位点选择性人工核糖核酸酶:催化结构域含有多个咪唑残基的寡核苷酸缀合物

摘要

位点选择性人工核糖核酸酶的设计是RNA靶向研究中最具挑战性的课题之一。在这里，我们设计并研究了含寡核苷酸的aRNases多个催化部分的咪唑残基和系统的结构多样的裂解结构。我们证明了核糖核酸酶活动的配合强烈影响的咪唑残留催化,催化咪唑组之间的连接器的长度的构造和寡核苷酸,和锚的类型组,连接链接器结构和寡核苷酸。对最活跃的aRNases的分子模拟表明，断裂结构的最佳取向强烈依赖于锚基的结构和连接子的长度。脱氧核糖胸腺嘧啶锚定组的加入显著降低了裂解组位于裂解位点附近的概率，可能是由于与邻近的核苷酸残基的叠加相互作用。综上所述，动力学因素在位点特异性RNA切割中起重要作用。具有最灵活和最广泛的裂解结构的缀合物表现出了非常高的裂解活性，这可能为咪唑残基正确定位在分裂的磷酸二酯键附近提供了更好的机会。

1.介绍

位点选择性人工核糖核酸切酶的概念，它能够切割任何特定的RNA序列在体外和在活的有机体内这是一种非常有吸引力的方法，因为除了在分子生物学中是有用的工具外，这些化学核糖核酸酶有望有助于靶标验证，甚至有助于开发潜在的抗病毒或抗癌疗法。理想的位点选择性人工核糖核酸酶应是易于合成、化学稳定性好、靶向任意RNA序列并能高效裂解磷酸二酯键的化合物。基于寡核苷酸的人工核糖核酸酶似乎符合这些标准中的大多数，因为它们可以通过控制寡核苷酸识别部分的序列，以特定位点的方式定向到几乎任何所需的RNA区域。

几乎所有已知能催化RNA剪切的活性基团都已被用于设计和制备人工核糖核酸酶[1- - - - - -3.］．寡核苷酸和RNA裂解基团的偶联物可以使用两种主要方法合成:在标准合成过程中在寡核苷酸中加入催化结构或通过无保护寡核苷酸的合成后衍生化[4］．可提供各种策略的几个替代程序。第一方法通常涉及自动寡核苷酸合成，当合适保护的核苷和催化基团的磷酰胺用作建筑物块时。包含各种金属配合物的单体积木[5- - - - - -8或咪唑基结构[9- - - - - -16]已经被提出用于合成基于寡核苷酸的人工核糖核酸酶。在同一固相载体上连续合成寡核苷酸和催化结构的共轭物是这一方法的一个有前途的变化[17- - - - - -19］．然而，由于必须在每个特定情况下合成相应的催化结构的独特磷酰胺衍生物的必要性，这种方法不适合缀合物的大多数潜在用户，这产生了与选择适当的保护组相关的问题去保护程序。

各种RNA切割催化剂已束缚到寡核苷酸的5'末端。但是，除了几个例子之外，可用的合成方法[20[允许每种磷酰亚胺单位仅掺入单一功能部分。通常，通过将适当保护的和活化的构建体直接掺入标准固相合成的结束或通过后衍生化的5'-末端以两种方式以两种方式实现。在前一种情况下，高度修饰的寡核苷酸的合成可能变得有些问题，因为预期多种掺入的增加会显着降低共轭寡核苷酸的总产率。或者，首先可以通过使组装的寡核苷酸的5'-OH基团与亚磷酰胺部分和反应性组的异双官能试剂（第一改性剂）反应来形成前体分子。然后用适当的功能添加剂（第二种改性剂）后衍生前体寡核苷酸的反应基团进行后衍生化[21，22］．这种前驱体策略具有明显的优势，即同一母体化合物可用于合成许多不同的栓系产物。使用前体技术制备的第一代人工核糖核酸切酶，最近被报道具有很高的切割活性[23，24］．前体方法似乎是有利的，用于合成含有不同官能团的寡核苷酸缀合物的文库。

然而，到目前为止，这些人造核糖核酸酶的切割活性在靶向和/或切割效率方面已经差不等于自然对应物。我们预期这些寡核苷酸的人造核糖核酸酶的RNA切割的高效率仅可以实现，如果完成结合和催化的所有基团的最佳布置。通过考虑裂解基团的最佳结构及其对RNA靶标的相互空间取向的最佳结构，可以通过迭代设计来改善粘合和切割结构域的迭代设计。人造核糖核酸酶的结构组织和其切割构建体的动态行为似乎是有助于这些化合物的切割活性的关键因素。

几年前，我们报道了一种新型的寡核苷酸型氨氮酶国际清算银行-咪唑裂解结构，采用前驱体技术制备。它被证明是高度活跃的国际清算银行-咪唑裂解结构非常灵活，磷酸二酯键的裂解似乎是一个随机事件，当这些催化基团接近分裂的磷酸二酯键时，每次裂解的效率都很高[23，24］．在本论文中，我们利用发展的前驱体方法合成了具有不同结构的具有多个咪唑残基的催化裂化结构的aRNases支架。我们在这里证明，其中一些缀合物在tRNA中表现出非常高的裂解活性^{板式换热器}共轭杂交和识别可能的位置的分裂群(s)相对于剪刀^{5 '}C63-A64网站。在这里，我们还表明，缀合物的切割活性是由催化结构的内在特性决定的，而不是由DNA:RNA杂交的详细结构决定的，这在所有的实验中都是一样的。

2.材料和方法

2．1．一般的化学物质

实验中使用的所有缓冲液都是用milliQ水制备的，含有0.1 mM EDTA，并通过孔径为0.22的过滤器过滤μ.m（millipore）。[5'-³²P]-pCp来自俄罗斯Biosan Co.。T4 RNA连接酶购自Fermentas (Lethuania）.寡核苷酸TGGTGCGAATTCTG (一个)及GATCGAACACAGGACCT (B)在ASM-700 DNA合成器(Biosset, Russia)上，采用标准固相磷酰胺法合成。酵母tRNA^{板式换热器}是G. Keith博士(法国斯特拉斯堡生物研究所Moléculaire et Cellulaire du CNRS，法国斯特拉斯堡)慷慨的礼物。Methoxyoxalamido(氧化物)修饰符米用于共轭合成的，如[21，24］．

2．2.B-Im(n) 1型、2型、3型和4型寡核苷酸偶联物的合成

DeoxyribooligonucleotideB(GATCGAACACAGGACCT)采用标准固相磷酰胺化学合成，除dC^热晕-磷酰胺被dC取代^交流-phosphoramidite。在自动合成的最后，核心17-mer与一个修饰剂偶联米(1型、2型、3型或4型;参见图1)在0.2 M乙腈中浸泡15分钟。制备的寡核苷酸MOX前驱体在20℃下用2 M组织胺溶液在二甲基甲酰胺中持续振荡3小时，然后用氨去保护，生成含有多咪唑催化结构的寡核苷酸缀合物。结合物在16%聚丙烯酰胺/8 M尿素凝胶变性条件下经电泳纯化。用ESI和/或MALDI MS对纯化的共轭化合物进行分析(计算和实验的分子质量值列于图中1）.当MALDI-MS分析由于共轭物断裂而不能产生预期的质谱时，在变性条件下对共轭物进行电泳分析(图)1(c))和HPLC(未显示原始数据)。缀合物被称为B-Im (N / m)，其中B-Im对应于寡核苷酸B并表明IM在催化部分中，n是咪唑残基（从2至32）的数量，M对应于锚基（1,2,3或4;见图1(a))。

2．3.劈理的tRNA^{板式换热器}与寡核苷酸轭合物

[3 ' -³²P] trna^{板式换热器}按照中所述制备和纯化[24］．3 '端标记tRNA溶于水，−20℃保存。[³²P] trna^{板式换热器}是cpm / pmole。

标准反应混合物(10μ.L)含咪唑缓冲液(50 mM咪唑缓冲液，pH 7.0, 200 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 100μ.g/mL总tRNA大肠杆菌航空公司),M [3 ' -³²P] trna^{板式换热器}，寡核苷酸偶联物之一B-Im (N / m)在浓度范围内来 M (as indicated in the legends in the figures). Reactions were carried out at 37°C and were quenched by precipitation of tRNA and tRNA fragments with 150 μ.2%的高氯酸锂溶液在丙酮中。离心收集RNA，用6 M尿素、0.025%溴苯酚蓝、0.025%二甲苯三聚氰胺缓冲液溶解。用12%聚丙烯酰胺/8 M尿素凝胶电泳分析tRNA裂解产物。为了识别裂解位点，使用咪唑阶梯[24]和部分tRNA与RNase T1裂解产生的G-ladder [25是并行运行的。为了获得定量数据，凝胶干燥并使用分子成像FX (Bio-Rad)进行分析。RNA切割的总程度是根据tRNA片段的放射性与凝胶通道上的总放射性的比值来确定的。

测量tRNA与寡核苷酸结合物的裂解动力学B-Im (N / m)， 100的反应混合物μ.L中含有咪唑缓冲液，米3 ' - (³²P] trna^{板式换热器}和一种寡核苷酸结合物B-Im (N / m)在不同的浓度（来自来米)。反应在37℃进行。在指定的时间间隔内，一个aliquot (10μ.L)将反应混合物取出并冷冻以备新测定。反应等价物解冻，立即用150沉淀μ.L 2%高氯酸锂在丙酮中。然后，对反应混合物进行如上所述的分析。

在一些实验中，咪唑缓冲液被HEPES缓冲液（50%）取代 mM HEPES-KOH，pH值7.0；0.2 M KCl，0.1 毫米乙二胺四乙酸，100 μ.g/mL rna载体)，或Cacodylic buffer (50mm Cacodylic acid-KOH, pH 7.0;0.2 M氯化钾，0.1 mM EDTA, 100μ.g/mL rna载体)或Tris-HCl缓冲液(50 mM Tris-HCl, pH 7.0;0.2 M氯化钾，0.1 mM EDTA, 100μ.g / mL RNA-carrier)。用其他缓冲液替代咪唑缓冲液的实验用文字和图形图例说明。

２.４.抑制位点选择性tRNA^{板式换热器}寡核苷酸竞争者裂解

在竞争实验中，对反应混合物（10 μ.L)含咪唑缓冲液;米3 ' - (³²P] trna^{板式换热器}寡核苷酸一个（TRNA的序列62-76互补^{板式换热器})或寡核苷酸B和浓度有关吗M。The mixtures were incubated for 10 min at 37°C, then one of oligonucleotide conjugatesB-Im (N / m)在浓度加入M, 37℃孵育不同时间(30 min ~ 2 h)。如上所述，对反应进行了淬火和分析。

2．5．寡核苷酸B与B- im(4/2)结合到tRNA杂交的凝胶-迁移位移分析^{板式换热器}

tRNA的凝胶迁移率测定^{板式换热器}绑定与寡核苷酸B和配合B-Im (4/2)进行如下操作。[3 ' -³²P] tRNA (M)在37°C反应混合物中孵育30分钟(10μ.L)含有杂交缓冲液(50 mM Tris-HCI, pH 7.0, 200 mM KCI, 0.1 mM EDTA)和寡核苷酸B或缀合物B-Im (4/2)浓度范围从来M。孵化后,8μ.在每个探针中加入L的加载缓冲液(50%甘油，0.025%溴苯酚蓝，0.025二甲苯氰)，探针立即用100 mM三硼酸盐，pH 8.3作为运行缓冲液，在4°C预平衡3 h，应用于运行的10%天然PAGE上。电泳在4°C，在450v下进行5小时。为了获得定量数据，凝胶干燥并使用分子成像FX (Bio-Rad)进行分析。

2.6。分子模拟

使用sybyl6.6 (TRIPOS Inc.)在Silicon Graphics O2工作站进行分子建模，如[24］．进行了所有计算(MM/MD)在真空内使用Kollman-所有力场参数和距离相关的介电常数等于4.模型分子的建筑物（见图1)是分三个阶段进行的。首先，使用BIOPOLYMER/SYBYL 6.6构建A-like DNA:RNA杂交。第二，催化碎片Im (4/1)，Im（4/2a）,Im（4/2b）是使用SKETCH/SYBYL 6.6构建的。在几何优化后，使用半经验MO程序MOPAC计算这些结构的电荷分布。在最后一步中，每一个相应的剪切片段通过G1核苷酸残基的末端5 ' -磷酸基连接到DNA:RNA杂交。

对于每个分子，都创造了几个不同的起始结构，不同的构象和分裂基团的位置，相对于DNA从“内”到“外”的极端位置:RNA杂交。以DNA:RNA杂合体为固体体，将每个分子的起始结构最小化，梯度收敛为0.05 Kcal/mol。每个启动结构分别进行12ps的MD运行，模拟退火如下。系统在2秒内加热到600 K，然后在10秒内逐渐冷却到100 K。对收敛标准进行了最终最小化，得到了每种分子的最终构象。共轭名称前的S和F符号分别表示起始构象和最终构象。

每个模型分子(O1-Im4/1, O2-Im4/1 O1-Im4/2a, O2-Im4/2a, O1-Im4/2b，和O2-Im4/2b，其中Type1显示锚定组1)的“活性构象”使用类似的模拟退火协议获得。在这些分子中，切割基团被故意定位在最有利的位置，以成功的切割在C₆₃——一个₆₄地点。即，咪唑残基的N1之间的距离和2'OH组的距离₆₃为~ 3Å，其他咪唑残基N1与磷酸基的氧之间的距离，连接C₆₃和一个₆₄，约为3Å [26，27］．使用上述协议，在没有约束的情况下执行最终的最小化。

3.结果与讨论

3.1。基于寡核苷酸的人工核糖核糖酶设计

RNA裂解寡核苷酸偶联物的两步制备方法见[21，22］．在第一步中，前体17-mer GATCGAACACAGGACCT (B)由多种不同类型的甲氧基草酸酰胺(MOX)修饰剂构建(参见补充材料在线http://dx.doi.org/10.4061/2011/748632本研究合成的所有共轭化合物的结构)。在第二步中，将制备的寡核苷酸- mox前体与组胺官能团化，在去保护步骤后得到寡核苷酸缀合物B-Im (N / m)，在5 '端含有4到32个组胺残基。

数字1提供寡核苷酸缀合物的结构B-Im (4 / n)和B-Im (8/1)在此工作中学习。这些结合物以后被称为B-Im (N / m)，其中B-Im表示寡核苷酸 - 咪唑缀合物，N显示咪唑残基的数量，M表示锚组的类型。在此情况下，当两三个缀合物含有相同数量的咪唑残基和相同的锚组时，缀合物数示于支架中。通过改变锚和接头基团的结构来改变裂解部分的寡核苷酸和咪唑残留物之间的距离。作为缀合物类型的锚基将环己基残基被利用。胸苷核苷用于将催化部分固定在缀合物类型2.蛋白核苷中，呈现在缀合物的结构中，应该参与与RNA的基础配对或可能堆叠在Wateroduplex上有助于双工稳定性。在缀合物3型中，锚基是模拟磷酸二酯键的化学构建体，并用作寡核苷酸中的非核苷酸插入的规则。在共轭物中使用型锚组10- - - - - -13增加分枝数，承载咪唑残基。为了达到这一目的，并增加连接器的长度和灵活性，类型1和2的锚组也被纳入到连接器结构中(见图1- sm，共轭6- - - - - -9和11- - - - - -13）.此外，还充分区分了化合物之间连接咪唑残基和锚点的长度和结构(见表)1和图1-SM)。例如，含有等量咪唑残基的共轭物，B-Im (4 / m)或B-Im (8 / m)，不仅锚组不同，而且连接长度也不同。共轭的连接器B-Im (4/3)是最短的一个。在这个共轭中，四个咪唑残基不对称地放置在形成锚的磷酸基上，连接寡核苷酸B以及分裂结构。

共轭物的特性通过质谱法得到确认；（见图1）.此外，通过12％Paam / 8M尿素凝胶中的电泳证实了缀合物的纯度（图1(c))。可见，该共轭物的纯度接近95%。只有在共轭情况下2，5，10,16，还可以看到其它相对强度为5-7%的波段。

3．2.酵母tRNA的裂解^{板式换热器}通过携带多个咪唑残基的共轭物

酵母tRNA^{板式换热器}被故意选择作为一个目标来评估缀合物的裂解活性。这背后的理由是，其他基于寡核苷酸的aRNases，包括三种使用前体方法制备的，已经使用该靶标进行了测试[1，12，14- - - - - -16，28］．数字2(a)为酵母tRNA的三叶草结构^{板式换热器}显示共轭的目标位置B-R (N / m)．所研究的aRNases的识别元件以17聚寡核苷酸为代表B，与序列44-60互补，目的是将咪唑残基传递到序列上⁶¹CACAG⁶⁵在TRNA的T臂中^{板式换热器}，它对乳沟高度敏感[29- - - - - -32］．之前的研究表明，寡核苷酸B能有效地结合到tRNA中的这个序列上吗^{板式换热器}，导致整个TΨC发夹的展开，而tRNA的氨基受体和反密码子茎只受到寡核苷酸结合的轻微影响[33- - - - - -35］．

的配合B-Im (N / m)通过酯交换反应催化RNA裂解。为了比较偶联物的核糖核酸酶活性，我们使用了单次反应翻转的条件([B-Im (N / m)) > (RNA))。偶联物的寡核苷酸部分提供了与tRNA靶序列的高效杂交^{板式换热器}形成稳定的异质双相(K_d= 7μ.M±1μ.M;V. Petyuk，未发表的数据）。我们认为，在实验条件下，靶的位点选择性裂解的速率和效率仅受缀合物的催化部分影响。

[3'-的部位选择性裂解³²P] tRNA^{板式换热器}在37°C 50 mM咪唑缓冲液中进行。该反应是由共轭物的加成引起的B-Im (N / m)反应混合物。切割位点的定位是通过比较结合物切割tRNA的产物与随机RNA切割的产物与RNase T1和2m咪唑缓冲液，pH 7.0进行比较[25，36］．数字2(b)显示tRNA分析的典型结果^{板式换热器}结合物裂解B-Im (N / m)在37°C的标准条件下。在没有试剂和未修饰的双亲寡核苷酸存在的实验条件下，tRNA的自发降解无法测量B发生(图2（a） 共轭体切割tRNA^{板式换热器}主要在C63-A64和A64-G65的磷酸二酯键上。tRNA的范围^{板式换热器}这些键的裂解率分别为70%和20%。此外，在目标序列内的磷酸二酯键C61-A62和A62-C63上可以观察到轻微的断裂(图)2(一)、车道1 - 10)。tRNA在目标序列中靠近的磷酸二酯键上的裂解产物之间的比例似乎与这些键与共轭B-Im的裂解的空间可及性(N/m)相对应。在共轭的情况下B-Im (4/2a)(在16、24和32个咪唑残基的结合物中观察到类似的裂解)，在U8-A9和C75-A76磷酸二酯键上观察到轻微的裂解(少于tRNA裂解总程度的3%)，也就是酵母tRNA中的C61-A62和C63-A64键^{板式换热器}对各种因子的分裂非常敏感[29- - - - - -32］．U8-A9键位于tRNA的三级结构序列C61-G65附近^{板式换热器}因此，我们可以假设观察到的这种键的断裂发生在共轭形成的互补络合物中B-Im (N / m)此外，我们可以假设磷酸二酯键C63-A64的初始断裂会在tRNA分子中产生缺口，这可能会增加复合tRNA结合物的柔韧性B-Im (N / m)从而使磷酸二酯键C64-G65和U8-A9可用于催化剂的功能基团。在C75-A76位点观察到的轻微劈裂明显是tRNA在与共轭物的双链中自发水解的结果。

通过竞争实验证明tRNA的裂解发生在tRNA-conjugate复杂。tRNA^{板式换热器}劈理的共轭B-Im (4/1)是在两种类型的寡核苷酸抑制剂存在下进行的:亲本寡核苷酸B和寡核苷酸一个与序列61-75互补(图2(b),车道17 - 19)。不出所料，tRNA的裂解^{板式换热器}通过共轭B-Im (4/1)在寡核苷酸存在下显着降低B(原始数据未显示)，在寡核苷酸存在时完全消除一个，通过双工形成保护目标序列。值得注意的是在寡核苷酸存在下B， tRNA的裂解^{板式换热器}是抑制所有位点由于竞争结合，而寡核苷酸一个抑制tRNA^{板式换热器}仅在目标序列上进行裂解，而不会改变其他位点的反应速率。这些结果表明了切割的结构特异性，并强调了切割只发生在单链目标序列的事实。

数字2(c)显示共轭物的裂解反应的浓度依赖性B-IM（4/1）（3.）和Im (24/4 + 2)（11)(分别为曲线1和曲线2)和共轭的结合B-Im (4/2a)和家长寡核苷酸B与tRNA(分别曲线3和4)。可见，解理数据与杂岩的形成是一致的。此外，在相同条件下研究的亲本寡核苷酸和偶联物的结合亲和力是相似的(图)2(c))。因此，含有咪唑的反应基团与寡核苷酸的共轭并不影响杂化过程。

为了评估缓冲液对RNA位点选择性切割效率的影响，我们比较了tRNA^{板式换热器}共轭解理B-Im (4/2)在不同的缓冲溶液中(图2（d） ）50 mM咪唑缓冲液，pH 7.0作为标准条件。位点选择性切割的速率受50个氨基酸替换的影响 mM咪唑缓冲液，pH 7.0，50 mM Tris-HCl缓冲液或50 pH值为7.0的mM二甲酰化缓冲液的系数为1.5，表明咪唑本身可能有助于裂解反应。在较长的培养时间内，这种差异变得不显著，并且不超过估计的实验误差。令人惊讶的是，50 mM HEPES缓冲液完全消除了使结合物失活的裂解。原因还不完全清楚。一种解释可能是HEPES的磺酸[4-（2-羟乙基）-哌嗪-1-乙磺酸]可能与共轭物的质子化咪唑残基相互作用并使其失活。在此之前，我们还观察到，在50个样本中，含有两个咪唑残基的寡核苷酸结合物使RNA切割率降低了两倍 mM HEPES-KOH缓冲液，而其他缓冲液仅轻微影响RNA切割速率[37］．

在图中2， (a)为酵母tRNA的三叶草结构^{板式换热器}以及寡核苷酸的目标序列B基于人工核糖核酸酶B-Im (N / m)．粗体字母表示寡核苷酸竞争者的目标序列一个．箭头表示偶联物对tRNA进行位点选择性切割的位置;(b)表示tRNA的裂解^{板式换热器}与寡核苷酸轭合物B-Im (4 / m)．12%聚丙烯酰胺/8 M尿素凝胶的自放射线照相。裂解反应在37℃，50 mM咪唑缓冲液中进行，pH 7.0，含200 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 100μ.g / mL RNA载体,M [3 ' -³²P] tRNA^{板式换热器}和M是共轭的B-Im (4/1)，B-Im (4/2a),B-Im (4/2b)．平道L和T1分别是咪唑和RNase T1梯子。在不存在和寡核苷酸的情况下，在反应缓冲液中在反应缓冲液中孵育8小时，在寡核苷酸中孵育泳道C1和C2B（米)。tRNA通过共轭解理B-IM（4/1）（3.）对于0.5,1,3,5和8小时(车道1 - 5，对应)，通过共轭B-Im (4/2a) (4）对于0.5,1,3,5，和8小时(车道6-10)，由共轭B-Im (4/2b) (4 b）0.5, 1, 3, 7, 10，和18小时(车道11-16);的共轭B-IM（4/1）（3.）在寡核苷酸存在的情况下一个（)为0.5,1和5小时(车道17-19)。反应混合物中共轭物的浓度为M。反应s were quenched and analyzed as described in the experimental part;（C）表示tRNA的浓度依赖性^{板式换热器}结合物裂解B-IM（4/1）（3.）和B-IM（24/2）（12)(分别为曲线1和曲线2)，并与共轭形成络合物B-Im (4/2a) (4)(曲线3)和亲本寡核苷酸B(曲线4)。反应混合物在上述条件下孵育2 h;(d)代表缓冲性质对TRNA速率的影响^{板式换热器}共轭解理B-Im (4/2a) (4）．[3 ' -³²P] tRNA^{板式换热器}(0.5μ.M)与2μ.米的（4）， pH 7.0 (Tris)或50 mM HEPES缓冲液，pH 7.0 (HEPES)含0.2 M KCl, 0.2 mM EDTA和0.1 mg/mL RNA载体。

3．3.tRNA动力学^{板式换热器}共轭裂解

数字3(一个)显示了tRNA的动力学^{板式换热器}用研究中的共轭浓度伴随着缀合物的裂解 μ.由此可见，这些结合物对RNA的切割效果不同。最有效的共轭是B-Im (4/1)，因为在2-3小时内完成目标的位点选择性裂解。相似的动力学表现在共轭B-IM（8/1）（6）和B-Im (24/4 + 2)（12）.的配合B-Im (4/2a)（4),B-Im (8/2)（7）与...相比，催化RNA裂解B-Im (4/1)或B-IM（8/1）．缀合物的切割效率B-Im (4/3)（5)基本上很穷。

数字3 (b)显示TRNA的动力学曲线^{板式换热器}劈理的共轭B-Im (4/1)以不同浓度的缀合物获得。动力学曲线的特征证明了双分子反应：随着缀合物浓度的增加而增加了RNA裂解率。在缀合物的浓度下B-Im (4/1)10μ.M，几乎是定量结合tRNA, tRNA的半衰期约为1 h(图3 (b)曲线”10μ.M”)。当共轭浓度B-Im (4/1)增加到50μ.M、 tRNA的半衰期按分钟计算（图3 (b)，曲线“50 μ.M”)。需要注意的是，tRNA的位点选择性裂解比亲本寡核苷酸的结合要慢得多B在类似条件下的tRNA [33- - - - - -35］．当共轭物的浓度等于或两倍于tRNA的浓度时，曲线显示了滞后期(图3 (b)，曲线“0.5”和“1”μ.这表明，位点选择性RNA切割过程包括以可比的速率发生的几个连续步骤。另一种解释是，该反应具有更复杂的性质，并经历了共轭结合和裂解以外的一些阶段，从而形成类似于s型的动力学曲线。

对共轭B-Im (4/1)，我们计算了图中所示数据的关联率和裂解率常量3 (b)假设TRNA的切割发生在与缀合物的络合物内。在这种情况下，杂交步骤是二阶反应，切割阶段是分子内的一阶反应。事实证明了裂缝pe-se与RNA靶标内的互补序列结合相比，结合速度要快50倍(结合速率常数和切割速率常数分别为)M⁻¹年代⁻¹和(）年代⁻¹、职责)。换句话说，与tRNA结合是RNA位点选择性切割的限速阶段。

3．4．含多重咪唑基团的缀合物结构与活性的关系

偶联物显示不同的裂解活性1)从非常高的卵裂率(τ._1／2～1小时就是B-Im (4/1))降至非常低(τ._1／2在实验条件下未达到的情况下B-Im (4/3)）.结合物具有显著的裂解活性3.，6,12以及偶联物适度的裂解活性4，8，10，11,13共轭效率低5是否可能是由于偶联物催化部分结构的不同而不是由于杂化性质和裂解反应的不同pe-se．本研究的偶联物包含相同的寡核苷酸识别元件，具有相似的切割特异性，切割模式只有微小差异。因此，杂化和磷酸二酯键对裂解的敏感性都不能解释共轭物催化性能的差异。甚至偶联物的催化部分在某些情况下也含有等量的咪唑残基。

表格1总结了研究下共轭化合物的裂解活性和结构数据(连接长度为5个之间的简单C-C、C-N、C-O和P-O键的总数^/-末端的寡核苷酸B和咪唑残基，锚基类型，反应半倍)。可以看出，化合物的水解活性与其连接物的长度很好地一致(见表)1）.在含有四个咪唑残基的共轭物中，共轭物的裂解活性最高B-Im (4/1)它由41个简单键组成。的配合B-Im (4/2a)与29个化学键的连接显示3倍低的裂解活性，而B-Im (4/3)(18/24键)对tRNA的裂解效率最低。因此，逐步缩短共轭的连杆部分B-Im (4 / m)从41个单键到18个单键，切割效率从50% / h下降到1% / h。从表中可以看出1，只有含有40个单键的结合物才能有效催化tRNA的裂解^{板式换热器}以选择性的方式。因此，我们可以得出结论，对于RNA靶点的高效位点选择性切割，需要一个由40个或更多简单C-C、C-N或P-O键组成的长而灵活的连接子。

数字4显示结构活性结合物的相关性B-Im (N / m)．可以看出共轭物的裂解活性B-Im (N / 1)取决于催化部分中咪唑基团的数量（图4(一)）.含有4和8个咪唑残基的缀合物具有最高的裂解活性，而增加咪唑基团的数量则抑制了裂解。值得指出的是，在相同条件下，动力学曲线的s型度随共轭物中咪唑数目的增加而增加(原始数据未显示)。很可能这些共轭化合物的裂解活性受到咪唑之间的空间干涉的影响，从而导致裂解速率的损失。因此，四个(和/或八个)咪唑残基在催化部分似乎足以有效的RNA裂解。

从图中显示的数据4 (b)，可以看出，结合物的核糖核酸活性取决于用于将亲本寡核苷酸连接到rna裂解构建的锚基的类型。与类型1锚组(B-Im (N / 1))，环己基部分(图1(a))显示出更高的裂解活性，而不是以胸苷激酶残基的形式与锚定基团结合(类型2，图)1）尤其比与壬核苷锚组的缀合物（3型，图1)(表1）.2型与4型锚剂组的偶联物的裂解活性差异不超过实验误差，但可靠地低于1型锚剂组的偶联物。因此，连接部分的结构和灵活性、催化部分咪唑残基的数量、锚基的类型等都会影响共轭物的裂解活性，并对磷酸二酯键的裂解起到最佳定位的作用。

3．5．分子模拟研究

分子建模的主要目的是澄清以下问题。（1）在切割位点附近是否存在裂解组的任何优选的取向，这可以解释每个缀合物的水解活性（或其不存在）？(2）是否有任何证据表明，在裂解结构和DNA:RNA杂交之间的相互作用(s)，这可以稳定这些基团在裂解位点附近的更好方向(s) ?（3）裂解结构和连接基团的结构与水解活性之间的关系是什么?

很明显，从生化分析，水解活性在异质双工tRNA^{板式换热器}共轭是由裂解结构的内在特性决定的，而不是DNA-RNA杂交的详细结构，这在所有的实验中都是一样的。因此，主要的优先事项是确定裂解基团相对于裂解位点的可能位置，而不是确定杂化产物的详细构象(在没有相关NMR/ x射线数据的情况下，这是不可能的)。

早前已证明，长寡核苷酸与TΨC-loop [33，38或到3 ' -受体茎[33- - - - - -35]引起tRNA二级结构的局部展开。因此，我们假设所研究分子的杂化部分可以近似表示为双链DNA:RNA duplex，根据物理化学研究，其主要形成a -like构象[39- - - - - -41］．在我们的分子建模研究中，我们使用了一个缩短的异质双工模型，包括目标RNA序列(对应于^{5 '}tRNA的A44-U69片段^{板式换热器})和与此RNA区域结合的寡脱氧核糖核酸(图2(a))。

在此基础上，通过将各自的裂解结构连接到G的5 '端磷酸基上，构建了3个模型分子(M-Im(4/1)、M-Im(4/2a)和M-Im(4/2b))¹核苷酸残基(见图1和2）.在这个阶段，在杂化异质双工缺乏详细结构数据的情况下，将杂化异质双工视为“固体”结构是合理的[24，同时允许分裂结构在计算过程中具有完全的构象灵活性。

对于每个分子M-Im(4/1)、M-Im(4/2a)和M-Im(4/2b)，在裂解结构的空间方向上创建了几个不同的起始结构，从“内”到“外”极端(见“节”)2”)。这增加了每个模型分子的构象空间。所有的起始结构都进行了独立的模拟退火(见“节”)2)产生各自的最后结构(M-Im(4/1): F1-Im(4/1) -F9-Im (4/1);M-Im (4/2a): F1-Im (4/2a) -F9-Im (4/2a);M-Im (4/2b): F1-Im (4/2b) -F9-Im (4/2b)。

对每个最终结构的结构参数和能量值进行了分析，并与“活性”构象(O1-Im(4/1)、O2-Im(4/1)、O1-Im(4/2a)、O2-Im(4/2a)、O1-Im(4/2b)和O2-Im(4/2b))的结构参数和能量值进行了比较。20，26，27，42，43)(请参见”部分2）（表2）.

含有四个咪唑残基M-Im(4/1)、M-Im(4/2a)和M-Im(4/2b)的分子具有两个双咪唑裂解结构，其连接基团的几何性质不同(见图)1）.M-Im(4/1)的连接基团具有一个环己基片段，将裂解部分与寡核苷酸连接起来。在M-Im(4/2a)中，环己基片段被脱氧核糖苷片段取代。M-Im(4/2b)是M-Im(4/2a)的一个较短的类似物。

对于每个分子，通过模拟退火计算，获得了九个最终结构和两个“最佳”构象。咪唑环N1原子与目标位置之间的距离数据以及能量值如表所示2．

M-Im(4/1)(表2)，最有利的构象(O1-Im(4/1)， O2-Im(4/1)和F4-Im(4/1))的特征是至少两个咪唑基团的位置靠近靶点(3-7 Å)。在大多数情况下，M-Im(4/2a)构象在裂解位点附近至少有一个咪唑基团，这表明裂解基团很有可能形成预组织的“活性”构象。这些数据与高水解活性的生化分析相一致B-Im (4/2a)结合，表明该化合物达到人工核糖核酸酶的最大活性(49.8%)。数字5表示F4-Im(4/1)结构的片段，为M-Im(4/1)最有利的构象，并显示了可能的裂解基团方向。

在M-Im(4/2a)的情况下，模拟退火实验得到的大多数最终结构的特征是离目标位置有较远的分裂基团(表2)2）.例如，能量最低的结构F1-Im(4/2a)、F3-Im(4/2a)和F8-Im(4/2a)的咪唑裂解基团的方向在水解活性方面非常不利(见图)6以F1-Im(4/2a)最终结构为例)。这可能的原因可能是连接寡核苷酸和裂解结构的脱氧核糖苷片段的存在。根据我们的数据，胸腺嘧啶碱基参与了DNA:RNA螺旋结构，与邻近的核苷酸残基dG半堆积相互作用¹．胸苷激酶的碱基与双链结构很好地匹配，尽管没有检测到与相反链的额外氢键(例如，与A⁶²）.这种相互作用可以控制其余裂解结构的整体构象，并可能限制该基团的构象自由，导致产生“主动”构象的概率降低。这可以解释其相对较低的水解活性B-Im (4/2a)（16.6％）相比B-Im (4/1)．

甚至更明显的水解活性下降(下降到5-7%)的共轭B-Im (4/2b)的结构类似物B-Im (4/2a)与缩短的连接组。生化分析获得的数据与M-Im的分子建模结果一致(4/2b)(表2)，表明最有利的能量构象(例如，F2-Im(4/2b)， F3-Im(4/2b)和F5-Im(4/2b))的裂解基团相对于目标位点有较远的位置(图7显示F5-Im (4/2b))。而且，两个双咪唑基团中只有一个能占据位置，有利于裂解活性。这降低了M-Im达到“活性”构象的统计概率(4/2b)。一般来说，M-Im(4/2b)的最终结构主要表现为咪唑环与靶原子之间的距离较长。结构参数分析表明，连接基团的长度不足以提供良好的到达目标位置的机会。这可能是胸腺嘧啶与RNA:DNA的双链结构(见上面的M-Im(4/2a))相互作用限制构象自由的原因。综上所述，这些解释了最低的水解活性B-Im (4/2b)人工核糖核酸酶之间。

对模拟退火实验得出的最终结构的分析表明，所有裂解结构形成多个氢键的显著能力，这些氢键通常可以由两种类型(Scheme)表示1）.第一类是裂解结构体与RNA靶点之间的分子间相互作用，它是由RNA磷酸主链上的氧原子和(i)裂解基团的咪唑环或(ii)连接基团胺基的质子形成的1）.这些类型的氢键似乎有利于化合物的水解活性，因为它们能够稳定靠近RNA靶点的裂解基团的位置。第二种可能的氢键(Scheme1)是指裂解结构本身的分子内相互作用，涉及咪唑环与连接剂的酰胺基、羰基和磷酸基之间的相互作用。这种类型的氢键相互作用还包括由酰胺和羰基/磷酸基组成的链内桥。分子内氢键似乎与有利的分子间相互作用相竞争，阻止了咪唑基团与RNA主链的适当接触，这可能导致它们的水解活性降低。

基于这些结果，我们就如何进一步提高人工核糖核酸酶的切割潜力提出了几点建议。首先，为了减少分子内氢键的可能性，避免在连接体中使用任何羰基/磷酸基团非常重要。其次，引入聚核糖核酸酶可能是有利的连接体中的阳离子基团，这可能会增加切割基团与目标RNA带负电的磷酸主干的可能接触。最后，在连接体中插入合适的疏水/插层基团也可能会增加这些基团位于RNA目标附近的机会，因为添加l与不同核糖核苷酸环境的堆积/疏水相互作用。

4。结论

在目前的研究中，我们研究了基于寡核苷酸的人工核糖核酸酶多个咪唑残基位于aRNases的催化部分，具有系统不同的切割结构。所有结合物都含有相同的寻址寡核苷酸，可将结合物有效且几乎定量地结合到tRNA内的目标序列。这允许在tRNA中比较不同的切割结构RNA切割的位点特异性和效率。获得的结果让我们得出结论，位点选择性RNA切割的效率由许多动力学参数决定，其中最重要的是催化咪唑残基和寻址寡核苷酸之间连接物的灵活性。其他因素包括检测位点选择性RNA切割的效率是催化部分中咪唑残基的数量、锚基的类型、连接连接结构和寡核苷酸，以及构建体的催化咪唑基团和寡核苷酸之间的连接体的长度。我们发现四个咪唑残基位于当共轭物的催化部分位于RNA糖磷酸主链附近时，其催化部分可有效催化磷酸二酯键的裂解，而咪唑基团数量的增加可能由于咪唑残基之间的空间干扰而抑制裂解。

为解释共轭核糖核酸酶活性的差异而进行的分子建模表明，裂解结构的最佳取向强烈依赖于锚基的结构和连接子的长度。脱氧核糖苷作为锚定基团的加入，由于与邻近核苷酸残基的堆积相互作用，大大降低了裂解基团位于裂解位点附近的概率。具有最灵活和最广泛的裂解结构的缀合物表现出了非常高的裂解活性，这可能为咪唑残基正确定位在分裂的磷酸二酯键附近提供了更好的机会。

另一个影响RNA位点选择性切割效率的重要因素是RNA磷酸二酯键对切割的敏感性。不同的催化结构表现出一定的序列偏好[1］．另一方面，不同RNA序列中的磷酸二酯键对裂解剂表现出不同的敏感性[3.，44- - - - - -48］．在选择特定rna的靶位点时，应考虑这些因素。在我们的实验中，我们以tRNA的CACA序列为剪切基团^{板式换热器}众所周知，众所周知对不同剂的裂解感染。因此，在有利条件下比较缀合物的核糖核酸酶活性。另一方面，寡核苷酸缀合物与靶RNA的结合随后是RNA结构重排，其可以使靶位位点朝向催化基团的有利或不利的位置进行效果[32，49，50］．因此，优化寡核苷酸缀合物的催化基团结构，识别用于人工核糖核酸酶靶向的最佳RNA结构，可能有助于新一代高特异性人工核糖核酸酶的生成。

作者的研究结果揭示了开发高效RNA切割寡核苷酸偶联物所需要解决的问题。一些决定RNA切割功效的重要因素仍有待研究，以便寡核苷酸结合物利用天然酶的已知机制来实现高反应速率。

致谢

这项工作得到了欢迎信托基金(no。063630)， RFBR (nos. 02-04-48664和03-04-06238)，RAS计划“分子与细胞生物学”，俄罗斯科学和教育部(国家合同P438)，支持领先科学学校的总统计划SS-7101.2010.4。

补充材料

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