雄性自发性高血压(月)老鼠从北京获得至关重要的河实验动物科技有限公司有限公司(中国,北京)大约10周的年龄。实验协议是机构批准的动物保健和使用委员会中国人民解放军总医院。同时所有的动物都被安置在单独的不锈钢丝的笼子里,控制温度(22°C到24°C)和相对湿度(40 - 50%)和维护逆12小时的黑暗与光明循环。

所有动物最初提供高脂大鼠食物1周,保持饮食。食物和水都是随意吃。老鼠被随机分为5组6老鼠。MS组消耗的食物随意;华集团管理的女士oxonic酸(250毫克公斤¹d¹)和UA(250毫克公斤¹d¹连续10天)通过腹腔内注射;过氧化氢酶组(HUA +过氧化氢酶)收到12个kU公斤¹d¹过氧化氢酶(美国σ)通过腹腔内注射;SOD组(HUA +聚乙二醇共价与超氧化物歧化酶(PEG-SOD))收到2×10⁴U公斤¹d¹美国PEG-SOD(σ)通过肌肉注射;和epalrestat组100毫克公斤¹d¹epalrestat(长江制药集团、江苏、中国)通过灌溉。第十天,动物管理组成戊巴比妥钠腹腔麻醉(40毫克/公斤),和血、尿和肾组织收集。

HUVECs买来YRbio(猫# NC006,长沙,中国)和培养rpmi - 1640年媒体补充10%胎牛血清(的边后卫)37°C湿润孵化器有限公司5%₂的气氛。美国UA的最终浓度(σ)和Ang II(美国σ)中600 μmol / L和 1 × 10 − 7 分别mol / L。细胞被华刺激或Angⅱ24 h,然后,上层清液或蛋白质测定收获。没有化验,介质被杜尔贝科取代修改鹰的介质(DMEM)。

之前用化学品或治疗UA,媒介是DMEM所取代。动物的文化上层清液或血清离心机,不接受使用一氧化氮水平评价分析工具(Applygen技术,中国)根据制造商的指示。端点化合物没有₂^{- - - - - -}( 7]。

中引用的ROS试验使用一项研究[ 7]。细胞被播种到35毫米共焦菜(盖玻片),分为控制,华,Angⅱ、华+ Angⅱ组。24小时后,细胞被孵化总氧化应激指标chloromethyl导数dichlorodihydrofluorescein二乙酸(CM-H₂DCFDA、Beyotime、南京中国,5 μM)为在黑暗中30分钟37°C。与PBS三洗后,绿色荧光可视化使用激光扫描共焦显微镜(FV1000,奥林巴斯、东京、日本)的激发波长488 nm和发射波长515 nm)。细胞内活性氧的检测组件进行如下。对啊₂^⋅−细胞被孵化,4 μmol / L Mito-SOX红(英杰公司)在黑暗中37°C 10分钟,观察和红色荧光的激发波长510 nm和发射波长580 nm)。对H₂O₂细胞被孵化,30岁 μmol / L BES-H₂O₂(中国)Seebio在黑暗中在37°C 1 h,并观察绿色荧光的激发波长485 nm和发射波长515 nm)。为^⋅与100年哦,细胞被孵化 μmol / L proxyl fluorescamine(英杰公司)在黑暗中30分钟37°C,并观察绿色荧光的激发波长488 nm和发射波长520 nm)。为¹O₂,细胞孵化20 μmol / L trans-1 - (2 ′ -methoxyvinyl)芘(英杰公司)在黑暗中37°C 10分钟,观察和蓝色荧光的激发波长405 nm和发射波长460 nm)。对于ONOO^{- - - - - -}细胞被孵化,10 μmol / L dihydrorhodamine 123 (Santa Cruz)在黑暗中37°C为30分钟,并观察绿色荧光的激发波长488 nm和发射波长520 nm)。

为西方墨点法( 7),蛋白质提取使用里帕从组织或细胞裂解缓冲(50 mM Tris-HCl, pH值7.5,150毫米氯化钠,脱氧胆酸盐0.5%,1%诺乃清洁剂p 40, 0.1% SDS, 1毫米PMSF和蛋白酶鸡尾酒1 μg / mL)。蛋白质浓度测定用BCA试剂盒(皮尔斯)。蛋白质样品(50 μg每车道)12% sds - page分离和转移到硝化纤维素(NC)膜。一夜之间,膜被孵化在4°C 5%脱脂牛奶其次是孵化主要抗体,anti-eNOS p-eNOS^ser1177(美国圣克鲁斯生物技术)和Nox2 Nox4(细胞信号技术、马、美国); β肌动蛋白(美国Abcam)作为内部控制。免疫反应性的乐队是可视化使用ECL试剂(圣克鲁斯生物技术、美国)根据制造商的指示。蛋白质带强度量化使用数量一个软件(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。

血清H₂O₂使用过氧化氢水平的动物是化验分析设备(NJJCbio、南京、中国)检查最终产品,Mn^{2 +}。动物的TAC是化验使用铁降低抗氧化能力(收紧)方法与商业工具(Beyotime生物技术研究所、南京、中国)。

支流HUVECs饿死在无血清培养基补充1% BSA 4 h,然后孵化和II或华24 h。中收集,其余细胞细胞溶解来确定总vWF的水平。相对大量的VWF使用血管性血友病因子测定酶联免疫试剂盒(美国表达载体)。基底和刺激释放了vWF总数的比例存在于细胞。同样的,动物的血清vWF水平与商业酶联免疫试剂盒化验(无锡Donglin Sci和科技发展有限公司,有限公司,中国),提出了量化ng / mL。ET1在动物细胞中或血清测定使用ET1酶联免疫试剂盒(Elabscience,中国)遵循指令。

为了分析NADPH氧化酶活性,细胞是细胞溶解Hepengbio裂解缓冲和准备试验协议Hepengbio有限公司提供的指导,中国。总氮的活动与U /计算和显示 μg蛋白。

腹腔内葡萄糖耐量试验(ipGTT)执行当动物被4个月或1岁。这些动物腹腔内注射30% ( w / v )葡萄糖溶液(2 g葡萄糖/公斤体重)在一夜之间迅速。血样从削减的尾巴立即和10之前,30岁,60岁,120分钟后血糖管理。血糖浓度测量与测试试剂条(ExacTech w;美国百特Travenol鹿田,IL)。血清免疫反应性的胰岛素浓度测量与放射免疫检定法(胰岛素RIA工具;Pharmacia-Upjohn诊断,乌普萨拉,瑞典)大鼠胰岛素标准(Novo研究所、Bagsvaerd、丹麦)。

所有数据都表示为 的意思是 ± SD 。意思是比较在多个组由单向方差分析(方差分析)使用SPSS 14.0软件。比较两组之间的手段进行了使用随机对照 t 测试。一个 p 值< 0.05被认为是具有统计学意义。

确认华和Angⅱ导致内皮损伤,我们测量没有HUVECs后的细胞培养基处理600 μmol / L或10⁷mol / L Angⅱ24 h。没有控制在正常水平相比,没有水平显著降低在华和Angⅱ组( p < 0.05 ,图 1(一))。此外,没有华+ Angⅱ组显著低于在华和Angⅱ组( p < 0.05 ,图 1(一))。此外,加磷eNOS-ser1177华和Ang II组蛋白质水平显著下调,在对照组相比,和以挪士水平华+ Angⅱ组明显低于华和Angⅱ组( p < 0.05 ,图 1 (b)),符合显著降低没有华+ Angⅱ组水平。同样,我们检测内皮细胞损伤标记vWF ET1浓度细胞补充;数据显示vWF ET1的华和Angⅱ组相比明显增加正常控制;特别是,他们华+ Angⅱ组明显高于华和Angⅱ组(数字 1 (c)和 1 (d))。之前的研究番茄花可能调节内皮细胞炎症 10];因此,我们测量炎症介质il - 1 β和地震-浓度细胞补充;数据显示il - 1 β和在华的地震,Angⅱ组相比明显增加正常控制;特别是,他们华+ Angⅱ组明显高于华和Angⅱ组(数字 1 (e)和 1 (f))。综上所述,我们的数据表明,华有效会损害内皮细胞和行为分析和二世。

ROS是必不可少的有机体,但不断积累ROS可以破坏细胞内蛋白质,脂类,细胞核和线粒体DNA。四个主要细胞ROS组件是O₂^⋅-,^⋅哦,¹O₂,和H₂O₂,所有这些可以互换 15- - - - - - 19]。ONOO^{- - - - - -}不是一个细胞ROS组件但没有和O的反应产物吗₂^⋅−。我们测量的总细胞内ROS水平及其组件使用不同的探针通过共焦显微镜(图 2)。与对照组的水平相比,总ROS, H₂O₂阿,₂^⋅-,^⋅哦,ONOO^{- - - - - -}Angⅱ水平华,华+ Angⅱ组(增加 p < 0.05 )。没有区别在华之间的总ROS水平+ Angⅱ组和华或Angⅱ组( p > 0.05 )。然而,H₂O₂和^⋅华哦水平+ Angⅱ组显著高于华或Angⅱ组( p < 0.05 和 p < 0.01 分别)。此外,阿₂^⋅−在华+ Ang II组显著高于华集团( p < 0.05 ),但类似于Angⅱ组( p > 0.05 )。与正常对照组的水平相比,¹O₂水平降低在华集团( p < 0.05 ),但增加了Angⅱ组( p < 0.05 )。的¹O₂在华+ Ang II组低于Angⅱ组( p < 0.05 ),但没有观察之间的区别¹O₂水平在华与华+ Angⅱ组( p > 0.05 )。因此,这些数据表明,华和Angⅱ加剧生产总细胞内ROS和胞内H₂O₂阿,₂^⋅-,^⋅哦,ONOO^{- - - - - -}和促进氧化应激。然而,UA可以部分清除¹O₂。

NADPH氧化酶(NOX)是一个良好的酶产生高水平的超氧化物和二级氧化剂( 20.]。因此,我们发现两个常见的氮氧化物,NOX2和NOX4诱导的内皮细胞损伤华或Angⅱ。结果表明NOX4华或Angⅱ组蛋白和活动增加(图 3)。特别是,他们显著增加在华+ Angⅱ组相比,那些在华或Angⅱ组。然而,没有明显的变化NOX2蛋白质水平和活动在每组中。它表明华可以促进内皮细胞损伤引起的Angⅱ通过NOX4 upregulation和生产过剩的活性氧。

我们构造了一个女士模型使用月吃高脂肪食物的老鼠。数据 4(一)和 4 (b)表明,动物的体重和血压随着年龄增加。成年老鼠的血压稳定。这些动物服用oxonic酸和UA诱导高尿酸血和管理PEG-SOD,过氧化氢酶,epalrestat。

治疗2周后,体重下降,但各组之间没有发现显著差异。与基线水平相比,血清甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(低密度脂蛋白),每组和血糖(BG)水平显著增加( p < 0.05 );然而,各组之间没有发现差异。血清总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl - c)水平的每组治疗后增加但没有显著不同于对方。浓度比血清UA的女士动物血清UA华+的浓度过氧化氢酶,华+ PGE-SOD,华+ epalrestat组显著增加( p < 0.05 )(表 1和 2)。与此同时,我们检测腹腔内葡萄糖耐量和在动物治疗后血清Angⅱ的浓度;结果显示没有差异IGTT组(图 4 (c));血清和二世华动物模型水平显著增加,但过氧化氢酶,PEG-SOD, epalrestat没有减少Angⅱ的浓度(图 4 (d))。

女士动物的水平相比,血清没有水平和TAC华组显著减少,和H₂O₂水平和内皮损伤标记vWF和ET1浓度增加( p < 0.05 )。HUA-treated动物的水平相比,血清中没有水平和TAC华+过氧化氢酶,华+ PEG-SOD,和华+ epalrestat组显著增加,和H₂O₂水平和vWF ET1浓度下降( p < 0.05 )(图 5)。