柚皮素通过NLRP3和Nrf2/HO-1通路保护小鼠急性胰腺炎

抽象的

背景．柚皮素(Nar)是一种类黄酮，已被证明具有抗炎和抗氧化的特性。然而，Nar对急性胰腺炎(AP)的作用尚未得到充分的研究。本研究旨在探讨Nar在AP小鼠模型中的作用。方法．通过Caerulein（CAE）诱导轻度急性胰腺炎（MAP），并通过小鼠的L-精氨酸诱导重度急性胰腺炎（SAP）。在SAP诱导后，在MAP诱导后，在25,50或100mg / kg的剂量下以25,50或100mg / kg施用NAR给药。确定细胞因子，脂肪酶和淀粉酶的血清水平，并收获胰腺和肺组织。结果．在NAR处理后，两张和SAP模型中，均淀粉酶，脂肪酶和细胞因子的血清水平显着降低。在NAR治疗后，胰腺组织的丙醛（MDA）水平显着降低，两种地图和SAP都会显着降低。相反，在NAR之后，谷胱甘肽过氧化物酶（GPX），谷胱甘肽还原酶（GPX），谷胱甘肽S转移酶（GST），总巯基乙烯（T-SH）和非蛋白质素（NP-SH）显着增加治疗。胰腺氧化酶，点状受体蛋白3和白细胞介素1β的抑制表达以及白细胞介素1β的抑制表达以及核因子红外2相关因子2 /血红素氧酶-1的增强表达，显着提高了胰腺和肺组织的损伤在胰腺组织中。结论．NAR对CAE诱导的地图和L-精氨酸诱导的SAP施加了对小鼠的保护作用，表明NAR可能是AP的潜在治疗介入。

1.介绍

急性胰腺炎(Acute pancreatitis, AP)是一种急性和危及生命的炎症性疾病，通常损害胰腺周围组织和其他远处的器官，导致近25万名住院患者，每年在美国花费约22亿美元[1］．AP的病理生理学特征包括局部胰腺组织损伤，全身炎症反应和多功能障碍。虽然大多数患有AP的患者患有轻度的病程，但患有15％〜25％的严重急性胰腺炎（SAP）的患者发展到受感染的胰腺坏死和持续的器官衰竭[2，主要导致AP死亡率[3.］．了解初始触发事件引起的胰腺缩醛细胞损伤如何进入局部组织损伤甚至全身炎症。由于过度释放炎症因子和增加的氧化应激反应，因此可以引起远处的器官损伤，尤其是急性肺损伤。此外，到目前为止，对急性胰腺炎没有有效的治疗策略。众所周知，AP是一种典型的急性炎症反应疾病，涉及各种炎症细胞因子，激活炎症，氧化应激[4.］．

柚皮素(Nar)是一种类黄酮，是葡萄柚中主要的黄酮。Nar已被证明具有消炎特性和器官保护作用[5.抗氧化功能[6.］．NAR参与调节许多代谢和信号转导途径，例如核因子信号通路[7.］．最近的一项研究表明，柚皮素对脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤具有显著的保护作用[8.］．其他研究表明氧化应激在caerulein (Cae)诱导的急性胰腺炎发病机制中起关键作用[9.那10.］．自由基已被发现参与了由l -精氨酸(L-arg)诱导的SAP坏死类型的发展[11.］．因此，为了探讨NAR在AP中的作用和小鼠的伴随器官功能障碍以及潜在的机制，我们使用了两种动物模型，CAE-诱导的轻度急性胰腺炎（MAP）模型和L-ARG诱导的​​SAP模型．此外，我们在病理状况下检查了胰腺和肺损伤的特征。

2。材料和方法

２.１.动物和饮食

癌症研究所（ICR）背景中的雄性小鼠重量约25-30克，从南京大学的模型动物研究中心购买（南京，中国），并在实验前至少1周适应。将所有小鼠在24℃下在12/12 H光循环下饲养在特定的病原体室内，并可自由进入水和喂养标准实验室。所有的动物程序都是由南京大学的动物护理和使用委员会批准的（20151008号），并根据国家卫生研究院发出的实验动物的护理和使用指南进行。

２.２.实验设计与步骤

在cae诱导的MAP模型中，小鼠随机分为5个亚组( -12每组）如下：对照组，地图模型组，地图+低剂量NAR（25 mg / kg）组，MAP +中剂量NAR（50 mg / kg）组，以及地图+高剂量NAR（100 mg / kg）组。在50岁的剂量下由10个Cae（Anaspec Inc.，Fremont，USA）引起地图。 μ以每小时间隔在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的G / kg体重（BW），并以相同的方式用PBS注射对照组。在NAR组中，NAR（Sigma-Aldrich Chemical Co.，St.Louis，Mo，USA）溶解在5％DMSO中，并立即腹膜内注射。如上所述，在相同的时间点使用相同的车溶液给药地图模型组。

在l -精氨酸诱导的SAP模型中，小鼠随机分为3个亚组( 每个组）如下：控制组，SAP模型组和SAP + NAR（100 mg / kg）组。在PBS以每小时2g / kg bw的剂量为2 kg / kg bw的Pbs诱导8％l-arg（pH = 7.4; sigma-Aldrich Chemical Co.，St.Louis，Mo，USA）诱导的8％L-ARG（pH = 7.4; Sigma-Aldrich Chemical Co.，St.Louis，Mo，USA）诱导。对照组以同样的方式用PBS注射。在NAR（100mg / kg）组中，小鼠在SAP模型诱导后立即接受腹膜内注射，并且在同一时间点在相同体积的载体溶液中施用SAP模型组。

2.3。生物化学测定

在首次注射Cae后0,6,12小时，以及首次l -精氨酸注射后0,24,48和72小时，从七氟醚麻醉小鼠的尾静脉获得血液样本。采用肝素注射器采集血样，在4°C下4000rpm离心10分钟，将上层血浆与下层细胞分离，用于淀粉酶和脂肪酶测定。

使用5个乙烯-G7PNP作为商业套件的基材（北京中生Beikong Biochemistry Company，China），并根据制造商手册使用商业套件（南京江城生物化学公司）测量脂肪酶活性。白细胞介素1β的血浆水平（IL-1β)、白介素6 (IL-6)和肿瘤坏死因子α (TNF-)α）通过酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（Ebioscience，San Diego，CA，USA）确定，根据制造商的手册测定。

2.4。组织学检查

小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉后处死。采集胰腺和肺组织，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋。一小部分胰腺和肺组织使用液氮快速冷冻，在−80°C下保存直到使用。

用苏木精伊红(H&E)对胰腺和肺组织石蜡切片进行染色。两名对实验治疗一无所知的病理学家通过对水肿、炎症和坏死的严重程度进行评分，利用光镜评估胰腺损伤的程度[12.那13.］．我们还通过对中性粒细胞浸润的严重程度、肺泡厚度和肺泡充血的评分来评估肺损伤的程度[14.那15.］．

2．5．免疫荧光检查

石蜡包埋胰腺和肺组织切片(5μm)在二甲苯中再水合，然后用降低浓度的乙醇溶液再在柠檬酸缓冲液(10 mM, pH 6.0)中高温抗原提取20分钟。然后在室温下冷却，用PBS冲洗，用0.3% H处理₂O.₂10分钟以阻断内源性过氧化物酶活性。在PBS中用10％山羊血清白蛋白封闭非特异性结合，在37℃下封闭30分钟。然后将这些载玻片在4℃下在具有兔多克隆抗体抗髓氧化酶（MPO; 1：100稀释）的加湿室中孵育过夜，并在室温下与荧光素标记的二抗（1：200稀释）孵育1小时。在荧光显微镜下观察载玻片，使用Olympus CKX41相机（日本Olympus公司）捕获照片。当评估MPO表达式时，随机选择每个幻灯片的十个字段以分析平均荧光强度。

2.6。胰腺MDA的测定

通过使用硫碱尿酸反应性物质测量MDA来测定胰腺组织脂质过氧化。称量胰组织并在含有丁基羟基甲苯（12.6mmol / L）的磷酸钾缓冲液（50mmol / L，pH7.4）中均化。将匀浆的等分试样在酸性溶液（15％三氯乙酸和0.25mol / L的盐酸）中孵育在90℃下孵育45分钟。离心匀浆（5分钟，8000×g），并使用正丁醇萃取来自上清液的等分试样，然后涡旋30秒并离心（2分钟，8000×g）。在微孔板读卡器中以535nm测量吸光度并在572nm处校准。使用1.55×10的摩尔消光系数计算结果^5.mol / l / cm，表示为每毫克组织的MDA。

2.7。抗氧化酶活性的测定

GPx活性的确定如前所述[16.］．在37℃，340 nm处检测10 min的吸光度，结果表示为μ谷胱甘肽（GSH）/ min / mg蛋白质的摩尔。如前所述测量GR活性[17.通过测量烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)作为氧化谷胱甘肽还原为还原性谷胱甘肽的辅助因子的消耗。结果以GR/mg蛋白的U表示。酶活性的一个U被定义为氧化1的GR的量μGST活性的测定方法如前所述[18.]使用1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）作为基材。结果表达为GST / Mg蛋白质的u。酶活性的一个U定义为产生1的GST的量μGSH缀合物的摩尔/每分钟CDNB。使用Bradford的方法测量匀浆中的总蛋白质浓度[19.］．采用5 ' 5 ' -二硫代-双-2-硝基苯甲酸(DTNB)的Ellman反应测定巯基化合物、胰腺T-SH和NP-SH水平。4 mL匀浆在冰冷乙二胺四乙酸(0.02 mol/L;pH 8.9)与3.2 mL蒸馏水和0.8 mL 50%三氯乙酸混合。试管在3000×g离心15分钟。上清液(2ml)与4 mL Tris缓冲液(0.4 mol/L;pH 8.9)和0.1 mL DTNB (0.01 mol/L)。在412 nm处加入DTNB后5 min内测定吸光度。吸光度由谷胱甘肽标准曲线外推。数据表示为μg / g组织。

2.8。Western印迹分析

胰腺组织在冰上均质化并在4°C下离心（13000 那15分钟）。然后根据制造商的说明，使用细胞质提取试剂（Pierce Biotechnology，Rockford，IL）提取组织匀浆中的细胞质蛋白。收集上清液，测定蛋白质浓度。等量的蛋白质（40 μG / LANE）在10％SDS-PAGE上分离并转移至硝酸纤维素膜。膜堵塞5％（W./V.）脱脂牛奶，并与抗鼠标点状受体蛋白3的抗体孵育（NLRP3; 1：1000稀释; Abcam，Cambridge，UK），IL-1β（1：1000稀释;细胞信号传导技术，Danvers，Ma，USA），血红素氧合酶-1（HO-1; 1：1000稀释; ABCAM），核因子红外2相关因子2（NRF2; 1：1000稀释;abcam），和β-Actin（1：1000稀释; Sigma-Aldrich Chemical Co.），然后与二次山羊抗兔抗体（1：10,000稀释）或二次山羊抗小鼠抗体（1：10,000稀释）孵育，与辣根过氧化物酶共轭室温下1小时。通过对内务基因的整体光学密度的平均比量化蛋白质带进行量化β-Actin表达。

2.9。定量逆转录PCR（QRT-PCR）

NLRP3、IL-1的mRNA表达β使用QRT-PCR测定实验小鼠的胰腺组织中的NRF2和HO-1。胰腺组织在TrizoL®试剂（Life Technologies，Carlsbad，Ca，USA）中均质化，并根据制造商的说明提取总RNA。然后将来自每组的6-8个卵巢转移至1.5ml管，并用无RNase的PBS洗涤两次。将350ml RNA提取裂解缓冲液加入每个管中。实验重复三次。根据制造商的说明，使用RNA预备纯微型套件（DIANGEN BIOTECH，北京）提取全RNA。通过分光光度计（Nanodrop 2000c，Thermo Fisher Scientific，Waltham，Ma，USA）测量RNA浓度。使用快速RT试剂盒（KR-106-02;天根）相应的样品（100ng /反应）逆转录。然后使用BESTAR QPCR MasterMix（DBI-2223; DBI Bioscience，Ludwigshafen，Ludwigshafen，Ludwigshafen，Ludwigshafen，Ludwigshafen，德国）进行基于SYBR的QPCR。进行各种MRNA的定量，使用GAPDH作为内部对照。 The relative mRNA expression was measured using the comparative 2^{- （ΔΔCq）}方法。用于扩增mrna的引物序列如表所示1．

2.10。统计分析

采用GraphPad Prism 6软件(GraphPad, San Diego, CA, USA)进行统计学分析，数据以均数±标准差(SD)表示。采用单因素方差分析、Student-Newman-Keuls检验和Mann-Whitney秩和检验对结果进行分析。 被认为是统计学意义的。

结果

3.1。Naringenin保护Cae诱导的地图

在我们的研究中，我们发现Nar能以剂量依赖的方式减轻cae诱导的胰腺炎对胰腺组织的损伤。Cae的标准诱导剂量(50μg/kg)，胰腺组织主要表现为明显水肿、炎症细胞浸润和坏死，而na组(100 mg/kg和50 mg/kg)的胰腺损伤较MAP组明显减轻(图)1（a）)．此外，na组小鼠胰腺组织的组织学评分明显低于MAP组( ） （数字1（b）)．

我们还测量了血清参数，发现在标准Cae诱导剂量(50μG / kg），地图组中的血清淀粉酶水平显着高于地图+高剂量NAR（100mg / kg）组（ )和MAP +低剂量Nar (50 mg/kg)组( )．MAP组血清脂肪酶水平显著高于MAP + Nar高剂量(100 mg/kg)组( )和MAP +低剂量Nar (50 mg/kg)组( ） （数字1（c）)．

3.2。Naringenin保护L-精氨酸诱导的SAP

在cae诱导的AP小鼠模型中，我们发现Nar对AP有剂量依赖性的保护作用。因此，我们选择100 mg/kg作为l -精氨酸诱导SAP小鼠模型的干预剂量，检测血清淀粉酶和脂肪酶水平。SAP组的血清淀粉酶和脂肪酶水平显著高于SAP +高剂量Nar (100 mg/kg)组( )和SAP +低剂量Nar (50 mg/kg)组( )(数据2（a）和2（b）)．

在L-Arg诱导的SAP的小鼠模型中，我们还发现，与SAP组相比，NAR-（100mg / kg）处理的小鼠中的胰腺损伤显着减轻。因此，组织学评分低于SAP组中的组织学评分。这些数据表明NAR在两个地图和SAP中的保护作用（图2（c）和2 (d))．

急性肺损伤是SAP器官衰竭最突出的特征之一，肺H&E染色结果显示，Nar- (100 mg/kg)处理组小鼠肺泡间隔炎性细胞浸润和毛细血管充血扩张较SAP组明显减轻。与此同时，na组小鼠肺组织的组织学评分显著低于SAP组( )(数据2 (e)和2 (f))．

３．3.柚皮素减少小鼠MAP和SAP模型的炎症细胞募集

在胰腺炎中，炎症反应是由一系列炎性细胞因子如IL-6, IL-1的产生引发的β和tnf-α．在MAP模型中，给予标准剂量的Cae (50μg/kg)导致血清IL-6、IL-1升高β和tnf-α与地图组相比水平。此外，与地图组相比，NAR治疗（50 mg / kg）降低了所有这些参数（ ） （数字3（a）)．有趣的是，CAE和NAR（100mg / kg）的共同分发还原血清IL-6，IL-1β和tnf-α甚至进一步的水平（ ） （数字3（a）)．在SAP模型中也观察到类似的结果(图)3 (b))．

MPO在嗜中性粒细胞中特异性地表达，并在炎症的条件下释放到循环中。因此，MPO活性可以反映中性粒细胞的活化。在这项研究中，我们在胰腺组织中进行了免疫荧光染色，其用于反映胰腺炎的程度。在地图组中，胰腺组织的MPO染色明显强于NAR-（100mg / kg）处理组（图3 (c))．NAR也对SAP模型中的MPO免疫染色的影响（图3 (d))．

3．4．柚皮素能降低MAP和SAP小鼠胰腺中氧自由基的生成

氧化应激参与急性胰腺炎的炎症反应。我们测量了MDA，脂质过氧化标志物的水平，以反映胰腺损伤程度。结果表明，NAR（100mg / kg）治疗显着降低了与地图小鼠对比的胰腺组织中的MDA水平（ ） （数字4(一))．在SAP + NAR 100mg / kg组中，胰腺组织中的MDA水平显着降低（图4 (b))．Nar处理后(100 mg/kg)， MAP和SAP中GPx、GR、GST、TT-SH和NP-SH均上调(图)4(一)和4 (b))．

3．5．柚皮素损害NLRP3炎性小体激活和IL-1β生产

我们进行了Western印迹分析和QRT-PCR以检测NLRP3和IL-1的表达β在两种模型的胰腺组织中。我们的结果显示，两种模型中NLRP3的表达均显著升高，且与MAP和SAP组相比，给药Nar (100 mg/kg)显著降低了胰腺组织中NLRP3的表达( 和 职责。)(数据5(一个)和5（b）)．NLRP3炎性小体的激活促进IL-1的成熟和释放β．我们的结果表明，IL-1的表达β在NAR（100mg / kg）预处理组中显着抑制与地图和SAP组（ 和 职责。)(数据5(一个)和5（b）)．此外，进行QRT-PCR以检测NLRP3和IL-1的mRNA表达β在不同的组。我们的结果表明，Nar (100 mg/kg)处理降低了NLRP3和IL-1β与MAP组比较，各组胰腺组织mRNA表达量( 和 ，resp。）（图5（c）)．在SAP模型中也观察到类似的结果(图)5（c）)．

3.6。柚皮素增强两种模型胰腺组织Nrf2/HO-1表达

已显示氧化应激在AP的发病机制中发挥至关重要作用，并且NRF-2 / HO-1途径与氧化刺激密切相关。NRF2可以易于与抗氧化反应元件相互作用以诱导下游基因表达，包括HO-1的细胞核。以前的研究表明，NRF2 / HO-1途径主要在AP中调节。为了通过诱导HO-1和NRF2表达来研究NAR对地图和SAP模型的胰腺组织对胰腺组织的抗炎作用，通过蛋白质印迹和QRT-PCR检查HO-1和NRF2的蛋白表达治疗不同剂量。结果表明，NAR在地图模型中以剂量依赖性方式增加了HO-1蛋白水平（图6（a）)．类似地，还显示NAR在SAP模型中以高剂量诱导HO-1和NRF2表达（图6（b）)．总的来说，这些研究结果表明，NAR可能通过NRF2和HO-1的诱导对抗地图和SAP对抗映射和SAP（图6（a）-6（c）)．

4.讨论

我们的研究表明，NAR对混凝管诱导和L-精氨酸诱导的胰腺炎和遥远的器官伤害施加了保护作用。此外，我们已经证实，NAR的预防施用可以减少胰腺病理损伤，炎症反应和NLRP3炎症的活化以及减轻实验式图和SAP小鼠中的氧化应激。据我们所知，我们首次证明NAR可用作AP的新颖和有效的治疗剂。

作为一种类黄酮类化合物，NAR是葡萄柚中的主要黄酮，发现具有强烈的抗炎，抗氧化剂和器官保护活性。先前的研究表明，NAR减轻了肝脏和肾脏引起的小鼠中肝癌的组织病理学变化[20.］．NAR可以下调TNF-A，IL-1βIL-6，IL-10和其他巨噬细胞的其他炎症细胞因子感染活Chlamydia Thachomatis.[21.］．我们的研究与这些调查结果一致，我们还确认NAR的管理可以对地图和SAP发挥保护作用。即使在各种剂量或浓度范围内，NAR已被证明可以发挥保护作用。我们的研究进一步确保100毫克/千克的NAR预处理具有明显的保护作用。然而，NAR在炎症疾病中的潜在作用尚未得到广泛研究，特别是在需要进一步调查的AP中。

炎症反应是胰腺炎和胰腺炎引起的远端器官损伤的发病和进展的标志，其中炎症细胞因子的释放和中性粒细胞渗出是两个关键事件。il - 6、il - 1β和tnf-α是参与炎症反应的最重要的细胞因子，其血清水平与AP的严重程度直接相关。在我们的研究中，我们得出Nar可以减轻这些炎症细胞因子的级联激活，对器官损伤产生保护作用。MPO主要在中性粒细胞中表达，可作为激活中性粒细胞的生物标志物。我们的结果与之前的研究结果一致，MAP和SAP导致胰腺组织MPO表达增强，而Nar预处理导致MPO表达显著降低。总的来说，炎症介质的级联激活和吞噬细胞的过度反应以及它们的相互作用在过度炎症反应引起的局部组织损伤中发挥了重要作用。Nar似乎是一种潜在的AP治疗药物。

炎症组是由核苷酸结合结构域和富含亮氨酸富含的含有含有亮氨酸的重复的蛋白质或AIM2，衔接蛋白ASC和Caspase-1组成的大型多蛋白复合物，并且在宿主防止外源病原体和炎症中起着关键作用[22.那23.］．规范炎症包括NLRP3，NLRP1，NAIP-NLRC4和AIM2。其中，NLRP3炎症是最熟练的研究，NLRP3炎性的过度激活参与了几种炎症疾病的发病机制。先前的研究表明，NLRP3炎症组活化的抑制衰减小鼠实验AP [4.］．我们的研究结果表明NLRP3炎性小体确实在AP中发挥了重要作用，Nar通过抑制NLRP3炎性小体的激活，保护小鼠抗MAP和SAP。

AP的病理生理学是非常复杂的，并且发现氧衍生的自由基参与AP的发病机制[24.］．由于胰岛细胞中的抗氧化酶的极低表达，胰腺组织比其他组织更易于氧化应激。25.］．在急性胰腺炎期间产生的氧自由基不仅导致胰腺炎癌细胞损伤，还导致胰腺损伤有助于[26.那27.］．胰腺和肝脏在解剖位置、生理功能、血流动力学等方面有着密切的联系。AP中氧自由基的释放通过血液循环到达肝脏，造成肝脏损伤，导致肝脏清除自由基的能力下降，增加全身氧化应激反应。已有研究表明，在cae诱导的AP大鼠模型中，组织丙二醛等物质明显上调。因此，我们假设在Cae或l-精氨酸诱导的小鼠胰腺炎模型中，胰腺组织局部释放的MDA等氧化应激相关分子运输到肝脏，损害肝脏清除自由基的能力，导致氧化应激增强和胰腺毒性表现。氧化应激指标的水平与急性胰腺炎的严重程度相关。最近的一项研究显示，葡萄籽中提取的原花青素可以通过Nrf-2/HO-1信号通路在氧化应激介导的大鼠胰腺功能障碍中发挥保护因子的作用[28.］．原花青素/ NRF-2 / HO-1轴在预防人支气管上皮BEA-2B细胞中的氧化应激也起着关键作用[29.］．另一项研究表明，HO-1和CO通过降低TNF-的表达发挥抗炎作用α, il - 1β，巨噬细胞炎症蛋白-1和增加IL-10水平[30.-32.］．基于这些发现，我们推测抑制氧化应激是减少炎症和降低胰腺炎的严重程度的主要决定因素。HO-1可以催化血红素的降解，以产生充当抗氧化剂的CO，是孤立氧化应激的主体防御的重要分子。通过下调炎症因素，如基质金属蛋白酶2和COX-2，它具有抗炎能力。33.-35.］．Nrf2作为ARE依赖的II期酶的上游调控因子，转运至细胞核，与ARE相互作用，进一步促进抗氧化基因的表达，包括HO-1 [36.那37.］．我们的研究结果表明，Nrf2被激活，HO-1被上调，在na诱导的抗氧化应激免疫防御中。这些发现提供了一种潜在的治疗策略，以防止AP涉及氧化应激和过度炎症反应。

总之，NAR通过抑制NLRP3炎性组织的灭活和NRF2 / HO-1表达的上调来抑制氧化应激和炎症反应对CAE-和L-ARG诱导的​​胰腺炎的保护作用。

的利益冲突

作者没有利益冲突需要声明。

作者的贡献

魏琴李和邦璐制定了论文的想法，监督了研究，并审查并修订了手稿。雍丽，义源潘，林高成的研究并写了稿件。志辉塘，郭璐，白强李提供了意见和技术咨询。京珠张和小臣谢参加了准备数字和表格并分析数据。林高修订了稿件并提供了评论。所有作者都审查了稿件。雍丽，义源潘，林高的贡献了这项工作。

致谢

本研究由国家自然科学基金资助项目(no。基金资助:国家自然科学基金资助项目(81570584);BE2015685也没有。国家自然科学基金项目(SQN20140063);国家博士后科学基金项目(2014M562664)。

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