G每泳道）通过12％SDS-PAGE分离并转移到硝酸纤维素（NC）膜中。将膜在5％非牛奶中在4℃下在4℃下孵育过夜，然后与初级抗体，抗enos和p-eNOs孵育^SER1177.（Santa Cruz公司，美国）和NOX2和的Nox4（Cell Signaling Technology公司，MA，USA）;β-actin (Abcam, USA)作为内部控制。根据制造商的说明，使用ECL试剂(Santa Cruz Biotechnology, USA)观察免疫反应条带。使用Quantity One软件(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)定量蛋白质条带强度。

2.7。测量血清H.₂O.₂，总抗氧化能力（TAC）

血清H.₂O.₂动物的水平使用过氧化氢测定试剂盒（NJJCbio，南京，中国）检查最终产品，锰测定²⁺．动物的TAC使用用商业试剂盒（生物技术研究所碧云天，南京，中国）的三价铁还原抗氧化能力（FRAP）法测定。

2.8。测量血管性血友病因子(vWF)和内皮素-1 (ET1)水平

将融合的HUVECs在含1% BSA的无血清培养液中饥饿4 h，然后用Ang II或HUA孵育24 h。收集培养基，裂解剩余细胞，测定总vWF水平。使用von Willebrand因子ELISA试剂盒(Invitrogen公司，美国)测定VWF的相对含量。基底和刺激释放以细胞中总vWF的百分比表示。同样，用商品化ELISA试剂盒(无锡东林科技发展有限公司，中国)检测动物血清vWF水平，定量ng/mL。采用ET1酶联免疫吸附测定试剂盒(Elabscience，中国)，按照说明书进行细胞培养基或动物血清中ET1的测定。

2.9。NADPH氧化酶活性测定

为了测定NADPH氧化酶活性，用肝裂解缓冲液裂解细胞，并准备分析议定书，然后遵循中国海军纤维有限公司提供的指示。计算总NOX活动并与U /显示出来μ.G蛋白。

2.10。腹膜内葡萄糖耐量测试

当动物分别为4个月或1岁进行腹膜内葡萄糖耐量试验（IPGTT）。将动物用30％的腹膜内注射（ ）d -葡萄糖溶液(2 g葡萄糖/kg体重)。分别于给糖前及给糖后10、30、60、120 min从切尾端取血。用测试试剂条(ExacTech w;Baxter Travenol, Deerfield, IL, USA)。用放射免疫法测定血清免疫反应性胰岛素浓度(胰岛素RIA试剂盒;Pharmacia-Upjohn Diagnostic, Uppsala，瑞典)与大鼠胰岛素标准(Novo研究所，Bagsvaerd，丹麦)。

2.11。统计分析

所有数据都表示为 ．多组间比较采用SPSS 14.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)。两组间均数比较采用随机对照法 -测试。一个值< 0.05认为有统计学意义。

3.结果

3．1.HUA和Ang II协同增加内皮损伤

为了证实HUA和Ang II引起内皮损伤，我们检测了600处理HUVECs后细胞培养液中NO的含量μ.mol / L或10^－7 mol/L Ang II for 24 h. Compared to NO levels in the normal control, the NO level was significantly decreased in the HUA and Ang II groups ( 那数字1（a）)．此外，HUA+Ang II组NO显著低于HUA和Ang II组( 那数字1（a）)．另外，与对照组中，HUA和Ang II基团中的磷酸eNOS-Ser-Ser1177蛋白质水平显着下调，在Hua + Ang II组中，eNOS水平比Hua和Ang II组中的那些（ 那数字1（b）），符合华+ ang II组在Hua + Ang II组中的显着较低。此外，我们在细胞补充剂中测定了内皮细胞损伤标志物VWF和ET1浓度;与正常对照相比，HUA和Ang II组的数据显示VWF和ET1显着增加;特别是，在华+ ang II组中，它们比Hua和Ang II群体中的群体显着更高（图1（c）和1 (d))．以前的研究确定华可以介导内皮细胞炎症[10.];因此，我们测量了炎症介质IL-1β细胞补充剂中的IL-18浓度;数据显示IL-1βHUA、Angⅱ组IL-18较正常对照组显著升高;特别是，在华+ ang II组中，它们比Hua和Ang II群体中的群体显着更高（图1 (e)和1 (f))．综上所述，我们的数据表明，HUA有效地损害内皮细胞，并与Ang II相互作用。

３．２．HUA和Ang II通过协同作用促进ROS的产生

ROS对于生物体至关重要，但ROS的恒定积累可以损害细胞内蛋白质，脂质，细胞核和线粒体DNA。四个主要的细胞ROS组件是o₂^⋅-那^⋅哦,¹O.₂和H₂O.₂，所有这些都可以互连[15.-19.］．onoo^-不是细胞的ROS成分，而是NO和O的反应产物₂^⋅−．通过共聚焦显微镜，我们使用不同的探针测量了细胞内总ROS水平及其组分(图)2)．与对照组相比，总ROS、H₂O.₂阿,₂^⋅-那^⋅哦,ONOO^-HUA、Ang II和HUA+Ang II组升高( )．HUA+Ang II组总ROS水平与HUA或Ang II组无明显差异( )．然而,H₂O.₂和^⋅HUA+Ang II组的OH水平明显高于HUA和Ang II组( 和 那分别)。此外,阿₂^⋅−Hua + Ang II集团的水平显着高于华群（ ）但类似于Ang II组（ )．与正常对照组相比¹O.₂在华集团（ ）但在Ang II组中增加（ )．当¹O.₂HUA+Angⅱ组低于Angⅱ组( ），但两组之间没有观察到差异¹O.₂HUA和HUA+Ang II组的水平( )．因此，这些数据表明，华和Ang II加剧了总细胞内ROS和细胞内H的产生₂O.₂阿,₂^⋅-那^⋅哦,ONOO^-并促进氧化应激。但是，UA能够部分清除¹O.₂．

３．３．HUA和Ang II提高NOX活性

NADPH氧化酶（NOx）是一种具有高水平超氧化物和二次氧化剂的特征良心的酶[20.］．因此，我们检测到的两个共同NOXs，NOX2和NOX4，其中通过HUA或血管紧张素Ⅱ诱导的损伤的内皮细胞。结果表明，该HUA或血管紧张素Ⅱ组分别增加在NOX4蛋白质和活性（图3.)．特别是，HUA+Ang II组与HUA或Ang II组相比，它们明显增加。各组间NOX2蛋白水平和活性均无显著变化。说明HUA可通过上调NOX4，产生过量ROS，促进Ang II诱导的内皮细胞损伤。

3．4．女士模型

我们使用高脂肪食物的SHR大鼠构建了一个MS模型。数字4(一)和4 (b)显示动物的体重和血压随着年龄的增长而增加。成年大鼠血压稳定。这些动物用氧烯酸和尿酸诱导高尿酸血症，并给予PEG-SOD、过氧化氢酶和依帕司他。

治疗2周后，体重下降，但各组间无显著差异。与基线水平相比，各组血清甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血糖(BG)水平均显著升高( ）;但是，没有差异的群体中找到。血清总胆固醇（TC）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）各组的水平在治疗后升高，但没有彼此显著不同。相较于MS的动物的血清UA的浓度下，HUA +过氧化氢酶，HUA + PGE-SOD和HUA +的血清浓度UA依帕司他组显着升高（ ）(表1和2)．同时检测治疗后动物腹腔糖耐量和血清Ang II浓度;结果显示各组间IGTT无差异(图4 (c)）;HUA动物模型血清Ang II水平显著升高，但过氧化氢酶、PEG-SOD和依帕司他均未降低Ang II浓度(图)4 (d))．

3.5。ROS清除改进了MS型号内皮功能

与MS动物相比，HUA组血清NO和TAC水平显著降低，H₂O.₂内皮损伤标志物vWF和ET1水平和浓度升高( )．HUA+过氧化氢酶组、HUA+PEG-SOD组和HUA+依帕司他组血清NO和TAC水平均显著升高₂O.₂vWF和ET1浓度降低( ）（数字5.)．

4。讨论

多发性硬化症患者常表现为高尿酸血症。MS中最常被研究的成分之一Ang II也与血压调节、内皮损伤和血管重塑有关。UA作为嘌呤代谢的最终产物产生于哺乳动物系统，是人类血浆中含量最丰富的抗氧化剂，具有清除自由基的特性。在人类和其他高等灵长类动物中，UA是嘌呤分解代谢的最终化合物，但所有其他哺乳动物都通过尿酸酶将UA转化为尿囊素，而人类和其他高等灵长类动物缺乏这种酶[21.］．然而，HUA对人体健康有害。尿酸水平明显升高会引起痛风和肾结石[22.]，并与心血管疾病(CVD)的风险增加有关，特别是高血压、肥胖/多发性硬化和肾脏疾病[23.-28.］．氧化应激是高尿酸血症引起内皮功能障碍的关键环节。

研究人员已经证明，内皮功能障碍与无产量下降和ROS生产增加相关[29.］．内皮细胞释放的NO减少是损伤的标志。在我们的研究中，Ang II和HUA导致HUVECs上清液中NO水平下降，HUA+Ang II共同降低NO释放。磷酸化的eNOS是NO的合成酶，也表现出类似的趋势。此外，研究表明，Ang转化酶抑制可以抵消Ang ii介导的内皮细胞功能障碍[30.］．我们的体外数据还显示出内皮细胞损伤标记标记标记标记，HUA + Ang II显着增加。因此，我们相信Ang II和华则表现得显着引起内皮细胞损伤。除了那些，我们还发现尿酸和Ang II不仅诱导IL-1β和IL-18分别分别分泌内皮细胞，与其他报告类似[31那32]但也可以加剧由Ang II诱导的那些炎症介质分泌物。该机制可能是尿酸和ang II触发炎症的激活，例如NLRP3 [32那33］．

有证据表明，由高尿酸血症介导的氧自由基的产生是内皮功能障碍的重要起始因素[34］．四个主要的细胞ROS组件是o₂^⋅-那^⋅哦,¹O.₂和H₂O.₂，所有这些都可以互连[15.-19.]并且可以损伤细胞。氧化还原反应最初导致o的生产₂^⋅-，可以转化为H₂O.₂然后转换为其他ROS组件;因此，O.₂^⋅-和H.₂O.₂是最重要的活性氧成分[35］．

我们的研究表明，Ang II增加了O₂^⋅-那¹O.₂H₂O.₂那^⋅哦,ONOO^-在HUVECs水平。此外，治疗600μ.mol / l ua增加o₂^⋅-那^⋅哦，和h₂O.₂水平，但下降¹O.₂水平，也是通过前一项研究证实的[7.］．O.₂^⋅-转化为H₂O.₂草皮。我们的结果表明，HUA不能抑制O₂^⋅-但促进了生产的O₂^⋅-，与其他报告一致[36］．此外，我们还测定了ONOO^-水平，与内皮功能障碍的发展相关[37那38］．O含量过高₂^⋅-反应没有生产ONOO^-．当通过Ang II刺激细胞与华，o相结合时₂^⋅-H₂O.₂那^⋅哦,ONOO^-水平提高了，但是¹O.₂水平下降。综上所述，我们的结果表明，HUA增加总ROS的产生，但清除¹O.₂．

为了澄清，通过该HUA和Ang II造成损害，我们构建与高尿酸血症的MS大鼠模型的机制。该模型包括饲喂高脂肪和高葡萄糖饲料8周SHR大鼠。该模型的表型上的大多数特征MS [自然人类疾病的过程中观察到的39］．这些动物的血压在5-6周时开始升高，并随着年龄的增长而持续升高，成年动物的收缩压达到180- 200mmhg [40］ ［41］．高脂高糖饲粮给药期间，血清TG、LDL-C、BG水平逐渐升高，腹部脂肪增厚，体重迅速增加。但高血糖加重时，体重增加速度减慢，甚至出现体重下降(见图)3.)．此外，与基线数据相比，我们观察到MS大鼠的肾功能随着更高的SCR和BUN而下降。特别是，与MS大鼠相比，华动物的肾功能受损得多。以上数据指示Ang II和华加重肾脏损伤。在MS患者中也可以观察到这些现象[42］．

HUA组血清NO和TAC水平低于MS模型，内皮损伤标志物vWF和H浓度低于MS模型₂O.₂提示MS模型发生内皮损伤，高尿酸血症加重了损伤。

在细胞实验中，h₂O.₂和o.₂^⋅-是内皮损伤的关键活性氧，在内皮损伤过程中起重要作用。因此，我们使用过氧化氢酶来清除H₂O.₂和PEG-SOD清除O₂^⋅-在动物研究中。我们之前的数据表明，HUA促进了HUVECs中AR的表达和活性的增加[7.那8.］．AR抑制剂ENALRESTAT在HUVECS中减少了华润诱导的ROS生产。参与缺血/再灌注损伤，糖尿病神经病变和血管损伤的过程，也与ROS生产密切相关[43那44］．研究人员发现AR的激活会增加NADH/NAD⁺比率并降低NADPH / NADP⁺，加速活性氧生成，减少NO，导致内皮损伤[45］．我们还发现，在HUA+Ang II处理中，NOX4而非NOX2显著上调，且NOX活性增加。因此，我们使用AR抑制剂依帕司他来治疗动物。经过氧化氢酶、PEG-SOD或依帕司他处理后，血清NO和TAC水平显著升高，vWF浓度和H₂O.₂水平下降。这些结果表明去除h₂O.₂和o.₂^⋅-为了阻止ROS生产可以缓解内皮损伤，进一步证明HUA和Ang II诱导内皮细胞中的氧化应激损伤，并且AR在该过程中发挥作用。然而，我们发现三种药物没有提供肾功能的益处，尤其是动物的面包水平比MS / UA动物的增加更多。可能的原因可能是在持续时间内过量的药物，动物仅在2周内处理。因此，在进一步的研究中，我们需要减少药物剂量并延长治疗期，然后观察更新的效果。

综上所述，这些结果为预防和治疗多发性硬化症提供了一个新的临床靶点。

5.结论

与MS相结合的高尿酸可以加剧Ang II引起的内皮损伤。阻止AR途径或扫除o₂^⋅-和H.₂O.₂可能保护内皮功能。这些作用将为预防和治疗多发性硬化症和高尿酸血症患者内皮损伤提供理论依据。

数据可用性

支持本研究发现的数据可从通讯作者WD获得，应合理要求。

的利益冲突

提交人声明他们没有竞争的财力利益。

作者的贡献

Quan Hong和Liyuan Wang贡献了这项工作。

致谢

这项工作是由中国国家自然科学基金（编号81870491和81670694）的支持，中国解放军总医院国家的培养基金杰出青年科学基金（2019-JQPY-002），国家重点研究发展计划（2018YFE0126600），和北京的科技项目，中国（Z191100006619001）。

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