提高伤口愈合——TNFAIP3-Interacting Inflammasome-Associated基因表达蛋白1 - (TNIP1)缺乏HaCaT角质细胞相似Reepithelialization减少

文摘

TNIP1蛋白是广泛表达,细胞质等炎症信号由膜受体抑制剂通常承认其为和有关分子模式(pamp和抑制)。缺角化细胞TNIP1糖分会让细胞pamp并抑制促进反应过度表达和分泌细胞因子标记(例如,引发和il - 6)与慢性炎症的情况下,如牛皮癣,TNIP1缺乏报道。在这里,我们审查的影响TNIP1缺陷基因表达和细胞反应(迁移和可行性)与急性炎症通常发生在伤口愈合。使用siRNA-mediated TNIP1表达式击倒在培养HaCaT角质细胞,我们调查TNIP1缺乏对信号的影响的下游TLR3激动与低浓度聚(我:C),代表PAMP时/潮湿。TNIP1击倒和PAMP时/潮湿的组合信号中断的表达特定的角化细胞分化标记(例如,转谷氨酰胺酶1和involucrin)。这些相同的条件下提升协同表达的增加wound-associated标记(如S100A8, TGFβ和CCN2)表明潜在的好处增加炎症反应减少TNIP1蛋白质。出乎意料,保利(我:C)的挑战限制reepithelialization TNIP1-deficient细胞和细胞生存能力的降低。在这些细胞中,不仅增加了与inflammasome组装相关的基因表达(如ASC, procaspase 1)也为表达A20, TNIP1伙伴蛋白质压制细胞死亡信号。尽管这样可能增加补偿A20 mRNA, phospho-A20蛋白质减少,所需的形式淬火炎症。高反应性聚(我:C)在TNIP1-deficient角质细胞是通过p38和物通路部分介导的。综上所述,我们得出这样的结论:TNIP1缺乏促进增强表达促进伤口愈合的相关因素。然而,耦合,增加inflammasome的潜在启动和减少补偿活动表达A20净负影响整体细胞复苏潜力体现reepithelialization差和生存能力。这些发现表明一个以前从未发现过的角色TNIP1蛋白质限制炎症在成功通过早期伤口愈合阶段发展。

1。介绍

表皮角化细胞不断暴露于模式识别分子从当地微生物残骸释放轻伤,或自发的因素从细胞器破裂在终端分化(角化)1]。单独在一起,这些有关分子模式(抑制)和其分子模式(pamp)有可能触发一个先天免疫反应和破坏性,可能cell-lethal,炎症级联(1,2]。因此,表皮角化细胞必须有能力限制的影响这些低级维持或煽动者,在发生大规模创伤或感染,恢复一个immunoquiescent状态。

肿瘤坏死因子α全身蛋白质3-interacting 1 (TNIP1)是-调制器的胞质炎症信号下游几个细胞膜受体。TNIP1,或者叫氟化钠、货车和ABIN-1, (3- - - - - -5)表达在多种上皮和nonepithelial组织培养细胞来源于他们(6,7]。TNIP1限制细胞质TLR信号发展下游,TNF-R和egf - r,从而保护细胞免受不合时宜的NF -κIRF3 - B -, ERK-mediated转录(见[4,8]审查)。表达在多种细胞和组织类型的研究已经证明实验推导TNIP1不足或敲除启动和/或增强炎性表型(9- - - - - -13],通常概括病态著称的复发或慢性免疫激活。鉴于人类疾病如牛皮癣、红斑狼疮、硬皮病(12,14,15)与TNIP1蛋白质水平降低有关,而不是表达空,我们模仿细胞缺乏TNIP1蛋白质和他们的反应限制数量的可能遇到细胞膜受体信号分子来评估可能的协同效应的两个条件。我们之前报道13],许多炎症趋化因子、细胞因子和相关受体优先表达TNIP1-deficient HaCaT角质细胞toll样受体激动剂含量较低的挑战,细菌脂蛋白FSL-1或合成双链RNA多聚(我:C) (polyinosinic-polycytidylic酸),比控制条件和这些细胞只有TNIP1击倒或toll样受体激动剂接触。这表明,表皮角化细胞可能特别敏感TNIP1缺乏当遇到pamp和抑制局部微生物或经历tissue-damaging创伤。

这里,我们问TNIP1缺乏HaCaT角质细胞会影响基因表达和reepithelialization与伤口愈合有关,包括瞬态和经常重叠的炎症和增殖阶段。我们挑战控制和TNIP1-deficient HaCaT角质细胞和1μg / mL保利(我:C)浓度,促进TLR3独自活动,但不引起最大炎症信号反应与双重TNIP1不足和保利(我:C)接触13]。这TLR3受体激动剂模型微生物pamp由于局部感染以及细胞抑制释放损伤与伤口开始(16,17]。TNIP1缺乏减少几keratinocyte-specific标记的表达。相比之下,有重要和经常大大增加与细胞损伤信号相关的成绩单,抗菌反应,epithelial-to-mesenchymal过渡,inflammasome组件和伤口愈合。在细胞水平上,这些反应导致生存能力和减少reepithelization减少。我们得出这样的结论:实验TNIP1缺乏症,并联,在不同的病理,hypersensitizes细胞否则阈下水平的抑制/ pamp,加剧了胞内炎症信号伤口恢复的损害。反过来,这可能启动或加强基因表达的结果,可能会限制宽容与皮肤接触微生物,缓慢的复苏从轻微损坏事件,和/或导致慢性伤口或纤维化。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和治疗

HaCaT角质细胞、自发永生化nontumorigenic线(18),是培养如前所述[13]。HaCaT的角化细胞线已经被广泛用于人类角化细胞炎症通路信号模型,细胞因子生产,reepithelialization [19- - - - - -26]。TNIP1-targeting核或不属预定目标的消极控制核被用来使转染HaCaT角化细胞(一式三份井镀如下:6-well, 480000细胞/;12-well, 160000个细胞/;24-well, 80000个细胞/ 24 hr postplating)。小干扰rna(100海里SMARTpool TNIP1最终浓度)或不属预定目标的核(通用电气Dharmacon,拉斐特有限公司)在媒体Opti-MEM血清(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)是用于与DharmaFECT2转染试剂。TLR3配位聚(我:C) 1μ克/毫升(或nuclease-free H₂O车辆控制)添加到细胞在无血清培养基48小时post-siRNA转染,无血清培养系统,包括一个24小时休息期间立即前的兴奋剂。保利(我:C)暴露时间,参见图传说。抑制剂研究细胞孵化与MAPK p38抑制剂SB203580 10点μ圣地亚哥(InvivoGen CA),物抑制剂SP600125 30μ圣地亚哥(InvivoGen CA),或DMSO(车辆控制,最终浓度0.05%)前2小时立即添加聚(我:C)。细胞被收集在0、6、12或24小时里帕裂解缓冲(10毫米三,150毫米氯化钠,脱氧胆酸1%,1% Triton,和0.1%十二烷基硫酸钠)与罗氏公司完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏生命科学,印第安纳波利斯)和蛋白质磷酸酶抑制剂原钒酸钠(2毫米和50毫米氟化钠)或RNA RLT裂解缓冲(试剂盒、希尔登,德国)蛋白质和RNA分离,分别。

2.2。定量实时聚合酶链反应(存在)

RNA提取使用RNeasy(试剂盒),直接与细胞细胞溶解在RLT缓冲区立即使用或存储在-20°C。孤立的RNA是量化使用NanoDrop Microvolume分光光度计(热费希尔科学)。互补脱氧核糖核酸生成使用高容量cDNA工具包(应用生物系统公司,培育城市,CA),从20稀释μL 120年第四卷μl基因扩增都使用了应用生物系统公司7500年拥有0.4的快速实时PCR系统μ米的正向和反向引物(补充表1),2μL稀释的互补。核糖体蛋白L13a (RPL13a)由δCt用于标准化在分析方法。循环条件如下:95°C,持续20秒 。Ct阈值被设定为 周期。

2.3。存在微阵列

基因表达分析与人类伤口愈合PCR数组(试剂盒,猫没有:多环芳烃- 121 - z),互补脱氧核糖核酸是使用RT2第一链生成工具(试剂盒)RNA样本TNIP1和不属预定目标的siRNA-transfected细胞收集6小时post-poly(我:C)治疗中描述细胞培养和治疗。SABiosciences PCR阵列软件被用于分析基因表达数据的δCt方法与RPLP0正常化后。Ct截止是 。

2.4。西方的屁股

蛋白质浓度从里帕缓冲区溶解产物上层的决心使用皮尔斯修改Lowry分析(热费希尔科学)。澄清上层清液结合5 x Laemmli示例缓冲区(0.3125 Tris-HCl pH值6.8,10% SDS、50%甘油、0.005%溴酚蓝,和10%β巯基乙醇)最终1 x立即使用或存储在-80°C。16.5后解决μ每道克蛋白质10%聚丙烯酰胺凝胶,蛋白被转移到一个绘画纸Protran硝化纤维素膜(通用电气医疗集团生命科学、马尔堡,MA)。膜被封锁5%脱脂牛奶(或5% BSA当检测磷酸化蛋白质)溶液与0.05% Tween-20 Tris-buffered盐水(TBS-T) 1小时前添加和孵化主要抗体在一夜之间在4°C。抗体使用包括β肌动蛋白1:5000稀释(细胞信号技术,丹弗斯、马、猫没有:4967年代),A20 / TNFAIP3 1: 1000稀释(细胞信号技术,猫没有:5630年代),Phospho-A20 (Ser381) 1: 1000稀释(细胞信号技术,猫没有:63523年代),和TNIP1 1: 1000稀释6]。与TBS-T洗涤后,屁股被孵化与HRP-conjugated二级抗体1:5000稀释(热费希尔科学,猫没有:31460)在室温下2小时。蛋白质是可视化使用化学发光底物(热费希尔科学)柯达IS400CF CCD成像仪(柯达,罗彻斯特,纽约)。微使用Carestream分子成像软件进行评估。背景减法之前所有乐队是个人背景区域归一化β肌动蛋白。

2.5。划痕试验和融合的测量

HaCaT角质细胞被设置为每个条件12-well盘子一式三份,转染如上(细胞培养和治疗),在媒体标准维持24小时,然后转向血清媒体的另一个24小时期间达到融合。“伤口”成立于HaCaT单层膜(25,26)通过拖动的无菌黄色微量吸液管尖在中心。后立即执行,细胞被洗两次与PBS之外无血清培养系统(0)媒体与保利(我:C) 1μg / mL或nuclease-free H₂O为24小时车辆控制。Reepithelialization为每个条件监控15图像沿划痕长度,每一式三份,用10倍目标与现货4.5.9.12 Eclipse TS100尼康显微镜软件和洞察力的数码相机。分析剩余的“伤口”地区使用TScratch软件(27]。执行分析的细胞融合使用PHANTAST软件(28]。

2.6。细胞生存能力分析(MTS)

HaCaT角质细胞镀在96孔板~ 40 - 50%融合。TNIP1不足被诱导细胞培养和治疗。细胞生存能力评估使用CellTiter 96水一个解细胞增殖试验(MTS) (Promega,麦迪逊,WI)按照制造商的指示。吸光度(490海里)测量SpectraMax 190标(分子设备,圣何塞,CA)。

2.7。ELISA

与离心收集细胞培养基和澄清300×g在4°C;样本立即整除,储存在-80°C。使用abt CCN2 ELISA进行ELISA缓冲工具包(PeproTech落基山,新泽西)和人工CTGF(即。,CCN2) Mini ABTS ELISA Development Kit (PeproTech, cat no: 900-M317), as per the manufacturer’s instructions.

2.8。统计分析

统计分析了使用GraphPad棱镜(第7版)与结果呈现的意思是平均数标准误差(SEM)。学生的 - - - - - -测试或双向方差分析后跟Bonferroni或图基的事后分析时使用执行特定的成对比较或对比的条件下,分别。结果被描述为之前建议(29日,30.]。一个值≤0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。TNIP1不足影响全身的保利(我:C)基因表达的变化与角化细胞的分化和激活有关

变异和实验生成TNIP1蛋白质水平变化表示的镇压在表皮和其他组织慢性炎症信号(见[4,8,12,31日]审查)。TNIP1-deficient表皮角质化细胞反应toll样受体激动剂生产的趋化因子和细胞因子(13,32]。增加细胞因子表达通常是与角化细胞激活状态(33- - - - - -35在瞬时和永久成功的治疗和疾病相关的炎症旷日持久的伤口,分别。角化细胞激活是触发,由物理创伤或可溶性因子,进行大量的基因表达变化导致特异性蛋白质的变更(例如,角蛋白)以及生产范围广泛的细胞因子/趋化因子参与到当地的炎症信号传播可能反过来影响当地细胞复制,迁移,细胞外基质重塑,在组织,免疫细胞招聘(36- - - - - -38]。

探针TNIP1函数以及它如何可能与急性炎症和角化细胞激活,我们生成一个实验模型的不足的小干扰rna转染TNIP1-targeting HaCaT角质细胞和检查一系列细胞后果来响应TLR激动(补充图(1))。相比控制细胞接收不属预定目标的siRNA TNIP1蛋白质降低了75%和70%在48小时和72小时posttransfection,分别为(补充数据1 (b)和(c)),在TNIP1 siRNA集。

更好的定义的状态TNIP1-deficient HaCaT角质细胞相比,不属预定目标的siRNA-transfected细胞在车辆和TLR agonist-challenged条件下,我们确定记录的相对水平与特征相关的角化细胞阶段逐步成熟。控制和TNIP1-deficient HaCaT角质细胞暴露在潮湿/ PAMP时聚(我:C), TLR3配体和dsRNA模仿。使用qPCR分析,我们确定TNIP1不足,HaCaT角化细胞基底层标记的表达角蛋白5和14(分别K5和K14)出现影响车辆或聚(我:C)条件下(图1底下一行)。对于ITGA3,α3合作伙伴整合素受体的基膜蛋白层粘连蛋白,有显著~ 3年来信使rna从保利(我:C)增加暴露在不属预定目标的匹配和TNIP1-deficient细胞。

转K6和K16与角化细胞活化相关影响迁移,呈请并可能参与炎症反应(39]。我们发现,聚(我:C)基因表达显著刺激K6A和K16控制siRNA角质细胞。TNIP1缺乏进一步加强这种保利(我:C)效应对K6A但不是K16或K6B / C。成对的K1和K10 suprabasal标记,K1 TNIP1-deficient保利(我:C)细胞减少而不属预定目标的siRNA-transfected细胞在车辆的条件下;K10表达不受影响。Involucrin成绩单显著减少~ 2倍TNIP1不足,进一步减少的趋势在保利(我:C)治疗TNIP1-deficient细胞。分化标记transglutaminase-1 (TGM1)转录水平是大大增加了~ 20倍与聚(我:C)单独而TNIP1 agonist-induced反应缺陷大大限制。晚期分化标记栏目和loricrin仍然几乎不变保利(我:C)接触或者TNIP1击倒一个例外的~ 2倍增加loricrin成绩单上双重TNIP1不足和聚(我:C)刺激。其中后两个标记,而在使用中存在参数(见可靠地检测到材料和方法),可能代表一个小群后期differentiation-competent细胞相对于更丰富middifferentiation阶段细胞显示丰富的成绩单等早期标志物suprabasal K1和K10(补充图2)。因此,虽然表达的特征角化细胞标记也受到TNIP1缺乏单独或TNIP1不足影响聚反应(我:C)的挑战,没有单向变化,表明全面增强或限制成熟细胞群。

3.2。TNIP1缺乏促进全身的保利(我:C)基因表达与不同功能与伤口愈合

表皮角化细胞贡献复苏postwounding协同作用的特异性分化蛋白,以及上调表达抗菌肽的能力,炎性细胞因子,组织损伤和修复的因素。在这里,我们发现TNIP1缺乏提升显著增加基因表达与这些经常重叠状态有关。Periostin和钙粘蛋白基因表达通常伤口愈合的变化仍不受TNIP1不足或聚(我:C)接触(图2(一));然而,对于这些组合条件下,有periostin和钙粘蛋白表达明显增加,分别为6 - 4倍。调查其他变化TNIP1不足可能促进,我们评估TGF的表情β和EMT-promoting SNAI2(即。蛞蝓)(40),发现上面显著增加了全身的保利(我:C)下重要的表达双重TNIP1不足和TLR3激动(图2(a))。类似的表达谱观察抗菌基因S100A8和A9,保利(我:C)刺激的TNIP1-deficient角质细胞提升4 - 2倍增加,分别比保利(我:C)单独处理细胞。IL-20,控制HaCaT角化细胞增殖(41),增加由于保利(我:C)刺激与进一步加强TNIP1缺乏症。CXCR1(即。,IL-8 receptor) was measured at 40-fold greater gene expression with TNIP1 deficiency and poly (I:C), relative to untreated keratinocytes, with an ~8-fold increase as compared to poly (I:C) alone. IL-36γ有效的诱导物的角化细胞激活(42),翻了一番了保利(我:C)和TNIP1不足,相比已经显著变化从保利(我:C)治疗细胞。CCN2 profibrotic因素是显著调节在角化细胞参与伤口愈合43]。组成型表达低CCN2 mRNA和蛋白水平的控制HaCaT细胞(不属预定目标的核;车辆)是影响独立的TNIP1击倒或暴露在低浓度聚(我:C)。然而,有一个~ CCN2 mRNA和增加10倍~ 4倍增加分泌CCN2蛋白质对细胞会经历TNIP1不足和挑战与低剂量聚(我:C)(数据2(b)和2(c))。综上所述,这些记录按照总的趋势增强表达的基因与伤口愈合(增殖、迁徙和抗菌标记)保利(我:C)刺激TNIP1-deficient除了细胞分化和炎症细胞显示广泛的后果。

3.3。TNIP1缺乏在保利(我:C)接触促进伤口的微分表达式Healing-Associated体外Reepithelialization基因和限制

伤口愈合在上皮细胞由进步和通常的重叠阶段炎症、增生/迁移,ECM沉积,和组织重建44在这有特征的基因表达的变化。通过RT-qPCR伤口healing-associated基因表达的差异进行评估,比较TNIP1-deficient细胞与那些内生TNIP1水平应对保利(我:C)(表1)。TNIP1-deficient角质细胞的挑战与聚(我:C)显示促炎反应基因的表达增加(例如,肿瘤坏死因子α、CXCL11和il - 6)和增加抗炎细胞因子il - 10 (45TGF)和生长因素α。后者的感应在角化细胞激活是由于不同的刺激(46]。在keratinocyte-specific整合蛋白检测,只有整合素α5达到标准≥2倍增加截止。然而,α5个伙伴β1,α3、另一个β1伙伴,分别增加~ 50 - 60%(见附加图3评估基因的完整数组)。

引人注目的是,几个转录的蛋白质是积极的还是消极的参与ECM重塑(表1)增加保利(我:C)挑战TNIP1-deficient HaCaT角质细胞。例如,SERPINE1(~ 9.4倍增加)编码纤溶酶原激活物抑制剂1 (PAI-1)的主要抑制剂尿激酶纤溶酶原激活物(PLAU) ~ 2倍增加。此外,PLAUR PLAU的受体,增加~ 3.3倍。组织因子F3,凝血因子III(别名),增加~ 2.5倍;外面参与信号转导等凝血的炎症和细胞迁移47]。并不是所有ECM-remodeling酶在数组普遍增加了应对保利(我:C)的挑战TNIP1-deficient HaCaT角质细胞。矩阵metallopeptidase (MMP) 1、MMP2和MMP9两组中有类似的表达式(补充图3)。ECM-related酶MMP7记录,组织蛋白酶(CTSK)和凝固因子十三亚基(F13A1)减少~ 4倍或者更多保利(我:C)挑战TNIP1-deficient HaCaT角质细胞也分享了2-3-fold CXCL2 promigration下降因素,CXCL5, CCL2。因此,与其他教唆犯的角化细胞激活,如表皮生长因子(46),同时诱导基因在保利(我:C)暴露TNIP1-deficient HaCaT角质细胞,促进或限制伤口愈合。

测试TNIP1 reepithelialization期间的影响,我们使用了一个体外伤口模型(25,26)和支流HaCaT角质细胞的条件下正常(不属预定目标的siRNA)或缺乏TNIP1 (TNIP1 siRNA)蛋白质含量(数字3(一个)和3 (b))。细胞减少TNIP1车辆条件下蛋白质有划痕区域恢复类似TNIP1蛋白质的正常水平。细胞在这后一种情况往往是更好的在reepithelialization保利(我:C)的存在。相比之下,TNIP1-deficient HaCaT在存在聚(我:C)显示不仅减少划痕区域的补充,进一步扩大的剥蚀区(增加伤口面积百分比)。车辆(即条件。,no poly (I:C)), cell density behind the scratch was confluent right up to the wound edge for the nontargeting and TNIP1 siRNA groups. However, paralleling expansion of the wound area seen with TNIP1 deficiency and poly (I:C) exposure, there was a significant decrease in cell confluence (Supplementary Figures4 (a)和(b)相对于不属预定目标的siRNA)和聚(我:C)在24小时。在不同的实验制作完整HaCaT层(nonwounded) post-TNIP1击倒和聚(我:C)曝光,我们评估文化的生存能力。内聚(我:C)集,TNIP1缺乏提升生存能力明显下降(图3 (c))。这些划痕和可行性结果表明TNIP1-deficient角质细胞在上皮细胞受损伤口愈合表现不佳,尽管一些基因表达的增加产品组织作出积极贡献,复苏。

3.4。TNIP1缺乏促进Propyroptotic基因转录表达增加

表达inflammasome组件,调解促炎的程序性细胞死亡形式的关键(48)被称为pyroptosis,据报道下游的角化细胞暴露于高聚(我:C)浓度(49]。我们测试的可能性的反应相似,但保利(我:C)较低浓度使用这里的影响似乎缺TNIP1放大了。TNIP1-deficient,保利(我:C)治疗HaCaT角质细胞显著增加记录了nucleotide-binding寡聚化域受体蛋白(NLRP NLRP1)和10(图4)。相比之下,低浓度聚(我:C)单独接触没有促进这两个基因转录增加目标,而车辆控制单元。记录潜在inflammasome组件,NLRC4 NLRP3,后者通常与dsRNA传感有关,没有检测到(没有显示)。然而,表达相关的功能没有黑色素瘤2 (AIM2)显著增加保利(我:C)和进一步显著增加供TNIP1缺乏这个条件。有趣的是,对于凋亡speck-like蛋白质包含卡域(ASC),一个适配器蛋白质NLR蛋白质、基因表达是最大化相似水平(~ 8.5倍增加)仅靠TNIP1缺乏无论保利(我:C)曝光。caspase-1, inflammasome所需酶处理,与保利(我:C)诱导治疗TNIP1控制角化细胞诱导TNIP1-deficient细胞中~高100%。表达caspase-1基质的地震和gasdermin D,但不是il - 1β,共同表达的增加由于TNIP1缺乏保利(我:C)治疗细胞。因此,与炎症和其他几个细胞损伤反应或伤口愈合目标基因(图的反应2和表1),有增强作用的几个propyroptosis TNIP1-deficient细胞基因。

3.5。减少发生磷酸化表达A20 TNIP1缺乏症在保利(我:C)挑战细胞

A20转录正受NF -κB (50,51]。在蛋白质水平表达A20促进的一些炎症signal-suppressing属性TNIP1虽然可以独立行动在这方面(11]。有鉴于此,我们检查了表达A20 TNIP1-deficient水平尤其感兴趣,保利(我:C)接触细胞诱导的几个NF -κB-regulated基因调节和细胞生存能力降低。TNIP1击倒就没有检测到影响A20 mRNA水平(图5(一个))。然而,TNIP1缺蛋白致敏细胞低浓度聚(我:C),导致几乎三倍A20 mRNA水平相比单独聚(我:C)暴露后6小时。持续暴露在保利(我:C)控制siRNA-transfected细胞增加了表达A20水平TNIP1-deficient不相上下,保利(我:C)治疗细胞。因此,我们研究了其水平24小时post-poly(我:C),一个时间点的增加表达A20 mRNA TNIP1-deficient细胞已经解决的control-transfected细胞(图5(一个))。尽管早些时候更高(6小时)然后相似(12小时、24小时)表达A20 mRNA水平,保利(我:C)暴露TNIP1-deficient细胞有相似的表达A20蛋白质水平。然而,有一个显著减少(~ 50%)的磷酸化A20可能限制其抗炎功能(数据5 (b)5 (d))。

3.6。记录增加下游TNIP1-Deficient TLR3刺激的细胞部分由物和p38

角化细胞活化等膜受体的激动TLR3通过规范(即诱导。NF -κB)和经典之中(即。,JNK and p38) signaling pathways [52- - - - - -54]。TNIP1缺陷(图6(一)导致适度增加本构为引发和il - 6水平记录但TNF的近似的12倍α。只有后者的感应记录显示中介p38和物通路,即。,statistically significant reduction upon inclusion of their inhibitors SB203580 or SP600125, respectively.

TNIP1-deficient细胞处理聚(我:C)(图6小时6(b)) ~ 3.5倍增加引发基因转录/聚(我:C)的孤独。预培养的p38抑制剂显著降低TNIP1 deficiency-dependent夸张的反应,而物抑制没有效果。我们发现p38最小影响il - 6基因表达而抑制物抑制促进减少表达减少的显著诱导基因表达中发现TNIP1-deficient,保利(我:C)治疗细胞。的条件下活性物和p38通路,TNIP1缺乏倾向角化细胞产生TNF ~ 4倍增加α基因转录。p38或物抑制有效途径活性下降导致TNFα表达由于缺TNIP1的综合效应和聚(我:C)曝光。因此,反应TNIP1-deficient下这些目标基因的表达,TLR3受体激动剂条件下,似乎主要是通过p38引发,il - 6的物,肿瘤坏死因子的两种途径α。

4所示。讨论

表皮角化细胞的表面位置以及自己的成熟提供了一个持续的接触微生物,tissue-derived模式识别分子(1]。尽管这种持续的刺激,角质细胞抵抗被炎症慢性反应状态部分像TNIP1 signal-suppressing蛋白质。当被过度的信号(例如,大规模的致病微生物感染和广泛的破坏细胞创伤),角化细胞成为激活细胞(34- - - - - -38]。预测一个必然的结果是在TNIP1不足的情况下,细胞内signal-limiting机械可能不足以停止刺激从低或“背景”水平的抑制/ pamp至少会导致部分激活状态。角质细胞激活的丰富来源不同的趋化因子、细胞因子、抗菌肽、和监管因素(35,46,55]。反过来,他们伤害响应信号传播到邻近的表皮和真皮细胞,如果平衡一个适当的时间导致成功组织复苏,但如果超过和/或不同步会导致慢性伤口(56,57这可能导致pyroptosis [48]。在这个报告中,我们目前的证据表明TNIP1缺乏协调水平较低的聚(我:C),潮湿的模型/ PAMP时,敏化角质细胞建立反应过度的炎症损害reepithelialization和细胞生存能力。TNIP1-deficient HaCaT角质细胞已经改变了几个keratinocyte-specific基因的表达(TGM1、K1和转K6)针对保利(我:C)这可能会干扰他们的防护性能,晚期分化细胞或为有效损伤恢复。此外,一些基因的表达有显著增加(例如,SERPINE PLAUR, PLAU)将促进伤口愈合,但发生的同时增加肿瘤坏死因子α前面展示的表情,严重降低角化细胞生存能力(58]。也有一致的基因表达增加inflammasome蛋白质,酶有关,随着促炎细胞因子和基质。后者的感应(引发、il - 6和TNFα)发生至少部分是通过物——和p38 MAPK-mediated通路。总之,这种反应可能会导致对整体净负面影响伤口愈合可视化为穷人reepithelialization和减少细胞的可行性。

高反应性的一些最引人注目的度被认为在一群基因重叠的生物,例如,EMT,伤口愈合,炎症(图2)尤其是IL-36等因素γ,TGF S100A8和9β,CCN2。我们发现明显协同作用TNIP1蛋白质缺乏症和聚(我:C)曝光的表达这些。尽管这些条件诱导一些EMT-associated基因的表达增加(例如,TGFβ和SNAI2),观察到的钙粘蛋白的增加表明,在最好的情况下这可能是一个部分或完整EMT与伤口愈合有关而不是全部epithelial-to-mesenchymal过渡状态(35,59]。自RNA收集样本相对早期(6小时)保利(我:C)后,我们认识到,这些标记,有可能是第二代信号事件开始增加他们的表情。例如,CCN2表达增加,以应对损伤(43]将由模型模拟湿聚(我:C)以及接触TGF角化细胞β(43]。CCN2可以为整合蛋白上调mRNAα5和β1 (60),两个记录我们看到伤口愈合数组中增加。有趣的是,CCN2表情,像S100A9(图2),增加系统性硬化皮肤的表皮层(61年),纤维化疾病状态与TNIP1 snp在病人的基因组62年)和TNIP1蛋白质缺乏症(15在lesional皮肤。

除了他们的表达变化与伤口修复(63年),群SERPINE(纤溶酶原激活物抑制剂1),PLAUR(纤溶酶原激活物,尿激酶受体),和PLAU(纤溶酶原激活物,尿激酶)调节相比,牛皮癣数量的限制下检测或健康表皮处于非常低的水平64年]。相比HaCaT水平一般的角化细胞TNIP1蛋白质聚(我:C)条件下,TNIP1-deficient细胞暴露于潮湿/ PAMP时增加了以下表达式:SERPINE, ~ 9倍;PLAUR ~三倍;和PLAU ~ 2倍。因此,它是可能的,除了其signal-limiting角色时出现在健康细胞经历背景微生物负担,减少TNIP1,已经报道了银屑病角质细胞(12),可能会加重炎症病变的状态甚至暴露在低水平的微生物或受损的细胞碎片。这些细胞可能会倾向于增加炎症螺旋,我们之前的报道,TNIP1蛋白半衰期是减少炎症条件下(65年]。特别有趣的是这些TNIP1-deficient低潮湿/ PAMP时条件产生了磷酸化表达A20减少,增加表达A20转译后的修改功能和招聘抑制炎症信号(51,66年]。因此,正如最近的发现支持(11,67年),这将是重要的考虑个人和成对的抗炎作用TNIP1 A20和细胞死亡的差异可能由于他们缺乏或功能障碍68年]。

Inflammasomes multiprotein处理复合物NLRs或相关AIM2, ASC,通常半胱天冬酶1当组装导致乳沟pro - il - 1等成熟的形式的白细胞介素β和地震48]。细胞因子释放是通过造孔gasdermin D也有助于整体细胞退化(48]。有趣的是,一个以前的报告4925)有关的角化细胞TLR3激动μg / mL保利(我:C)为24小时IL-36的感应~ 140倍γ信使rna相比,车辆通过pyroptosis控制以及随后的细胞死亡。值得注意的是,在另一项研究[69年),低浓度(1.5μg / mL)可以诱导IL-36γ蛋白质合成和释放。然而,细胞外的积累可检测水平所需的72 - 96年的人力资源和没有明显的细胞死亡的不变LDH释放。在我们的研究中,TNIP1-deficient HaCaT角质细胞暴露于聚(我:C)在时间和dose-limited(6小时;1μg / mL)方式显示IL-36感应不仅增加γNLRP10,地震还NLRP1 ASC, AIM2,半胱天冬酶,gasdermin d符合NLRP1基底在inflammasome表达和不可或缺的作用形成角质细胞激活(70年),我们发现在所有条件下表达但进一步TNIP1不足的双重地位和聚(我:C)曝光。虽然还需要进一步调查成蛋白质的后果,这些基因表达的事件表明,贫困reepithelization TNIP1-deficient, TLR3-stimulated HaCaT角质细胞可能来源于inflammasome装配和pyroptosis。这个解释也符合TNIP1-resisting necroptotic信号与pyroptosis[部分重叠66年]。角化细胞表达基底的水平(70年,71年]inflammasome-related蛋白质(如NLRP1, procaspase, pro-IL-1β和pro-IL-18)显示,这些组件不是绝对的表达依赖于新创启动toll样受体激动剂。尽管通用视图TLR3激动的聚(我:C)有利于伤口愈合(72年),如本报告所示,TNIP1缺似乎已经建立了一个国家的过度反应任何传入TLR-mediated信号导致以前未被认识的负面影响从过度或不平衡响应。虽然ASC的诱导表达TNIP1-deficient HaCaT细胞可能导致这个目的,从其他诱导基因产品的潜在作用,例如,NLRP10,也应考虑。NLRP10有明显的反73年,74年)或促炎(75年,76年调节inflammasome活动的影响,可能具体到不同的细胞类型和/或可用性的合作蛋白质。后者情况是特别有趣的给定NLRP10-TNIP1蛋白质相互作用[77年)导致TNIP1蛋白水平的降低。这加剧了外部炎症信号煽动TNIP1[退化65年)可能会导致细胞细胞死亡的不可避免的恶性循环。

5。结论

TNIP1缺乏并发与低浓度的挑战TLR3兴奋剂导致不平衡和/或过度表达的伤口愈合和减少促炎标记细胞生存能力和进一步的细胞损失scratch-wounded人群。我们得出这样的结论:TNIP1充足有助于建立阈值(可抵抗的)水平潮湿/ PAMP时接触保护细胞免受其他慢性炎症信号甚至从低级暴露在各种环境(细胞碎片、微生物)的线索。TNIP1不足或功能障碍可能会加剧细胞内炎症信号伤口恢复的损害。反过来,这可能启动或加强基因表达的后果,可能会限制宽容与皮肤接触的微生物或康复轻微损坏事件。

缩写

潮湿:	有关分子模式
PAMP时:	其分子模式
TNIP1:	肿瘤坏死因子alpha-induced蛋白质3,互动蛋白质1
NF -κB:	核因子kappa-light-chain激活B细胞的恢复
TLR:	toll样受体
保利(我:C):	Polyinosinic: polycytidylic酸
EMT:	Epithelial-mesenchymal过渡
MMP的:	矩阵metallopeptidase
表皮生长因子:	表皮生长因子
TGF:	转化生长因子
NLRP:	Nucleotide-binding寡聚化域受体蛋白
样子:	肿瘤坏死因子alpha-induced蛋白3 (TNFAIP3)。
肿瘤坏死因子:	肿瘤坏死因子。
物:	C-Jun n端激酶
p38:	p38增殖蛋白激酶

数据可用性

所有数据用于支持本研究的结果包括在本文中。

信息披露

泰勒w . Ackley目前的地址是药房,劳伦斯和纪念医院,蒙托克大街365号,新伦敦CT 06320,美国。资金来源没有参与研究设计、数据解释,报告写作,或者决定提交出版。

的利益冲突

所有作者声明没有冲突。

作者的贡献

BJA和RS设计项目和设计实验。RS执行大部分的贡献在基因表达和伤口愈合的实验研究和分析从两个。所有作者导致数据分析。RS和BJA写道。所有作者编辑、阅读和批准最终的手稿。

确认

这部分工作是支持辉瑞希望通过辉瑞(推进科学研究者研究交换)竞争力的科研补助金(WI206537) (BJA)和从制药科学系的研究生助教奖学金,康涅狄格大学(RS)。RS收到部分的支持2019年罗森博格和科恩研究生奖学金在药理学和毒理学和Khairallah为跨学科的博士论文研究奖学金。作者感谢qPCR thermocycler访问成为可能通过罗杰·斯托尔医药科学基金。

补充材料

补充表1:存在引物。补充图1:(a)转染和治疗时间。(b)代表免疫印迹分析TNIP1蛋白质含量48和72小时posttransfection不属预定目标的核控制(NT)或TNIP1核(Si)。(c)微密度分析西方墨迹与NT正常化之后控制设置为1β肌动蛋白。补充图2:在HaCaTs keratinocyte-associated基因的相对丰度。mRNA表达规范化从正常RPL13a HaCaT角质细胞72小时后镀在~ 40%融合。细胞血清休息前36小时立即集合。补充图3:TNIP1缺乏HaCaT角质细胞促进伤口愈合与角化细胞的基因表达改变。(一)热图中存在数组结果HaCaT角质细胞治疗TLR3受体激动剂聚(我:C) 6小时。褶皱变化计算比较TNIP1 siRNA-treated细胞与控制,针对RPLP0规范化。(b)基因在最高的褶皱变化在数组中。补充图4:TNIP1不足导致损失的细胞融合后24小时暴露在保利(我:C)。(一)代表图像的最初100%汇合的TNIP1-sufficient (NT)或TNIP1-deficient (Si) HaCaT角质细胞24小时post-poly(我:C)曝光。 (b) Quantitation of percentage confluence performed using PHANTAST plugin for ImageJ (FIJI client).(补充材料)

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