文摘
乳腺癌的进展是炎症过程密切相关,加重疾病。炎性细胞因子肿瘤坏死因子的影响α在乳腺恶性肿瘤不能完全证实,他们可能会影响到肿瘤坏死因子之间的协同α和其他protumoral介质。在这里,我们表明,连同其他代表肿瘤微环境的重要武器,雌性激素(荷尔蒙)和EGF政府内部(促进增长的经济)、肿瘤坏死因子α强有力地在腔的乳腺癌肿瘤细胞诱导metastasis-related属性和功能,代表最常见类型的乳腺癌。共同,肿瘤坏死因子α+雌激素+ EGF对乳腺癌细胞的影响更强比单独每个元素,导致如下:(1)形成广泛的细胞扩散和FAK / paxillin-enriched细胞突起;(2)提高肿瘤细胞的比例coexpressing高水平的CD44和β1和VLA6;(3)有效市场假说和细胞迁移;(4)抗化疗;(5)释放protumoral因素(CXCL8 CCL2,基质金属蛋白酶)。重要的是,在这项研究中使用的肿瘤细胞是已知nonmetastatic在所有条件下;然而,他们获得高转移的能力在活的有机体内肿瘤坏死因子在老鼠身上,经过一个短暂的刺激α+雌激素+ EGF。这些戏剧性的发现表明TNFα可以变成一个强大的prometastatic因素,提出一种范式转移,临床批准TNF抑制剂α将应用于乳腺癌的治疗。
1。介绍
大多数乳腺癌患者被诊断为腔的肿瘤的特点是表达雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)和没有或只有微弱的放大的HER2(后一个参数取决于子类,是否腔的A或B) (1,2]。尽管ER-expressing和PR-expressing患者通常经验良好的结果和预后相对良好,最终他们中的许多人变得反应迟钝的内分泌治疗和发展转移在遥远的器官1- - - - - -3]。迄今为止,机制,有助于肿瘤进展和转移形成更重要的是在这些病人都知之甚少。
肿瘤细胞传播到遥远的器官是一个多因子的过程,与upregulation细胞外基质(ECM)的粘附受体,增加传播和迁移,epithelial-to-mesenchymal过渡(EMT) [4- - - - - -10]。此外,强大的感应转移特征的元素赋予在肿瘤细胞的肿瘤微环境,促进不同metastasis-related功能包括肿瘤细胞扩散和EMT (11- - - - - -13]。
肿瘤环境是一个极其复杂和动态结构由许多细胞类型、ECM组件和分泌的因素。最近,密集的研究表明,有一个亲密的炎症和癌症之间的联系,在炎症细胞和细胞因子促进肿瘤的生长和发展过程。在这方面,强调被归因于炎性细胞因子肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子α)。肿瘤坏死因子α证明诱导抗肿瘤作用,在高浓度直接注射到肿瘤。因此,肿瘤坏死因子α被认为是在相当长的一段时间内作为一个潜在的治疗方法,其介绍将限制疾病的患者。然而,最近的调查挑战这一观点和表明慢性和一致的肿瘤坏死因子的存在α在许多恶性疾病(肿瘤导致procancerous后果14- - - - - -17]。
特别是在乳腺癌动物模型系统的研究表明TNFα对病因procancerous活动通过不同的机制(18- - - - - -21]。沿着这些线路,我们和其他人表明TNFα在乳腺肿瘤中表达的高度22- - - - - -25),TNF的发病率α表达显著增加在晚期乳腺癌(发现在大约90%的患者复发性疾病)(22),肿瘤坏死因子α诱导EMT和乳腺肿瘤细胞的入侵22,26,27]。此外,由于炎症的行为作为炎症趋化因子的诱导物,TNFα间接导致肿瘤高protumoral白细胞亚种群的存在(28]。
肿瘤坏死因子的对立的角色α癌症可能是由于相互作用的细胞因子与其他procancerous元素驻留在肿瘤环境。在腔的乳腺肿瘤,这种相互作用可能发生主要与肿瘤微环境的两臂:荷尔蒙政府内部恶性进程和促进增长的经济的关键调节因素,促进肿瘤细胞增殖。事实上,雌激素是一个关键球员在腔的乳腺肿瘤,提高乳腺肿瘤细胞的增殖,诱导EMT,因此增加了这些细胞的迁徙和侵入性能力(29日- - - - - -32]。尽管缺乏ER通常预后较差(32,33),激素本身具有明确的有效的肿瘤促进功能,从而在治疗乳腺癌是一个主要的治疗目标。政府内部并行,促进增长的经济因素,如表皮生长因子(EGF)是大型的相关性。腔的乳腺癌细胞通常不会表现出放大EGF-signaling HER2受体或只显示这种受体低表达;不过,他们结合EGF和应对其肿瘤促进刺激(34- - - - - -37]。EGF促进肿瘤细胞增殖、迁移、入侵,EMT (36,38- - - - - -40),因此应该考虑当我们考虑联合活动的微环境因素对乳腺癌转移。
针对现有肿瘤微环境性质,在这项研究中我们确定三个arms-inflammatory(肿瘤坏死因子的共同影响α政府内部)+荷尔蒙(雌激素)+促进增长的经济(EGF)——malignancy-promoting腔的乳腺肿瘤细胞的特点与功能。这种“联合刺激”TNFα+雌激素+ EGF提供了更多方面的相关表示性质的肿瘤微环境在腔的乳房肿瘤比测试方法的不足单独每个元素的活动。“刺激”相结合的方法是支持发表研究结果证明coregulatory胞内肿瘤坏死因子之间存在的相互作用α、雌激素和/或EGF-mediated通路在乳腺癌和其他恶性肿瘤(34,41,42]。因此,在这项研究中我们决定肿瘤坏死因子的影响α+雌激素+ EGF刺激,而每一个因素的影响。使用TNF的联合力量α+雌激素+ EGF刺激,我们发现MCF-7腔的乳腺癌肿瘤细胞获得非常高的metastasis-related功能。已经在研究的最初阶段,我们发现联合刺激的影响远高于TNFα独自,雌激素,或EGF的肿瘤促进方面进行了研究。因此,在更高级的阶段的研究我们专注于联合刺激肿瘤坏死因子的影响α+雌激素+ EGF对功能性肿瘤促进读数,包括肿瘤的生长和转移的形成。
总的来说,我们的发现表明TNFα引发许多metastasis-related功能在腔的乳腺癌肿瘤细胞和它的活动与雌激素和EGF主要由协同放大。的肿瘤坏死因子α+雌激素+ EGF刺激高传播赋予了癌细胞和肿瘤,metastasis-promoting EMT的特点和功能。此外,尽管肿瘤坏死因子α一些肿瘤细胞的细胞毒性,与雌激素的协同和EGF导致选择的肿瘤细胞获得了高转移的能力在活的有机体内在一个动物模型系统。
这些观察表明,一种范式转移需要治疗腔的乳腺癌患者,治疗对肿瘤坏死因子α应该引入临床方案,而不是使用TNF吗α作为细胞毒性剂。肿瘤坏死因子抑制剂α已经在临床用于其他适应症(自身免疫性疾病),我们的研究结果表明,他们应该结合antihormonal方法和模式针对EGF-HER2通路。我们提出了这种综合疗法针对多个肿瘤促进因素可能实现高在腔的乳腺癌患者治疗的影响。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
MCF-7细胞腔的乳腺癌肿瘤细胞表达高水平的ER和PR和显示低水平的表达HER2和表皮生长因子受体(EGFR) [43- - - - - -45]。这些细胞被发现提供的独特设置腔的乳腺癌肿瘤细胞由(1)本研究需要应对TNFα(22,46,47];(2)表达雌激素受体α(ERα)和应对雌激素34,48,49];(3)应对EGF尽管相对较低的表达HER2和表皮生长因子受体(34- - - - - -37]。提供的细胞被好心的教授凯(以色列Rehovot魏茨曼科学研究所的,)。符合出版MCF-7特征(43- - - - - -45),这些细胞被认证的基础上ER的表达和活动α;在体外雌激素响应能力;肿瘤的形成需要雌激素和人工基底膜;和低HER2的表达。细胞保持增长媒体包含DMEM补充10%胎牛血清(FCS), 2毫米谷酰胺,青霉素100单位/毫升,100年μg / mL链霉素,250 ng / mL两性霉素(所有从生物产业、拜特Haemek以色列)。
2.2。细胞刺激
MCF-7细胞被镀在完整的媒体,在PBS洗,与肿瘤坏死因子刺激了三天α、雌激素和/或EGF。三个兴奋剂的浓度选择基于大量的滴定法和动力学分析(数据未显示),他们同意其他研究系统中使用的常规剂量范围:TNFα在50 ng / mL(猫。不。300 - 01 -;美国新泽西PeproTech,落基山),雌激素在10−8(猫。不。E8875;σ,圣路易斯,密苏里州,美国)和表皮生长因子在30 ng / mL(猫。不。236 -如;研发系统,明尼阿波利斯,美国)。在所有程序,控制non-stimulated细胞生长在上面的稀释剂刺激器的存在。在苯酚red-free和无血清DMEM执行刺激。媒体,包括刺激器,每天都在改变。
当表示,Src的药理抑制剂,PP2(猫。不。529573;Calbiochem EMD微孔,圣地亚哥,美国CA)是用于传统的浓度2.5 - 5μm .添加抑制剂是同时细胞培养细胞肿瘤坏死因子的刺激α+雌激素+ EGF或控制non-stimulated细胞和出现在文化在刺激的持续时间(3天)。控制细胞治疗药物的增溶剂与稀释(DMSO溶液;σ)。
2.3。共焦显微镜分析
刺激和non-stimulated MCF-7细胞被固定在8%多聚甲醛(PFA;猫。不。1.04005;默克公司,达姆施塔特,德国),特里同permeabilized 0.2%(猫。不。x - 100;σ),阻止了2% BSA(猫。不。0332 - tam; Amresco, Solon, OH, USA). Nuclei were visualized by DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole; cat. no. 9564; Sigma) and actin fibers by FITC-conjugated phalloidin (cat. no. P-5282; Sigma). The following antibodies (Abs) were used: rabbit IgG against focal adhesion kinase (FAK; cat. no. sc-558; Santa Cruz biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) and mouse IgG1 against paxillin (cat. no. 624001; Biolegend, San Diego, CA, USA). Then, the cells were incubated with the secondary Abs: Dylight-549-conjugated against rabbit IgG (cat. no. 111-505-144; Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA) or Alexa-647-conjugated against mouse IgG (cat. no. 115-606-146; Jackson Immunoresearch Laboratories). Baseline staining was obtained by nonrelevant isotype matched controls. Coverslips were mounted using fluorescent mounting medium (cat. no. E18-18; Golden Bridge International, Mukilteo, WA, USA) and read by Zeiss LSM 510-META confocal microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany) at ×63 magnification.
2.4。流式细胞术
细胞表面分子的表达水平流式细胞术测定(流式细胞仪)的刺激和non-stimulated MCF-7细胞,正欲使用FACSort(美国加利福尼亚州山景城)。以下用Abs: PE-conjugated鼠标IgG1反对整合素β1 (CD29;猫。不。303004;Biolegend), Alexa 488 conjugated-Rat IgG2a反对整合素α6 (CD49f;猫。不。313607;Biolegend), Alexa 488 -共轭鼠IgG2b针对CD44(猫。不。103015;Biolegend)和鼠标IgG1钙粘蛋白(图7猫。不。sc - 21791;圣克鲁斯生物技术;图S2-cat。不。324101;Biolegend)。Abs与钙粘蛋白是紧随其后的是FITC-conjugated Abs对小鼠免疫球蛋白(猫。不。 115-095-003; Jackson Immunoresearch Laboratories). Baseline staining was obtained by nonrelevant isotype matched controls. Staining patterns were determined using the win MDI software.
2.5。定量实时聚合酶链反应
细胞总RNA隔绝刺激和non-stimulated MCF-7使用EZ-RNA工具包(猫。不。20-400-100;生物产业)。RNA样本用于代第一链互补DNA合成使用M-MLV逆转录酶(猫。不。AM2044;美国Ambion、奥斯汀、TX)。量化的cDNA目标定量实时聚合酶链反应(qPCR)进行转子基因6000 (Corbett生命科学、协和、新南威尔士、澳大利亚),利用转子基因6000系列软件。记录被发现使用绝对蓝色qPCR SYBR绿色混合火箭(猫。 no. AB-4163/A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) according to the manufacturer’s instructions. In each reaction, two pairs of specific primers were used, designed for different exons. The sequences of the primers as follows: for Zeb1-forward 5′-TGCAGCTGACTGTGAAGGTGT-3′, reverse 5′-CTTGCCCTTCCTTTCTGTCATC-3′; for Snail-forward 5′-CTAATCCAGAGTTTACCTTCCAGCA-3′, reverse 5′-AGTCCCAGATGAGCATTGGC-3′; for Slug-forward 5′-CCTGGTCAAGAAGCATTTCAA-3′, reverse 5′-CAGGCATGGAGTAACTCTCA-3′; for the normalizing gene rS9-forward 5′-TTACATCCTGGGCCTGAAGAT-3′ and reverse 5′-GGGATGTTCACCACCTGCTT-3′. PCR amplification of the genes rS9 and Slug was performed over 40 cycles (95°C for 15 sec, 59°C for 20 sec, 72°C for 15 sec), while amplification of Zeb1 was performed over 40 cycles (95°C for 15 sec, 59°C for 20 sec, 80°C for 15 sec), and of Snail over 45 cycles (95°C for 15 sec, 59°C for 20 sec, 84.5°C for 15 sec). Dissociation curves for each primer set indicated a single product, and no-template controls were negative after 40/45 cycles. Quantification was performed by standard curves, on the linear range of quantification.
2.6。细胞生存能力
刺激和non-stimulated MCF-7细胞recultured 96 -孔板在生长介质含有兴奋剂。8小时之后,媒体被移除和肿瘤坏死因子的细胞暴露在刺激相结合α+雌激素+ EGF,缺席或者1的存在μ米阿霉素(Netanya梯瓦制药,以色列;请提供同行教授,特拉维夫大学)。阿霉素的浓度被选中后滴定分析(数据未显示)。额外的三天之后,媒体被移除,细胞被洗,XTT试剂(猫。不。20-300-1000;生物产业)添加到井2小时按照制造商的指示。吸光度测量在450 nm和630 nm。每组(non-stimulated和刺激细胞)细胞生存的百分比计算相比,细胞没有暴露于阿霉素。在其他情况下,细胞生存能力是由台盼蓝排斥(猫。 no. 03-102-1B; Biological industries), in two replicates. Viable cells were counted using a hemocytometer, and total cell number was calculated.
2.7。ELISA检测
刺激和non-stimulated MCF-7细胞增长如上所述。条件培养基(CM)从文化的最后24小时,和CXCL8 CCL2水平ELISA测定用标准曲线与rhCXCL8或rhCCL2(猫。不。200 - 08年,300 - 04,分别地;PeproTech),线性范围的吸光度。使用下面的Abs(从PeproTech): CXCL8:涂料多克隆Abs(猫。不。500 - p28),检测生物素化的兔多克隆Abs(猫。不。500 - p28bt); For CCL2: coating monoclonal Abs (cat. no. 500-M71), detecting biotinylated rabbit polyclonal Abs (cat. no. 500-P34Bt). After the addition of streptavidin-horseradish peroxidase (cat. no. 016-030-084; Jackson Immunoresearch Laboratories), the substrate TMB/E solution (cat. no. ES001; Millipore, Temecula, CA, USA) was added. The reaction was stopped by the addition of 0.18 M H2所以4并以450海里。同时,细胞被台盼蓝排斥被胰蛋白酶化和计算(见上图),结果是规范化的细胞数量。
2.8。凝胶基质Zymography
镀MCF-7细胞在生长介质24-well板块。隔夜孵化后,生长介质被和细胞与肿瘤坏死因子刺激了三天α+雌激素+ EGF如上表示。厘米的最后24小时收集和分离7.5% SDS-polyacrylamide凝胶含有0.1%明胶底物。经过电泳,凝胶在50毫米洗了三次三羟甲基氨基甲烷/盐酸液pH值7.5,含2.5% Triton x - 100。50 mM的凝胶被洗了三次三羟甲基氨基甲烷/盐酸pH值7.4缓冲液,其次是孵化在缓冲区包含50毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸液pH值7.4,0.02% NaN3CaCl, 10毫米248小时在37°C。三个洗后重蒸馏的H2O,凝胶coomassie蓝色和厌恶嫌弃沾0.1% 20%甲醇和10%冰醋酸,直到清楚乐队的蛋白质降解是可视化。在平行,细胞被胰蛋白酶化被台盼蓝排斥数(见上图)。获得的乐队受到微执行使用接穗图像软件,和他们的密度是标准化的手机号。
2.9。化验的Tumor-Spheroids
一夜之间,6-well盘子被孵化与1.2%聚摇臂(2-hydroxyethyl丙烯酸甲酯)(猫。不。P3932;σ)的甲醇。MCF-7细胞被镀在酚红自由DMEM / F12培养基补充2毫米谷酰胺,青霉素100单位/毫升,100年μg / mL链霉素,250 ng / mL两性霉素(所有从生物产业),0.4% BSA(猫。不。0332 - tam;Amresco)、无血清培养系统B-27补充(猫。不。17504;Gibco,生活技术,大岛,纽约,美国),20 ng / mL基本FGF(猫。不。100 - 18 b;Peprotech)、20 ng / mL EGF(猫。 no. 236-EG; R&D systems), and 5 μg / mL胰岛素(猫。不。I9278;σ)。三天后,tumor-spheroids形成,细胞与肿瘤坏死因子的刺激α+雌激素+ EGF的说明或稀释剂浓度高于刺激器,额外的24 - 96小时。使用光学显微镜在细胞拍摄日常×10放大。
流式细胞术分析后肿瘤球体形成,细胞通过40μ米尼龙网状细胞过滤器,为了从tumor-spheroids独立的单个细胞。Tumor-spheroids后来被胰蛋白酶化和细胞分离得到的这个过程比较单一细胞迁移的Tumor-spheroids刺激形成的细胞。细胞生存能力的团体是由台盼蓝排斥(见上图)和细胞染色使用Abs与钙粘蛋白(见上图)。
2.10。肿瘤的生长和转移
MCF-7被感染细胞稳定表达mCherry (pQCXI-mCherry逆转录向量)。细胞被TNF non-stimulated或刺激α+雌激素+ EGF在上述浓度三天。然后,这些细胞被洗了,4×106细胞/鼠标被接种女性无胸腺的裸体小鼠的乳腺脂肪垫(哈伦实验室,耶路撒冷,以色列)。注射到老鼠之前,与基底膜基质细胞混合1:1(猫。不。356234;BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)。肿瘤细胞接种前一个星期,所有与缓释植入小鼠皮下注射雌激素丸(1.7毫克/颗粒,释放60天,猫。不。se - 121;美国佛罗里达州萨拉索塔,创新研究的美国,)对小鼠MCF-7细胞的生长至关重要。
国际大师的活体成像系统是用于监控完整的老鼠,在四个不同的时间点沿着37天的时间进程(根据实验)。迈斯卓设备提供了两个读数:(1)原发性肿瘤的大小以及完整的小鼠肿瘤的生长过程;(2)缺乏完整的小鼠或转移的存在。实验终止时,器官切除和转移形成由大师相比获得的读数装置。这一分析表明,在完整的老鼠,大师设备检测到macro-metastases以可靠的方式,但是不能检测微转移,可能已经形成。因此,检索到的数据大师设备实际上提供了小鼠在不同时间点的信息macrometastases在不同器官的形成。
特拉维夫大学动物保健委员会的规定不允许继续生存分析的实验阶段。所有程序涉及实验动物进行符合当地的动物福利法律、方针和政策。
2.11。统计分析
的统计分析在体外使用学生的实验完成t测试。的值被认为具有统计学意义,所有在体外数据提出了均值±标准差(SD)。在在活的有机体内原发性肿瘤的研究,提出了数据的平均值±标准误差(SEM),和肿瘤大小的统计分析使用学生的完成t测试,的值被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。联合刺激肿瘤坏死因子α+雌激素+ EGF放大肿瘤细胞重构并导致增加细胞扩散和高Metastasis-Related粘附分子的表达
肿瘤坏死因子α、雌激素和EGF均显示有可能促进乳腺肿瘤细胞的metastasis-related属性,如上所述;然而,不同的研究系统被用于所有这些因素的研究。在我们的研究中,我们肩并肩TNF的能力进行比较α、雌激素和/或EGF影响传播和EMT属性,使用MCF-7腔的乳房肿瘤细胞。这些细胞表达受体的三个上述因素(上图)提供的证明人,并代表nonadvanced阶段乳腺恶性肿瘤,可以推动向一个更积极的/入侵表型的收购EMT属性(22,26,27]。
首先,我们确定肿瘤坏死因子的影响α,雌激素,EGF,或所有三个因素在肿瘤细胞形态、传播和粘附分子的表达,促进肿瘤细胞浸润和转移(50- - - - - -53]。刺激肿瘤细胞肿瘤坏死因子的三天α诱导actin-rich细胞突起的形成,伴随着一定浓度的肌动蛋白纤维细胞皮层(图1(负责)。相比之下,单独使用雌激素对肿瘤细胞形态(图没有影响1(A2b))和表皮生长因子诱导细胞扩散程度低于肿瘤坏死因子α(图1(A2c))。然而,最健壮的细胞形态学变化,以广泛的传播和重组的压力纤维,发现当雌激素和EGF TNFα(图1(B))。的细胞被肿瘤坏死因子暴露在刺激相结合α+雌激素+ EGF已经形成了明确的和大细胞突起,压力与肌动蛋白纤维明显,最低限度之前在控制细胞non-stimulated(图可见1(B)和图1(A1))。额外的分析也表明TNF的三重刺激α+雌激素+ EGF更有效诱导扩散和细胞重构比双重刺激雌激素+ TNFα或雌激素+ EGF(图S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2013/720536)(双重刺激关注组合包括雌性激素,因为它是最相关的因素我们使用腔内肿瘤细胞表现为ER表达)。在一起,这些结果提供的证据强有力的联合刺激肿瘤坏死因子的影响α+雌激素+ EGF比其他组合,表明三个手臂的关节活动诱发的肿瘤微环境是有利的传播和adhesion-related功能在腔的乳房肿瘤细胞。
额外的分析表明,肿瘤坏死因子诱导的形态学变化α+雌激素+ EGF在肿瘤细胞伴有粘着斑激酶(FAK)和桩蛋白的重新分配,两个关键细胞粘附和传播的监管机构50- - - - - -53)(图2)。此外,我们注意到,癌细胞被肿瘤坏死因子暴露在刺激相结合α+雌激素+ EGF相互脱离,并形成了连接管(数字2(A2b)和2(B2b))。根据已公布的报告(54,55),这些微管可能支持之间的细胞内的组件交换癌细胞。FAK和桩蛋白及其贡献的激活细胞突起形成被发现Src-mediated流程。这是由强有力的抑制细胞扩散和FAK表示特定的Src /桩蛋白定位在细胞四肢的抑制剂PP2(图3)。
强大的传播引起的肿瘤坏死因子α+雌激素+ EGF导致我们监控的表达β1整合素,已知强烈参与肿瘤细胞粘附过程,扩散和转移的形成(56- - - - - -60]。如图4的三个因素主要是肿瘤坏死因子α感应探测upregulation在β1表达虽然非常有限的范围内;然而,当肿瘤坏死因子α活动是由雌激素和加入EGF,结果TNFα+雌激素+ EGF刺激导致更大量的整合素β1 upregulation,在某种程度上比最小影响引起的每个单独的因素(数字4(a1) -4(a3)和图4(B))。
的β1整合素已被证明在很多研究中站在增加肿瘤细胞的粘附和入侵的基础,包括乳房起源的56- - - - - -60]。因为整合蛋白作为αβ形成,我们寻找α链对应伴随表达的增加β1。通过许多不同的全面搜索α子单元已确定增加α6针对肿瘤坏死因子α(图+雌激素+ EGF刺激4(c))。因此,合并后的刺激导致的分组人口增加肿瘤细胞表达高水平的α6β1。的α6β1异质二聚体,否则称为VLA6,层粘连蛋白受体已被确定在过去invasion-supporting复杂,促进乳腺癌的进展(61年,62年]。
同时,我们发现,肿瘤坏死因子的刺激相结合α+雌激素+ EGF诱导强劲upregulation在另一个高度的粘附分子与乳腺癌转移、CD44(图5)[6,7,63年,64年]。正如前面展示为所有其他功能,综合刺激CD44高程的影响绝对是比每个stimulators-TNF更为强大α、雌激素或EGF-alone(图5)。感兴趣的是由于肿瘤坏死因子刺激的事实α+雌激素+ EGF,超过50%的肿瘤细胞获得高表达水平β(图1和CD44在一起5(c))。
总的来说,上述结果表明,TNF的所有三个因素α是最强的诱导物,传播和表达metastasis-related粘附分子的鲁米那MCF-7乳腺癌肿瘤细胞,其活动强烈放大的协同与其他两个代表的肿瘤微环境,雌性激素(荷尔蒙)和EGF政府内部(促进增长的经济)。
3.2。联合刺激肿瘤坏死因子α+雌激素+ EGF是有利的在每个因素单独诱导EMT在乳腺肿瘤细胞
遵循上面的结果,我们决定肿瘤坏死因子的能力α、雌激素和EGF-each单独或一次诱导肿瘤细胞EMT属性。在细胞接受EMT,减少钙粘蛋白的表达促进互相分离的肿瘤细胞(9,10]。因此,后三天TNF的刺激α、EGF和雌激素,分别,downregulation上皮细胞表面表达的发现在某种程度上,与肿瘤坏死因子α诱导最突出的三个因素的影响;然而,很显然,最有效的EMT表型得到联合刺激一起三个因素,肿瘤坏死因子的形式给出α+雌激素+ EGF(图6)。在合并后的刺激,细胞获得细胞经历EMT的典型形态,相互分离和表达明确的细胞突起(图7(a))。进一步支持肿瘤坏死因子的能力α+雌激素+ EGF刺激诱导EMT在已知的表达显著增加EMT活化剂Zeb1,蜗牛和蛞蝓(65年- - - - - -70年肿瘤细胞(图)7(b);EMT监管机构转折是衰减;数据未显示)。
3.3。刺激乳腺肿瘤细胞的肿瘤坏死因子相结合α+雌激素+ EGF导致功能性肿瘤促进后果
上图中,我们已经表明,肿瘤坏死因子的刺激相结合α+雌激素+ EGF强烈诱导和EMT属性在腔的乳腺癌肿瘤细胞扩散。遵循上面的结果,我们决定联合刺激肿瘤细胞功能的影响,参与了肿瘤的生长和发展。由于其高的临床相关性肿瘤恶化,首先我们问有什么影响电阻的组合刺激肿瘤细胞对阿霉素(阿霉素),这是一种常用化疗治疗乳腺癌患者(71年,72年]。这样做分析时,我们意识到这一事实MCF-7细胞对肿瘤坏死因子敏感α细胞毒性(73年- - - - - -75年肿瘤坏死因子),因此我们的常规程序α+雌激素+ EGF刺激三天导致死亡的大约40%的肿瘤细胞(图S2)。然而,尽管他们明显对肿瘤坏死因子的敏感性α全身的细胞毒性,暴露在联合刺激肿瘤细胞都具有更高的耐阿霉素(图8(a))。这些结果表明,那些幸存下来的肿瘤细胞肿瘤坏死因子α全身的细胞毒性被选为高阻化疗所致死亡。
在平行于上述,我们确定的联合刺激肿瘤坏死因子的影响α+雌激素+ EGF对肿瘤细胞的能力获得额外promalignancy功能。“每个细胞”的分析,我们发现,肿瘤细胞的肿瘤坏死因子的刺激α+雌激素+ EGF引发了强大的海拔释放的炎症趋化因子CXCL8(图8(b1))和CCL2(图8(b2)),已被描述为强壮的肿瘤促进因素由于其强有力的血管生成活动和招聘tumor-supporting白细胞的肿瘤(76年- - - - - -81年]。此外,为了应对肿瘤坏死因子的刺激相结合α+雌激素+ EGF,肿瘤细胞获得了生产能力高水平的功能基质金属蛋白酶9 (MMP9);图8(c)),降解的关键酶的细胞外基质(ECM)在当地的入侵结束外渗的肿瘤细胞(82年]。
此外,遵循cell-remodeling, EMT和转移性/入侵属性获得肿瘤细胞被肿瘤坏死因子暴露在刺激相结合α+雌激素+ EGF,我们确定的迁移功能细胞。我们利用MCF-7高能力的细胞形成tumor-spheroids和分析癌症细胞的能力从球状体分离,远离他们。为此,我们成立了tumor-spheroids,然后介绍了联合刺激额外的24 - 96小时。这些测试表明,控制,non-stimulated细胞,使组织球形结构在整个课程(图96小时时间9(一个))。相比之下,癌细胞暴露在合并后的刺激已经迁移出tumor-spheroids(图48小时后刺激9 (b))。在96小时的时间点,广泛向外迁移是TNF的观察α+雌激素+ EGF-stimulated细胞,发现很大一部分单个细胞(细胞生存能力测试表明,这些单个细胞还活着)(图9 (b))。在这里,有趣的是,单个细胞迁移的tumor-spheroids形成的肿瘤坏死因子的存在α+雌激素+ EGF刺激表达低水平的上皮细胞相比仍在(表球状体1和图S3)。这些结果提供了一个直接联系的过程提升EMT和迁徙事件所诱发的肿瘤坏死因子的刺激相结合α+雌激素+ EGF。
(一)
(b)
3.4。在活的有机体内动物研究表明,肿瘤细胞肿瘤坏死因子的刺激α+雌激素+ EGF获得高转移性能力
这一研究提出了迄今为止的结果表明,肿瘤细胞暴露在刺激相结合获得属性,可能导致肿瘤的生长和转移。这些结果促使我们决定肿瘤坏死因子的影响α+雌激素+ EGF刺激乳腺脂肪垫主要肿瘤的形成和转移的传播。使肿瘤细胞的检测完整的动物,MCF-7表达荧光蛋白mCherry细胞被感染。肿瘤细胞被肿瘤坏死因子刺激了三天α+雌激素+ EGF在体外然后洗去除刺激器和接种小鼠的乳腺脂肪垫。因为MCF-7细胞对肿瘤坏死因子敏感α全身的细胞毒性(图S2) (73年- - - - - -75年),后三天TNF的刺激α+雌激素+ EGF,我们保证相同数量的生活刺激和non-stimulated细胞接种的老鼠。肿瘤细胞接种后,大师设备提供了数据上的macro-metastases原发性肿瘤的大小和外观完整的老鼠,在分析在四个时间点进行的实验(37天)。
的结果图10(a1)表明,细胞暴露在刺激肿瘤坏死因子相结合α+雌激素+ EGF有较小的肿瘤比控制non-stimulated细胞,由于可能的原因(部分进一步描述4)。然而,一个完全不同的图片显示转移形成时解决。考虑到这一事实特征明显MCF-7细胞nonmetastatic细胞(45,83年),这是令人兴奋的发现肿瘤坏死因子的刺激相结合α+雌激素+ EGF文化引发了三天的高转移细胞的能力在活的有机体内。正如所料,控制细胞没有形成macro-metastases,但相比之下的肿瘤细胞暴露于TNFα+雌激素+ EGF刺激引起macro-metastases在38%的动物(数字10(a2),10(b)10(c)),决定在2个独立的实验重复显示了类似的结果。Macro-metastases也在2/3发现老鼠在另一个实验中,non-stimulated细胞并不包括在内。形成的macro-metastases TNFα+雌激素+ EGF-stimulated细胞被发现在肝脏、结肠、腹部(图10(d)显示转移在肝脏和结肠)。
实际上,联合刺激的影响的转移潜力MCF-7是戏剧性的:肿瘤细胞暴露在这种刺激仅三天在文化、和基于我们的在体外结果只有一个分组人口(基于图5~ 50%的细胞)获得了肿瘤和转移能力文化(数字4- - - - - -6)。此外,在其他在活的有机体内研究我们表现oncogene-expressing MCF-7细胞被肿瘤坏死因子刺激α(老鼠也与CM的细胞注射每周)表明TNF的转移负载细胞的刺激α+雌激素+ EGF比肿瘤坏死因子诱导的高α(数据没有显示)。综上所述,肿瘤坏死因子的影响α+雌激素+ EGF刺激这些细胞的转移功能在活的有机体内主要的重要性和较高的临床意义。
4所示。讨论
在这项研究中,我们证明了结合promalignancy因素显著影响腔的肿瘤细胞的能力获得metastasis-related属性和传播到遥远的器官。当单独使用时,肿瘤坏死因子α比其他两个更有效的代表肿瘤microenvironment-estrogen egf与它的活动是有说服力地增加了配合这两个因素。因此,它是这三个的联合活动手臂together-inflammatory,激素,在著名的功效和growth-supporting-that毁灭性的肿瘤细胞扩散的过程,EMT和转移。
我们的研究结果表明,由于肿瘤坏死因子的刺激相结合α+雌激素+ EGF,腔的乳腺癌肿瘤细胞获得了广泛传播表型的Src激活了肿瘤细胞扩散和本地化的FAK和桩蛋白在肿瘤细胞突起。同时,癌细胞相互脱离,接受了metastasis-relevant EMT和迁移的过程。由于肿瘤坏死因子α+雌激素+ EGF刺激新细胞亚型主导肿瘤细胞群,表达高水平的VLA6和metastasis-related粘附分子CD44和β1、伴有高水平的CXCL8 CCL2,释放的细胞基质金属蛋白酶。基于发表的发现(84年- - - - - -87年),海拔β1、CD44和CXCL8很可能站在高耐阿霉素的基础所获得的肿瘤坏死因子α+雌激素+ EGF-stimulated细胞。
上述特征所获得的肿瘤细胞暴露于TNFα+雌激素+ EGF导致一个有趣的在活的有机体内表型,刺激细胞产生了规模较小的本地肿瘤但表示非常高转移性比控制non-stimulated细胞表型。基于在体外前面描述的结果,两个非独家的机制可能会导致这样的结果:(1)的三刺激器的肿瘤细胞,肿瘤坏死因子α是唯一一个是细胞毒性而雌激素和EGF刺激肿瘤细胞生长。在这项研究中使用的肿瘤细胞(MCF-7细胞),对肿瘤坏死因子敏感α全身的细胞毒性(73年- - - - - -75年];因此,大约40%的肿瘤细胞被杀在体外由他们暴露在刺激肿瘤坏死因子相结合α+雌激素+ EGF(图S2)。虽然只活细胞注射后刺激(在相同数量来控制细胞)事先老鼠和刺激了,有些肿瘤细胞可能注定要死去以后,后引入鼠标。这些细胞毒性肿瘤坏死因子的影响α可能导致减少原发性肿瘤的增长。(2)高传播、EMT和迁移表型在癌症细胞肿瘤坏死因子α+雌激素+ EGF刺激可能会导致肿瘤细胞的迁移主要集中接种后不久乳腺脂肪垫(插图在体外在图9);因此,肿瘤的细胞培养液发达是刺激后引起了小比控制non-stimulated原发肿瘤细胞。这样的机制是在良好的协议与高转移性肿瘤坏死因子的产量α+雌激素+ EGF-stimulated细胞(图10)。显然,这样的机制表明,这将是有趣的确定原发肿瘤中EMT属性建立了non-stimulated控制细胞相比,细胞刺激肿瘤坏死因子α+雌激素+ EGF。
总的来说,我们的研究结果表明,一些癌细胞被肿瘤坏死因子刺激α+雌激素+ EGF部分死于肿瘤坏死因子的细胞毒性效应α和其他迁移的初始肿瘤接种体,导致较小的主要肿瘤比控制生成的细胞。但与此同时,这些细胞获得了许多metastasis-promoting属性,成为咄咄逼人在活的有机体内。因此,小肿瘤生长赋予TNFα+雌激素+ EGF刺激提供了虚假的好处,因为它导致了选择的细胞表达高转移潜能。在这里,重要的是要注意,在异构的肿瘤细胞,只有一些获得高“spreading-EMT-metastasis”有关的功能,这可以解释为什么转移没有形成老鼠。然而,我们想强调,收购MCF-7转移能力的细胞本身极其独特而重要的,即使不是在所有小鼠观察。MCF-7细胞被认为是完全nonmetastatic,甚至强大的原癌基因表达如h后,他们没有获得形式转移的能力在活的有机体内,尽管增加侵袭性在体外(83年]。
因此,我们的研究结果表明,在某些conditions-endowed通过刺激相结合的三个武器microenvironment-MCF-7肿瘤细胞转移。在我们的在体外分析,肿瘤坏死因子α所有三个元素是最有效的,但其活动会使雌激素和EGF。基于这些研究,我们建议TNFα的因素是主导高protumoral表型和响应,导致最极端的对肿瘤细胞的影响蔓延到遥远的器官。
总体而言,尽管肿瘤坏死因子α有能力发挥细胞毒性作用可以降低肿瘤的生长,它与肿瘤微环境的其他两个部门合作,最终变成了一个metastasis-promoting实体。在这里,重要的是要注意,所有三个factors-TNFα、雌激素和EGF-are经常表达在乳腺癌患者腔的乳腺肿瘤。过去我们实验室的研究表明TNFα表示在大约90%的患者复发性疾病,很多患者也表达,因此过量(22]。其他研究表示,约有70%的乳腺癌肿瘤表达配体表皮生长因子(88年]。综上所述,这些观察结果表明,相对较高的族群的腔的乳腺癌患者可能经历coexposure TNFα+雌激素+ EGF可能因此获得转移率增加。此外,根据我们的研究结果与阿霉素耐药性,一起三个因素的共同力量可能会进一步增加抵抗化疗在乳腺癌患者中,展示了另一个层面的接触肿瘤坏死因子相结合α+雌激素+ EGF可能是毁灭性的病人。
5。结论
提出了研究结果有很高的临床意义。直到十年前,许多研究人员建议引入TNFα作为一个代理在癌症治疗因其细胞毒性的活动。然而,越来越多的证据使肿瘤坏死因子α在股权作为一个关键肿瘤促进因素有害影响恶性肿瘤的级联。我们的发现指出毁灭性的TNFα活动的生命阶段转移的形成,而这些发现对乳腺癌的治疗产生深远的重要性。肿瘤坏死因子α抑制剂,如英夫利昔单抗和栏已经被fda批准,被成功地应用于临床治疗的自身免疫性疾病(89年- - - - - -92年]。因此,我们建议考虑的这些肿瘤坏死因子α抑制剂对腔的乳腺癌患者的治疗方案。
具体来说,我们建议把这项研究的结果更进一步,对个性化的癌症治疗。知道抗激素治疗和表皮生长因子受体抑制剂/ HER2已经用于治疗乳腺癌的93年,94年),我们建议患者诊断为高TNFα、雌激素和EGF水平将受益于针对这三个武器同时,临床医生应考虑用鸡尾酒治疗这类病人的可能性的三个模式:TNFα抑制剂+ +表皮生长因子受体抑制剂/ HER2 antihormonal疗法。
显然,还需要大量的研究来评估肿瘤坏死因子的影响α抑制剂对乳腺肿瘤细胞在体外和在活的有机体内,设计适当的临床管理模式。然而,我们相信,范式转变提出了研究肿瘤坏死因子的角色α在转移可能有强烈的影响在未来治疗的选择。阻断肿瘤微环境的几个武器的可行性在一起不应该被忽略,并减少癌症相关的炎症也可能减弱肿瘤促进作用的肿瘤微环境的其他武器,从而抑制肿瘤细胞迁移和入侵和毁灭性的结果,转移的形成。
缩写
| 前言: | 抗体 |
| CM: | 条件培养基 |
| DMSO溶液: | 二甲亚砜 |
| 表皮生长因子: | 表皮生长因子 |
| 表皮生长因子受体: | 表皮生长因子受体 |
| EMT: | Epithelial-to-mesenchymal过渡 |
| 呃: | 雌激素受体 |
| 流式细胞仪: | Fluorescence-activated细胞排序(流式细胞术) |
| FAK: | 粘着斑激酶 |
| 合: | 辣根过氧化物酶 |
| 基质金属蛋白酶: | 基质金属蛋白酶 |
| 公关: | 孕激素受体 |
| 存在: | 定量实时聚合酶链反应 |
| 肿瘤坏死因子α: | 肿瘤坏死因子α |
| PFA: | 多聚甲醛 |
| DAPI: | 4′,6-Diamidino-2-phenylindole。 |
利益冲突
作者披露任何潜在的利益冲突。
承认
作者承认金融支持提供给以色列卫生部和费德里科•本研究的基础。
补充材料
补充图1:结合肿瘤坏死因子的刺激α+雌激素+ EGF比雌激素+肿瘤坏死因子更有效α或雌激素+ EGF诱导广泛的乳腺癌肿瘤细胞形态变化和传播。
补充图2:结合肿瘤坏死因子的刺激α+雌激素+ EGF导致减少乳腺肿瘤细胞文化的生存能力。
补充图3:乳腺肿瘤细胞迁移的tumor-spheroids TNFα+雌激素+ EGF刺激,水平的钙粘蛋白表达减少。