实验中使用的所有缓冲区使用milliQ准备水,含有0.1毫米EDTA,过滤器和过滤孔径0.22 μ米(微孔)。(5′-³²P]卡式肺囊虫肺炎是Biosan有限公司,俄罗斯。T4 RNA连接酶从Fermentas购买( Lethuania)。寡核苷酸TGGTGCGAATTCTG ( 一个)和GATCGAACACAGGACCT ( B)是合成asm - 700 DNA合成仪(Biosset、俄罗斯)标准的固相phosphoramidite程序。酵母tRNA^{板式换热器}从g·基斯博士是一个慷慨的礼物(生物研究所Moleculaire Cellulaire du CNRS,斯特拉斯堡,法国)。Methoxyoxalamido(氧化物)修饰符 米用于合成共轭准备中描述( 21, 24]。

Deoxyribooligonucleotide B(GATCGAACACAGGACCT)使用标准的固相合成phosphoramidite化学,除了直流^热晕-phosphoramidite取代直流^交流-phosphoramidite。结束时自动合成、核心17-mer加上修饰词之一 米(1型、2型、3型或类型4;参见图 1)在0.2年的乙腈为15分钟。准备的寡核苷酸氧化物前体被携带2 M组胺溶液在二甲基甲酰胺3小时20°C恒定摇晃跟着去与氨生产寡核苷酸轭合物包含multiple-imidazole催化结构。轭合物电泳纯化的16%聚丙烯酰胺/ 8 M尿素变性条件下凝胶。分析了纯化轭合物通过应急服务国际公司和/或MALDI女士(计算和实验值在图列出分子质量 1)。在MALDI-MS分析时没有产生预期由于共轭碎片在质谱分析,分析了轭合物电泳在变性条件下(图 1(c))和高效液相色谱法(主要数据未显示)。轭合物被指定为 B-Im (N / m),B-Im对应于寡核苷酸B和显示我在催化部分中,N是咪唑残留的数量(2 - 32),和m对应于锚组的类型(1、2、3或4;参见图 1(a))。

(3′-³²P] trna^{板式换热器}制备和纯化中描述( 24]。3′端标记tRNA溶解在水中,储存在−20°C。特定的放射性的³²P] trna^{板式换热器}是 5 × 10 5 cpm / pmole。

标准反应混合物(10 μL)含有咪唑缓冲区(50毫米咪唑缓冲区,pH值7.0,200毫米氯化钾,0.1毫米EDTA, 100 μ总tRNA从g / mL 大肠杆菌航空公司), 5 × 10 - - - - - - 7 M [3′-³²P] trna^{板式换热器},寡核苷酸轭合物之一 B-Im (N / m)在浓度范围从 5 × 10 - - - - - - 7 来 5 × 10 - - - - - - 4 (传说中的数字表示)。在37°C和反应进行了淬火tRNA的降水和tRNA与150年碎片 μL 2%的高氯酸锂溶液在丙酮。RNA被离心收集,溶解在加载缓冲区(溴酚蓝6 M尿素,0.025%,0.025%二甲苯苯胺)。tRNA乳沟产品分析12%聚丙烯酰胺/ 8 M尿素凝胶电泳。识别乳沟网站,一个咪唑梯( 24]和G-ladder由部分tRNA解理与核糖核酸酶T1 ( 25)是并行运行。获得定量数据,凝胶干燥使用分子成像和分析外汇(Bio-Rad)。总RNA乳沟的程度是决定tRNA碎片中发现的放射性比总辐射应用于凝胶的车道。

测量的动力学tRNA与寡核苷酸配合乳沟 B-Im (N / m),100年的反应混合物 μL制备含有咪唑缓冲区, 5 × 10 - - - - - - 7 米3′- (³²P] trna^{板式换热器}其中一个寡核苷酸共轭 B-Im (N / m)在不同浓度(从 5 × 10 - - - - - - 7 来 5 × 10 - - - - - - 4 米)。反应是在37°C。在显示时间间隔,一个整除(10 μL)最近的反应混合物被撤回和冷冻试验。反应整除解冻,并立即与150年沉淀 μL 2%的高氯酸锂丙酮。在那之后,反应混合物分别如上所述。

在一些实验中,缓冲被HEPES-buffer取代咪唑(50毫米HEPES-KOH, pH值7.0;0.2氯化钾,0.1毫米EDTA, 100年 μg / mL RNA-carrier)或甲次砷酸盐缓冲(50毫米卡可基acid-KOH, pH值7.0;0.2氯化钾,0.1毫米EDTA, 100年 μg / mL RNA-carrier)或Tris-HCl-buffer(50毫米Tris-HCl, pH值7.0;0.2氯化钾,0.1毫米EDTA, 100年 μg / mL RNA-carrier)。咪唑缓冲区的实验被其他缓冲区显示在文本和数字的传说。

在竞争的实验中,反应混合物(10 μL)含有咪唑缓冲区, 5 × 10 - - - - - - 7 米3′- (³²P] trna^{板式换热器}寡核苷酸 一个(tRNA的互补序列62 - 76^{板式换热器})或寡核苷酸 B添加浓度 5 × 10 - - - - - - 5 M。10分钟的混合物被孵化37°C,然后寡核苷酸轭合物之一 B-Im (N / m)在浓度 5 × 10 - - - - - - 6 M添加和混合物在37°C孵化不同时期(从30分钟到2小时)。反应是淬火和分析如上所述。

gel-mobility转变tRNA的测定^{板式换热器}绑定与寡核苷酸 B和配合 B-Im (4/2)执行如下。(3′-³²P] tRNA ( 5 × 10 - - - - - - 7 米)孵化在37°C在反应混合物30分钟(10 μL)包含杂交缓冲(50毫米Tris-HCI, pH值7.0,200毫米科,0.1毫米EDTA)和寡核苷酸 B或共轭 B-Im (4/2)浓度从 1 × 10 - - - - - - 7 来 5 × 10 - - - - - - 6 M。孵化后,8 μL加载缓冲区(50%甘油、0.025%溴酚蓝,0.025二甲苯苯胺)添加到每个探测器,探测器立即应用到本地10%与100毫米Tris-borate页面,pH值8.3运行缓冲preequilibrated在4°C 3 h。电泳是在4°C 5 h在450 V。获得定量数据,凝胶干燥使用分子成像和分析外汇(Bio-Rad)。

分子建模进行了使用SYBYL 6.6(优等考试Inc .)在硅谷图形O2工作站中描述( 24] 。所有的计算(毫米/ MD) 在真空内使用Kollman-All力场参数和军事介电常数等于4。建筑模型的分子(见图 1在三个阶段进行。首先,一个像DNA, RNA混合使用生物高聚物/ SYBYL 6.6。第二,催化碎片 Im (4/1), Im (4/2a), Im (4/2b)建成使用草图/ SYBYL 6.6。电荷分布对这些构造计算使用半经验的莫计划,之后,MOPAC几何优化。在最后一步中,每个对应的酶切片段与DNA: RNA混合通过终端5′核苷酸磷酸组G1残渣。

对于每一个分子,几种不同结构创建开始,不同的形态和位置裂开组,从“在”““极端位置相对于背景:RNA混合。每个分子的起始结构受到最小化的梯度收敛0.05千卡/摩尔,考虑到DNA, RNA作为固体混合。每个结构开始单独接受12 ps MD运行使用模拟退火如下。系统加热在600 K 2 ps紧随其后逐渐降温到100 K / 10 ps。最后一个最小化收敛标准导致执行各自的最后为每个类型的分子构象。年代和F符号之前共轭名称显示开始和最后的构象,分别。

“活性构象”获得了每个模型分子(O1-Im4/1, O2-Im4/1 O1-Im4/2a, O2-Im4/2a, O1-Im4/2b, O2-Im4/2b,类型1显示了锚组1)使用一个类似的模拟退火的协议。在这些分子,裂开组故意位于最有利的位置为成功的乳沟C_63年——一个_64年网站。即之间的距离的N1咪唑残留和2′哦组C_63年~ 3 A和其他之间的距离N1咪唑残留的氧气磷酸基,连接C_63年和一个_64年,大约是3 ( 26, 27]。最后一个最小化了没有约束,使用上述协议。

RNA裂开寡核苷酸轭合物已经准备在两步过程中描述 21, 22]。在第一步中,前体17-mer GATCGAACACAGGACCT (B)建立了与多个methoxyoxalamido(氧化物)的不同类型修饰符(看网上辅料doi: 10.4061 / 2011/748632结构的轭合物合成在这项研究)。在第二步中,准备oligonucleotide-MOX携带组胺的前体是屈服去保护步骤后寡核苷酸共轭 B-Im (N / m)轴承4至32组胺残留5′端。

图 1提供了寡核苷酸轭合物的结构 B-Im (4 / n)和B-Im (8/1)研究工作。配合以下被称为 B-Im (N / m),B-Im指定oligonucleotide-imidazole轭合物,N咪唑残留的数量,和m表示锚组的类型。在的情况下,当两个或三个轭合物包含相同数量的咪唑残留和相同的锚,共轭数量显示在方括号中。寡核苷酸之间的距离和咪唑残留裂开的部分是不同的结构通过改变锚和链接器组。环己酯残留物被利用作为锚组共轭1型。胸腺嘧啶核苷用于锚的催化部分共轭2型。胸腺嘧啶核苷,呈现在共轭的结构,应该是与RNA碱基配对或可能堆放在heteroduplex双稳定做出贡献。在共轭型3中,锚组化学构造模仿磷酸二酯键和用作规则nonnucleotide寡核苷酸的插入。Type 4锚组用于配合 10 - - - - - - 13 增加分支机构的数量,咪唑残留。为此,增加链接器长度和灵活性,锚类型1和2组整合也到链接器结构(参见图1-SM,配合 6 - - - - - - 9 和 11 - - - - - - 13 )。此外,连接器的长度和结构连接咪唑残留和锚,是杰出的化合物(表中充分 1和图1-SM)。包含相同数量的咪唑残留的轭合物,例如, B-Im (4 / m)或 B-Im (8 / m),不仅在锚团体不同,但也在一个链接器的长度。共轭的链接器 B-Im (4/3)是最短的。在这种共轭,四咪唑残留放置在磷酸基的不对称形成锚,寡核苷酸的连接 B和裂开构造。

质谱仪的身份证实了轭合物;(见图 1)。此外,证实了轭合物的纯度在12% PAAM / 8 M尿素凝胶电泳(图 1(c))。是看到轭合物的纯度接近95%。只有在配合 2 , 5 , 10 , 16 一些其他的乐队,5 - 7%的相对强度。

酵母tRNA^{板式换热器}故意选择作为目标来评估乳沟轭合物的活动。这背后的基本原理是,其他oligonucleotide-based aRNases包括三个准备使用前兆方法一直使用这个测试目标( 1, 12, 14- - - - - - 16, 28]。图 2(一)代表酵母tRNA的蝶式结构^{板式换热器}配合的目标站点 B-R (N / m)。的识别元素研究代表了aRNases 17-mer寡核苷酸 B,互补序列44-60和设计序列的咪唑残留^61年CACAG^65年T-arm的tRNA^{板式换热器},这是高度敏感的对解理( 29日- - - - - - 32]。这是先前表明,寡核苷酸 B可以有效地绑定到这个序列的tRNA^{板式换热器}导致整个TΨC发夹的展开,而aminoacceptor和反密码子茎的tRNA仅略受寡核苷酸绑定( 33- - - - - - 35]。

的配合 B-Im (N / m)旨在通过酯交换反应催化RNA乳沟。比较配合的核糖核酸酶的活动,我们使用单一的条件反应营业额([ B-Im (N / m))> (RNA))。寡核苷酸的部分共轭提供有效的杂交在tRNA与目标序列^{板式换热器}并形成稳定heteroduplex (K_d= 7 μM±1 μM;诉Petyuk未公开的数据)。我们相信,在实验条件下的速度和效率site-selective乳沟的目标是只影响催化共轭的一部分。

(3′- Site-selective乳沟³²P] tRNA^{板式换热器}的配合进行了37°C的50 mM咪唑缓冲区。的反应是由共轭 B-Im (N / m)反应混合物。乳沟的本地化网站是由比较的产品获得在乳沟tRNA的轭合物的产品随机与核糖核酸酶RNA乳沟T1和2 M咪唑缓冲区,pH值7.0 [ 25, 36]。图 2(b)显示了tRNA的典型分析的结果^{板式换热器}劈理的轭合物 B-Im (N / m)在标准条件下在37°C。没有可衡量的自发降解实验条件下的tRNA缺乏试剂和修改的父寡核苷酸的存在 B发生(图 2(一)车道C1和C2)。的配合裂开tRNA^{板式换热器}与高速率主要是磷酸二酯键C63-A64 A64-G65。tRNA的区段^{板式换热器}乳沟在这些债券约70%和20%,分别。此外,一些次要的乳沟内的磷酸二酯键C61-A62 A62-C63目标序列观察(图 2(一)、车道1 - 10)。产品之间的比例磷酸二酯键的tRNA乳沟位于靠近对方的目标序列似乎对应于空间可访问性这些债券的乳沟配合B-Im (N / m)。的共轭 B-Im (4/2a)(类似分裂观察的轭合物与16日,24日,32咪唑残留),观察到的微小的分歧是U8-A9和C75-A76磷酸二酯键(小于3%的总tRNA乳沟的程度),称为C61-A62以及在酵母tRNA C63-A64债券^{板式换热器}被各种代理[向解理非常敏感 29日- - - - - - 32] 。债券U8-A9位于邻近序列C61-G65如果tRNA的三级结构^{板式换热器}是考虑。因此,或许有人认为观察到的乳沟的这个键发生在互补形成的复杂的共轭 B-Im (N / m)tRNA与RNA-cleaving集团是灵活性的结果的配合。除此之外,我们可以假设初始乳沟的磷酸二酯键C63-A64产生一个尼克在tRNA分子可能会增加复杂tRNA-conjugate的灵活性 B-Im (N / m)从而使磷酸二酯键C64-G65和U8-A9用于催化剂的功能组。轻微的乳沟观察C75-A76网站显然是自发的结果tRNA与共轭双水解。

竞争实验被用来证明tRNA解理发生在 tRNA-conjugate复杂。tRNA^{板式换热器}劈理的共轭 B-Im (4/1)执行的寡核苷酸抑制剂的两种类型:父母寡核苷酸吗 B和寡核苷酸 一个互补序列61 - 75(图 2(b),车道17 - 19)。正如所料,tRNA的乳沟^{板式换热器}通过共轭 B-Im (4/1)寡核苷酸的存在大大降低了 B(主要数据未显示)和完全废除的寡核苷酸 一个双工的形成,保护目标序列。值得注意的是,在寡核苷酸的存在 B,tRNA的乳沟^{板式换热器}抑制在所有网站由于竞争的绑定,而寡核苷酸吗 一个抑制tRNA^{板式换热器}乳沟只在目标序列未能改变反应速率在其他网站。这些结果表明劈理的结构特异性和压力的乳沟只发生在一个单链的目标序列。

图 2(c)显示了轭合物裂解反应的浓度依赖性 B-Im (4/1) ( 3)和 Im (24/4 + 2)( 11 )(曲线1和2,分别地)和绑定的共轭 B-Im (4/2a)和家长寡核苷酸 B与tRNA(曲线3和4,职责)。看到,乳沟数据与复杂协议的形成。此外,绑定父寡核苷酸的亲和力和共轭研究了在相同条件下发现类似(图 2(c))。因此,笨重的接合imidazole-containing活性组的寡核苷酸不影响杂交过程。

估计site-selective RNA乳沟的缓冲对效率的影响,我们tRNA相比^{板式换热器}劈理的共轭 B-Im (4/2)在不同的缓冲解决方案(图 2(d)), 50 mM咪唑缓冲区,pH值7.0标准条件。site-selective卵裂率影响替代50 mM咪唑缓冲区,pH值7.0,50 mM Tris-HCl缓冲区或50 mM甲次砷酸盐缓冲pH值7.0的1.5倍,表明咪唑本身可能导致裂解反应。在培养时间长,这种差异变得无关紧要,不超过估计实验误差。令人惊讶的是,50 mM消息灵通的缓冲完全废除解理灭活轭合物。这并不完全理解的原因。一种解释可能是,磺酸的玫瑰[4 - (2-hydroxyethyl) -piperazine-1-ethanesulfonic酸]可能与质子化了的咪唑残留的配合和灭活。以前,我们也观察到两个RNA卵裂率的降低寡核苷酸共轭轴承两个咪唑残留在50 mM HEPES-KOH缓冲区,而其他缓冲区稍微影响了RNA卵裂率( 37]。

在图 2(一)代表酵母tRNA的蝶式结构^{板式换热器}和目标序列的寡核苷酸 B基于人工核糖核酸酶 B-Im (N / m)。大胆的字母显示oligonucleotide-competitor目标序列 一个。箭头指示的地方site-selective tRNA乳沟的配合;(b)代表tRNA的乳沟^{板式换热器}与寡核苷酸轭合物 B-Im (4 / m)。放射能照像12%的聚丙烯酰胺/ 8 M尿素凝胶。裂解反应进行了37°C的50 mM咪唑缓冲区,pH值7.0,包含200毫米氯化钾,0.2毫米EDTA, 100年 μg / mL RNA载体, 5 × 10 - - - - - - 7 M [3′-³²P] tRNA^{板式换热器}和 1 × 10 - - - - - - 5 M轭合物之一 B-Im (4/1), B-Im (4/2a), B-Im (4/2b)。车道L和T1咪唑和核糖核酸酶T1梯子,分别。车道C1和C2的tRNA孵化反应缓冲8 h缺失和寡核苷酸的存在 B( 5 × 10 - - - - - - 5 米)。由共轭tRNA乳沟 B-Im (4/1) ( 3)0.5,1、3、5、8 h(通道1 - 5、职责)、共轭 B-Im (4/2a) ( 4)0.5,1、3、5、8 h(道6 - 10),由共轭 B-Im (4/2b) ( 4 b)0.5,1、3、7、10日和18 h(11 - 16车道);的共轭 B-Im (4/1) ( 3)在寡核苷酸的存在 一个( 1 × 10 - - - - - - 4 )为0.5,1和5 h(车道17 - 19)。轭合物浓度在反应混合物中 1 × 10 - - - - - - 5 M。反应是淬火实验部分中描述和分析; (c)代表tRNA的浓度依赖性^{板式换热器}劈理的轭合物 B-Im (4/1) ( 3)和 B-Im (24/2)( 12 )(曲线1和2,分别地)和复杂的共轭形成 B-Im (4/2a) ( 4) (3)曲线和父寡核苷酸 B(曲线4)。反应混合物在上述条件下孵化2 h; (d)代表缓冲区的影响自然tRNA的速度^{板式换热器}劈理的共轭 B-Im (4/2a) ( 4)。(3′-³²P] tRNA^{板式换热器}(0.5 μ米)与2孵化 μ米的 ( 4)在50 mM咪唑缓冲区,pH值7.0 (Im)或50 mM甲次砷酸盐缓冲,pH值7.0 (Cac)或50 mM Tris-HCl缓冲区,pH值7.0(三)或50 mM消息灵通的缓冲区,pH值7.0(玫瑰)包含0.2氯化钾,EDTA 0.2毫米和0.1毫克/毫升RNA载体。

图 3(一个)显示tRNA的动力学^{板式换热器}解理与配合下研究了共轭浓度10 μm .看到,配合裂开RNA具有不同的功效。一个最有效的共轭 B-Im (4/1)目标的完整site-selective乳沟,这在2 - 3小时内实现共轭。由共轭显示类似的动力学 B-Im (8/1)( 6 )和 B-Im (24/4 + 2)( 12 )。的配合 B-Im (4/2a)( 4), B-Im (8/2)( 7 )催化RNA乳沟有效而少 B-Im (4/1)或 B-Im (8/1)。乳沟共轭的效率 B-Im (4/3)( 5 )本质上是贫穷。

图 3 (b)显示了tRNA的动力学曲线^{板式换热器}劈理的共轭 B-Im (4/1)获得了在不同浓度的共轭。证据的双分子反应动力学曲线的特点:RNA卵裂率增加共轭浓度的增加。在共轭的浓度 B-Im (4/1)10 μ米,它提供了几乎定量绑定tRNA, tRNA的半衰期约为1 h(图 3 (b)曲线”10 μM”)。当共轭的浓度 B-Im (4/1)增加了50吗 μ米,tRNA的半衰期(图统计的分钟 3 (b)曲线”50 μM”)。应该注意的是,tRNA site-selective乳沟的收益比绑定父寡核苷酸的慢得多 B在同样的条件下,tRNA [ 33- - - - - - 35]。在共轭的浓度等于或两倍高集中的tRNA,曲线揭示滞后期(图 3 (b)曲线“0.5”和“1 μresp M。”)表明site-selective RNA劈理的过程包括几个连续步骤发生在类似的利率。另一个解释可能是,反应也更复杂的性格和经历一些阶段除了绑定的共轭和乳沟,导致sigmoid-like动力学曲线。

对共轭 B-Im (4/1)协会,我们计算速度和乳沟速率常数的数据显示在图 3 (b),假设乳沟的tRNA发生在复杂的共轭。在这种情况下,杂交步骤阶段是分子内一阶二阶反应和裂解反应。事实证明,乳沟 体育本身发生50倍的绑定共轭的互补序列在RNA目标(协会速率常数和乳沟速率常数( 0.074 ± 0.002 )米⁻¹年代⁻¹和( 3.4 ± 0.55 ) × 10 - - - - - - 3 年代⁻¹、职责)。换句话说,绑定的共轭tRNA的病原反应阶段site-selective RNA乳沟。

配合显示不同的分裂活动(表 1)从非常高的卵裂率( τ_1/2 ~1 h的情况 B-Im (4/1))到非常低( τ_1/2价值并不是取得了在实验条件下的情况 B-Im (4/3))。非凡的裂开轭合物的活动 3 , 6 , 12 以及配合适度的分裂活动 4 , 8 , 10 , 11 , 13 和穷人共轭的效率 5 可能产生的差异的结构催化轭合物的一部分而不是由于不同杂化属性和乳沟反应 体育本身。下的轭合物研究包含相同的寡核苷酸识别元素并显示类似的乳沟特异性裂解模式只有细微的差别。因此,杂交和敏感性的磷酸二酯键向乳沟可以解释轭合物的催化性质的差异。在很多情况下甚至轭合物的催化部分包含相同数量的咪唑残留。

表 1总结数据的分裂活动和结构配合下研究(链接器长度总数的简单的碳碳,氮,切断,和P-O债券之间的5^/端寡核苷酸B和咪唑残留,类型的锚集团和反应半场)。看到水解活性的化合物是在良好的协议与连接器的长度(表 1)。在配合轴承四咪唑残留,最高的乳沟共轭活动是观察 B-Im (4/1)41简单债券的连接器。的配合 B-Im (4/2a)连接器的29个化学键展览三倍低分裂活动,而 B-Im (4/3)(18/24债券)劈开tRNA与效率最低。因此,逐步缩短链接器的共轭的一部分 B-Im (4 / m)从41 18/24简单债券导致减少的乳沟每小时每小时效率从50%到1%。从表 1,只有包含连接器的轭合物的40简单债券能够有效地催化tRNA的乳沟^{板式换热器}site-selective的方式。因此,我们可以得出结论,一个长灵活连接器40以上的简单的碳碳,氮,或者P-O债券需要高效site-selective乳沟的RNA的目标。

图 4显示 结构活性为配合相关性发现 B-Im (N / m)。是看到乳沟轭合物的活动 B-Im (N / 1)取决于数量的咪唑组在催化部分(图 4(一))。配合轴承4和8咪唑残留表现出最高的分裂活动,同时增加数量的咪唑组抑制乳沟。值得指出的是,sigmoidicity在相同条件下的动力学曲线是咪唑类的数量的增加而增加共轭(主要数据未显示)。乳沟很可能这些配合的活动是影响立体咪唑类之间的干扰,从而导致损失的卵裂率。因此,4(和/或8)咪唑残留在催化部分共轭似乎足以有效RNA乳沟。

从图中所示的数据 4 (b)配合的,看到核糖核酸酶活动取决于类型的父寡核苷酸的锚组用于附件RNA-cleaving构造。1型锚的配合集团( B-Im (N / 1)),环己基一半(图 1乳沟活动()),显示高于轭合物与锚组胸苷的形式残留(类型2,图 1),特别是比配合nonnucleoside锚集团(类型3,图 1)(表 1)。乳沟之间的差异活动的配合与Type 2和Type 4锚团体不超过实验误差,但可靠地低于1型锚,配合集团。因此,链接器的结构和灵活性,咪唑残留在催化部分的数量,和锚定组的类型影响解理活动配合和发挥作用的最优定位对催化剂的易裂开的磷酸二酯键。

分子模拟的主要目的是为了澄清以下问题。 (1)

有没有更好的方向裂开组的(s) (s)附近的裂解位点,这就可以解释的水解活性(或没有)共轭吗?

很明显的生化检测水解heteroduplex内的活动 tRNA^{板式换热器} 共轭是由裂开的内在属性结构,而不是详细的dna rna的结构混合,在所有相同的实验。因此,最首要的任务是识别可能裂开的位置(s)组(s)相对的裂解位点而不是确定的详细构造混合(这是不可能没有相关的NMR / x射线数据)。

早些时候,已经表明杂交的寡核苷酸TΨC-loop ( 33, 38)或3′受体抑制( 33- - - - - - 35的tRNA诱导当地tRNA二级结构的演变。因此,我们假设下的混合部分的分子研究的第一近似值可以表示一个双链DNA: RNA双工,主要是像构象形式,根据物理化学研究[ 39- - - - - - 41]。在我们的分子建模研究中,我们使用heteroduplex缩短模型,包括目标RNA序列(对应^5′A44-U69 tRNA的片段^{板式换热器})和oligodeoxyribonucleotide共轭互补的RNA地区(图 2(a))。

基于该混合双、三分子模型被创建(M-Im (4/1), M-Im (4/2a)和M-Im (4/2b))的附件各自裂开结构5′末端磷酸基的G¹核苷酸残留物(见图 1和 2)。在这个阶段,没有杂化heteroduplex详细的结构数据,它是合理的治疗混合作为“固体”结构( 24)同时允许裂开结构拥有一个完整的构象的灵活性在计算。

对于每个分子M-Im (4/1), M-Im (4/2a)和M-Im (4/2b),几个开始创建结构不同的空间定位裂开构造(s),从“在”“out”极端(参见”部分 2”)。这增加了每个模型分子的构象空间搜索。所有开始结构受到独立模拟退火(参见”部分 2”)导致各自的最终结构(M-Im (4/1): F1-Im (4/1) -F9-Im (4/1);M-Im (4/2a): F1-Im (4/2a) -F9-Im (4/2a);M-Im (4/2b): F1-Im (4/2b) -F9-Im (4/2b)。

结构参数和能量价值的最终结构进行了分析和比较与“活跃”的构象(O1-Im (4/1), O2-Im (4/1), O1-Im (4/2a) O2-Im (4/2a) O1-Im (4/2b)和O2-Im (4/2b)),曾故意preorganized裂开中心根据( 20., 26, 27, 42, 43)(请参见”部分 2”)(表 2)。

分子包含四咪唑残留M-Im (4/1), M-Im (4/2a)和M-Im (4/2b),有两个bis-imidazole裂开结构,不同的几何属性链接器组(见图 1)。链接器群M-Im(4/1)拥有与寡核苷酸片段连接裂开根环己酯。在M-Im (4/2a),环己基片段被deoxyribothymidine片段。M-Im (4/2b)是一个短的模拟M-Im (4/2a)。

对于每一个分子,九最终结构+ 2“最佳”构象得到的结果模拟退火的计算。数据在咪唑环的N1原子之间的距离和目标站点以及能源值表中给出 2。

M-Im(4/1)(表 2),最积极有利的构象(O1-Im (4/1), O2-Im(4/1),和F4-Im(4/1))具有至少两个咪唑组的位置接近目标站点(3 - 7)。在大多数情况下,M-Im (4/2a)矫形器至少有一个咪唑组位于裂解位点附近,这表明一个高概率裂开组形成preorganized“活跃”构象。这些数据一致的生化检测,高水解活动见过 B-Im (4/2a)共轭,表明这种化合物达到最大活动(49.8%)发现人工核糖核酸酶。图 5代表的碎片F4-Im(4/1)结构,最积极有利的构象M-Im(4/1),并显示了可能的方向裂开组。

对于M-Im (4/2a),大多数模拟退火实验获得的最终结构的特点是一个遥远的位置裂开组从目标站点(表 2)。例如,最低结构F1-Im (4/2a) F3-Im (4/2a)和F8-Im (4/2a)咪唑的不利的方向裂开组的水解活动(见图 6显示F1-Im (4/2a)最终的结构为例)。的可能的原因可能是存在deoxyribothymidine片段连接寡核苷酸和裂开的构造。根据我们的数据,胸苷基地参与DNA, RNA螺旋结构与相邻核苷酸残dG semistacking交互¹。胸苷基地匹配舒适的复式结构,尽管没有附加氢键的链检测(例如,一个^62年)。这种交互可以控制的整体构象的其余部分裂开构造和可能限制这一组的构象自由,导致降低概率呈现一个“活跃”构象。这可以解释水解活性相对较低 B-Im (4/2a)(16.6%)相比 B-Im (4/1)。

水解活性下降更为明显(5 - 7%)观察共轭 B-Im (4/2b)结构类似物 B-Im (4/2a)缩短链接器组。在生化分析获得的数据是一致的结果从分子建模M-Im (4/2b)(表 2),显示最积极有利的构象(例如,F2-Im (4/2b) F3-Im (4/2b)和F5-Im (4/2b))有一个遥远的位置裂开组相对于目标站点(图 7显示F5-Im (4/2b))。此外,只有一两个bis-imidazole组可以占据一个位置,有利于裂开的活动。这降低了统计概率达到一个“活跃”构象M-Im (4/2b)。一般来说,大多数的最终结构M-Im (4/2b)的特点是长咪唑环之间的距离和目标原子。结构参数的分析表明,链接器组的长度不足以提供一个好的机会达到目标站点。这可能导致构象限制自由造成的胸苷与RNA相互作用:DNA双螺旋结构(见上图M-Im (4/2a))。综上所述,这些解释的水解活性最低 B-Im (4/2b)之间的人工核糖核酸酶。

分析的最终结构的模拟退火实验显示了非凡的能力的裂开构造形成多个氢键一般可以表示为两种类型(计划 1)。第一种之间的分子间的相互作用是裂开构造和RNA的目标,由氧原子形成磷酸核糖核酸的骨干,要么(我)的咪唑环裂开组或(ii)链接器氨基的质子群(见方案 1)。这些类型的氢键似乎赞成的水解活性化合物由于其能力稳定的位置裂开组,接近RNA的目标。第二种类型的氢键(计划 1)指的是分子内的相互作用在裂开构造自己和涉及咪唑环和氨基的团体之间的相互作用,羰基化合物和磷酸盐链接器组。这种类型的氢键相互作用还包括intralinker桥梁由氨基和羰基/磷酸基。分子内氢键似乎与有利的分子间的相互作用,防止咪唑组与RNA骨干适当联系,这可能导致减少他们的水解活动。

基于这些结果,我们提出一些建议如何改善人工核糖核酸酶进一步裂开的潜力。首先,重要的是要避免使用链接器内的任何羰基/磷酸基为了减少分子内氢键的可能性。其次,它可以有利于引入polycationic组在链接器,这可能增加可能接触裂开组与带负电荷的磷酸靶RNA的骨干。最后,插入链接器内的合适的疏水/插层组也可能增加这些团体的机会位于附近的RNA目标由于额外的堆叠/疏水相互作用不同的核苷酸环境。