文摘

奶酪是易腐食品,必须履行根据参数建立了全球卫生和质量要求。等离子体作为一种非热能的失活技术一直是食品保存当前的研究课题,因此,这项工作的目的是研究等离子体的影响能量对微生物Adobera奶酪(传统的墨西哥奶酪)以及评估可能的脂质和蛋白质的降解。108 CFU /毫升大肠杆菌写明ATCC 25922,沙门氏菌ATCC13076,金黄色葡萄球菌写明ATCC 6538人接种的0.5 g Adobera奶酪和受到能源30伏,在介质阻挡放电反应器(DBDR)每隔* 1,3,5,7,10,15分钟。流的混合空气和氦纯度是96%。小数点(D)决心减少时间,并分析了蛋白质和脂质氧化后治疗。结果显示下一个湮灭的等离子体效应指标细菌研究和减少5对数周期。最大程度的脂质氧化是23酸值(副词)7分钟后暴露在等离子体。蛋白质的氧化表现出直接和比例关系的形成羰基化合物与羰基化合物的浓度显著损失比例与蛋白质氧化的浓度,3分钟后暴露在冷等离子体水平的82%和99%氧化Adobera乳酪蛋白和免费的酪蛋白,分别。我们得出这样的结论:等离子体的能量用于Adobera奶酪灭活细菌是一种有效的治疗。然而,有可能导致味道和气味的变化,由于释放脂肪酸和蛋白质的氧化。

1。介绍

Adobera奶酪是一种传统的墨西哥奶酪,起源于哈利斯科州,由nonpasteurized牛奶不遵循一个成熟的过程。这种奶酪有一个公司,易碎,和颗粒状纹理,它是柔软和盐调味。这个名字Adobera来自这奶酪的形状,这类似于一个adobe砖。这奶酪可以添加辣椒和香料根据制造业地区(1,2]。Adobera奶酪是最常使用手工墨西哥奶酪在哈利斯科和显示潜力保护原产地名称。由于科学研究的不足,有必要开发技术策略减少病原微生物在奶酪制造、存储和分布(3]。

冷等离子体(CP)能源是一个新兴技术,今天看来作为食品行业的一个有趣的选择,主要是为了满足消费者对新产品的需求,除了在操作保持低温的能力,减少有毒气体的使用,影响健康和环境安全4]。在大气或真空条件下生成CP在室温和几乎不需要能量。简单,等离子体形成的过程可以被描述为中性的气体被电离能量较低。CP是一个完全电离气体混合物的各种活性物种,如紫外光子,带电粒子,自由电子,积极的和消极的离子自由基,激发态原子,和活性氧(ROS)和氮,如过氧化物(O2−)、羟基自由基、单线态氧,原子氧、过氧化氢、臭氧(O3)、二氧化氮(没有2)和一氧化氮(NO) (5- - - - - -7]。CP的抗菌潜力,以及物种的分子氧(O2),超氧化物阴离子(O2−)、臭氧(O3)、过氧化氢(H2O2)、羟基(哦−)、过氧化氢(ROO−),氢过氧化物(ROOH)等已经彻底研究,描述由不同的作者(5,7- - - - - -10]。

一些研究显示应用程序的CP伤口消除耐甲氧西林菌株金黄色葡萄球菌和由抗多种抗菌素的细菌生物膜的形成8,11- - - - - -13]。另一方面,费尔南德斯和汤普森(2012),评估了CP大肠杆菌,酿酒酵母,葡糖杆菌属liquefaciens,单核细胞增多性李斯特氏菌在芒果片接种(Mangifera籼)和哈密瓜瓜(Cucumis梅洛var. reticulatus)表面,观察,这是非常有效的减少这些水果表面的微生物负载(9]。

等离子体的放电,在平行板和同轴介质阻挡放电反应器(DBDR),在大气压力He-air气体混合物在1.5升/分钟流,已经成功地应用于细菌去除在很短的时间处理14- - - - - -18]。低温等离子体也已应用于灭活金黄色葡萄球菌和酿酒酵母,暴露出的细胞在1.5升/分钟的流量He-air气体混合物和850 V,所产生的低温等离子体DBDR。的细胞金黄色葡萄球菌显示膜损伤而酿酒酵母损害了细胞壁,顺向DNA变性(19]。不管冷等离子体对微生物的影响消除,还有其他研究评估的影响冷等离子体的能量与抗氧化剂,蛋白质和脂肪(20.- - - - - -23]。关于肉桂中包含的一些多酚的抗氧化活性和洋甘菊,在这项研究中观察到,冷等离子体的能量会导致降低抗氧化活性取决于一些多酚的起源20.]。另一方面,冷等离子体的能量引起的变化在蛋白质肽链的结构,改变生物特性,这就是牛血清白蛋白和大豆凝集素(21,22]。另一项研究显示了发生在脂质改变,一般的氧化情况就是这样进行的一项研究鸡肉(23]。

最小变化的物理、化学、营养和感官属性的各种产品已获得使用CP治疗由于其非热能的本性。然后,这种技术可以有效的替代工具食物去污和延长保质期。此外,有限的研究物种相互作用的反应,在分子和营养与食品组件级别提供大的研究机会5,18]。

自从兴趣CP在食品的应用保护的发展,这项工作旨在研究CP的抑制作用在Adobera奶酪接种大肠杆菌写明ATCC 25922,沙门氏菌ATCC13076,金黄色葡萄球菌写明ATCC 6538,以及评估可能的脂质和蛋白质的降解。

2。材料和方法

2.1。生物材料

在这项研究中,我们使用Adobera奶酪切片厚度0.2厘米和0.5 g的一个近似重量。50个人奶酪片接种μL的细菌(大肠杆菌写明ATCC 25922,沙门氏菌ATCC13076,金黄色葡萄球菌写明ATCC 6538)一样,混合三个菌株,0.5麦克法兰的浓度,相当于108 CFU /毫升。

2.2。治疗Adobera奶酪和介质阻挡放电反应器(DBDR)

奶酪片接种细菌暴露在非热等离子体由DBDR生成设计并建造了由国家核研究所(ININ、墨西哥)19]。这个设备运行在13.56 MHz,是由一个专门建立无线电频率(RF)谐振转换器。核反应堆,在大气压力He-air气体混合物,纯度为96%,和1.5 L / min流量、30 W的输入功率和输出电压为850 V。奶酪的样品会有冷等离子体照射治疗不同的曝光时间(1、3、5、7、10、15分钟)。奶酪片的微生物分析等离子体接触后执行。

2.3。微生物分析

微生物分析是通过引入Adobera奶酪片CP治疗后,在试管中包含6毫升生理盐溶液;管是动摇的漩涡让奶酪颗粒沉淀。然后,1毫升的上层清液被放置在培养皿和选择性琼脂根据各菌株(Mac Conkey盐和甘露醇琼脂沙门氏菌和志贺氏杆菌琼脂,BD Bioxon™,墨西哥),37°C的培养皿被孵化24和48小时24]。

2.4。减少小数(D)动力学

减少小数(D),灭活微生物种群的90%所需的时间对数刻度,计算使用死亡的动力学从奶酪的治疗获得样本在不同时间的博览会等离子能量(25,26]。这个参数是计算得到的动力学方程的斜率如下。 在哪里N是最初的微生物的数量,N0是最后的微生物的数量,Kd是死亡的动力学常数,t是时候了。

2.5。蛋白质氧化

接触Adobera奶酪等离子能量之后,奶酪片悬浮在0.9%生理盐水和漩涡,直到样本均质。10μL的上层清液被转移到一个包含500年的埃普多夫管μL 0.2%的2,4-dinitrophenylhydrazine DNFH (w / v)的2 n盐酸。混合物在室温下培养1 h。随后,500μL 20% (w / v)柠檬酸是补充道。样品在4°C孵化15分钟,促进蛋白质沉淀。管是离心机在6000 g的3分钟冷冻离心机(美国Biosan, lmc - 4200 r),丢弃上层清液。沉淀是洗了三次1毫升乙醇的混合物:乙酸乙酯(1:1),每次离心法去除浮层。沉淀溶解在1毫升的胍在20毫米磷酸钾(6米),涡流,孵化为30分钟37°C。最后,分析的样本使用UV / vis分光光度计(Jenway 6350316305,英国)在360 nm,胍空白。执行同样的程序使用1 g的酪蛋白(Hy-Case®氨基,默克公司,美国)。自由羰基化合物的结果表示为nanomoles /毫克的总蛋白(27]。

2.6。水解酸败

样品1 g Adobera奶酪受到等离子能量治疗在不同的时间和被转移到50毫升管。之后,2毫升非离子表面活性剂试剂(30克特里同x - 100和70克硫酸钠溶解在1 l(蒸馏水)添加和涡直到均质。管被放置在洗澡的热水在57瓶°C为20分钟。随后,2毫升的甲醇添加到每个管,200μL脂肪提取和转换成一个管的溶剂和溶解在1毫升脂肪(石油醚:正丙醇比4:1 v / v和甲醇:水50:50)。最后,添加了2滴酚酞和样本随后滴定与KOH 0.01 N。脂质氧化测定游离脂肪酸的程度(副词),定义为毫当量碱(KOH)每100克脂肪和计算如下28]: 在哪里N是正常的KOH溶液滴定的体积(样品和空白),密度1.033克/厘米吗3,14%的总脂肪奶酪。

2.7。统计分析

分析一式三份和治疗都意识到三次。数据报告为平均值±标准偏差(SD)或平均数标准误差(SE)。统计分析了使用STATGRAPHICS百夫长十五2.15.06软件版本。方差分析(方差分析)和多重比较程序(至少显著差异,LSD)进行了测试,以确定是否有显著差异( )在治疗。

3所示。结果

3.1。微生物分析Adobera奶酪

经过15分钟的治疗CP,人口大肠杆菌写明ATCC 25922,沙门氏菌ATCC13076,金黄色葡萄球菌写明ATCC 6538减少5对数周期。对整个应变,死亡时间观察死亡的两个不同阶段动力学(数字1(一),2(一个),3(一个))。第一阶段显示加速死亡的细菌,设法减少细胞生存能力5对数。然后,细菌的耐药性死在第二阶段被观察到。然而,它可以观察到培养皿文化CP治疗7分钟后,没有任何三个细菌(数字的增长1 (b),2 (b),3 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图1
生物量减少。(一)死亡动力学大肠杆菌写明ATCC 25922;(b)大肠杆菌写明ATCC 25922细胞培养皿。
(一)
(一)
(b)
(b)
图2
生物量减少。(一)死亡动力学沙门氏菌ATCC13076;(b)沙门氏菌ATCC13076细胞培养皿。
(一)
(一)
(b)
(b)
图3
生物量减少。(一)死亡动力学金黄色葡萄球菌写明ATCC 6538;(b)金黄色葡萄球菌写明ATCC 6538细胞培养皿。

关于微生物死亡常数的参数(kd)和微生物减少小数(D)(见表1),我们可以观察到三个菌株之间的值是非常相似的(单独大肠杆菌写明ATCC 25922,沙门氏菌ATCC13076,金黄色葡萄球菌写明ATCC 6538)和没有显示显著差异( )。相反,当比较治疗混合菌株的三个指标,差异在两种Kd斜坡和D了 。在先前的研究中,细胞的大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,酿酒酵母显示,孔隙形成的膜的伤害,造成低温等离子体的作用,导致击穿连续膜与DNA变性,这些是导致死亡的主要因素或失活的微生物19]。

表1
意思是死亡常数(±SD) 和死亡时间秒(±SD) 不同的菌株,在斜坡上1和2。

关于治疗CP的结果(图3的混合细菌4(一)),这个测试了死亡动力学观察到的非常相似大肠杆菌写明ATCC 25922,沙门氏菌ATCC13076,金黄色葡萄球菌分别写明ATCC 6538,每一个。同样,观察5 log减少死亡,死亡和2阶段注册(数字1,2,3)。类似细胞减少观察细菌治疗CP的混合物在不同时间(数字4(一)和4 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图4
生物量减少。(一)死亡动力学细菌的混合物;(b)的混合细菌细胞培养皿。
3.2。蛋白质和水解酸败

蛋白质易受氧化反应,导致恶化的质量由于羰基化反应是一种不可逆转的修改形成羰基化合物诱导氧化应激和其他机制。

Adobera奶酪含有大约4.2克的脂肪总量和总额的6.1克蛋白质每公斤。蛋白结合的羰基官能团的数量被用作标记评估氧化损伤在治疗CP(图5)。等离子治疗前,奶酪的羰基官能团的浓度几乎为零,但一旦受到样品CP治疗浓度的改变。暴露在CP 1分钟后,观察羰基官能团的增加,然而,无显著差异( )在治疗中观察3 - 15分钟。羰基氧化的总比例为99%,最高羰基化合物(图1.62 nmol /毫克的蛋白质5(一个))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图5
蛋白质氧化损伤后治疗CP。(一)治疗CP Adobera奶酪。(b)治疗CP在自由酪蛋白。

我们也验证如果CP将产生相同的氧化损伤在自由酪蛋白(图5 (b))。结果显示治疗CP的0和1之间的显著差异在3分钟( )在酪蛋白,最大10.89 nmol /毫克蛋白羰基化合物的生产在3分钟,这对应于氧化蛋白质的79%。没有观察到显著差异在3、15、25分钟( ),氧化表现出的行为非常类似于Adobera干酪蛋白质。

发现的一个显著差异是羰基化合物的浓度之间Adobera奶酪和酪蛋白,被1.62和10.89 nmol / g的样本,分别。我们假定自由酪蛋白,当受到直接CP,暴露了一些氨基酸更直接,和这些改变在羰基化合物,而Adobera奶酪是一个复杂的矩阵的多组分高含水量(55%)的暴露其氨基酸不是高达酪蛋白。

另一方面,众所周知,当高脂肪含量的食品接触到光和/或温度,脂肪氧化和修改产品的感官特征。脂质氧化的奶酪(图612)显示之值,19日,20日和21日对应* 1,3,5,7分钟的治疗,分别。奶制品的标准方法检查美国公共卫生协会(1972年)规定的值之< 0.4是可以接受的氧化产品,0.7到1.1的值在其接受的极限,值为1.2时显示轻微的酸败和值为1.5时显示了极端的水解酸败,产生一个非常明显的风味和质地的变化。


图6
水解酸败(AVD) Adobera奶酪CP治疗后。虚线代表阿德的极限值,值> 1.5副词表示高酸败。

4所示。讨论

冷等离子体(CP)是一种新兴技术,已作为卫生处理的另一种方法在食品行业,因为健康食品fresh-like外观现在所要求的消费者(29日]。一项研究中,活性氧和氮物种(ROS和RNS)所产生的冷大气压等离子体破坏微生物的DNA。等离子体所产生的ROS和RNS可以诱导dna蛋白质交联(dpc)的细菌,酵母,甚至人类细胞。一些例子CP云内的高度氧化自由基O2分子氧(O2),超氧化物阴离子(O2−)、臭氧(O3)、过氧化氢(H2O2)、羟基(哦−)、过氧化氢(ROO−),氢过氧化物(ROOH)等30.]。

我们获得了类似的结果丢等进行的研究。31日),三种不同类型的等离子体或气体混合物(氦单独或与1%氧或氮1%)被用来对付大肠杆菌。He-O的结果2等离子体是最激进的反对大肠杆菌和显示更快的杀菌效果。氧化应激引起的等离子体处理导致严重破坏细菌,尤其是膜渗漏和形态学变化。生化分析大肠杆菌大分子表示巨大的细胞内蛋白质氧化。然而,活性氧和氮物种不是唯一的演员参与大肠杆菌死亡、电场和带电粒子可能发挥重要作用。在其他的研究中,他们使用介质阻挡放电(DBD)和表面屏障放电(作为)来分析他们的功效鼠伤寒沙门氏菌生物膜和单核细胞增多性李斯特氏菌压力,在不同等离子体强度(13.88,17.88,21.88 V的输入电压)。他们获得减少3.5 log10在这两种细菌,使用DBD电极,0.0 (v / v) % O2,21.88 V的输入电压32]。

在我们的工作中,CP的治疗是有效的钝化病原菌接种Adobera奶酪。D的值来自两个产生的斜坡,在细菌的混合的情况下,分别为0.20和6.60分钟,分别下降6对数周期。类似于我们的研究(33)显示了大气压等离子体的功效(APP)切片奶酪和火腿接种3-strain鸡尾酒单核细胞增多性李斯特氏菌。工艺参数是输入功率(75、100、125和150 W)和血浆曝光时间(60、90和120秒)。应用治疗150 W 120秒之后,提出了更大的强度的等离子云计算和消除情况下的能力。可行的细胞l . monocytogenes减少8日志减少,减少的l . monocytogenes在切片火腿,在120秒年代范围从0.25到1.73的日志CFU / g。150 W的D值获得17.27秒in-sliced奶酪和in-sliced火腿是63.69秒。这些结果表明,治疗CP的失活效应l . monocytogenes研究了歌et al ., 200933),而细菌的混合物(大肠杆菌写明ATCC 25922,沙门氏菌ATCC13076,金黄色葡萄球菌写明ATCC 6538)接种Adobera奶酪,强烈依赖于类型的食物冷等离子体处理。

Wan et al .(2019)演示了通过一个表面的扫描电镜分析,新鲜奶酪接种英诺克李斯特菌,不同的表面粗糙度和微观结构的奶酪,产生巨大影响的功效冷等离子体处理,由于粗糙度和表面保护防止微生物的有效渗透CP [34]。

在我们的例子中,冷等离子体处理,图形得到系统不同的斜坡上,获得两种不同的十进制减少。第一维的所有治疗在短时间内治疗细菌引起严重的破坏。而第二个D对应的变化斜率值大于第一,表明损伤会产生后将需要更长的时间但连续性的破坏(见表1)。Moisan等人援引几个山坡的存在表明微生物减少紫外线照射破坏首先是由于遗传物质的微生物。第二个现象是由于微生物的侵蚀,原子的原子,通过内在photodesorption最后另一个微生物的侵蚀,原子的原子,造成高氧化活性等离子体物种的吸附在随后进行的微生物与化学反应形成挥发性化合物(35]。另一项研究显示了如何治疗CP破坏细胞壁,释放微生物胞质材料和propidium碘的帮助下,与DNA结合,导致荧光显微镜下可观察到荧光。本研究也证实了微生物的DNA是如何退化DNA的提取和电泳获得在不同治疗时间19]。

CP减少微生物负载的影响取决于几个因素,最重要的是电压和频率、输入功率、处理时间、类型和成分的气体,流量和接触模式样本的消毒。另一个因素是等离子体产生的活性物种和自由基,可以与磷脂和蛋白质存在于细胞膜造成离子和化学相互作用,从而破坏质膜(29日]。

理论上,蛋白质水解,水解酸败一直视为营养质量损失的主要原因之一,同时,导致奶酪(关心食品安全36]。在Adobera奶酪,一些纹理的变化,观察软化和颜色变化等;然后,蛋白质和脂肪的氧化可能是这些变化的原因。因为味道化合物溶于脂肪超过水,脂质氧化会导致失去的味道。脂肪的比例和结构可能影响奶酪的流变性质,如纹理(37]。获得的结果在Adobera奶酪和酪蛋白样品接受CP治疗相似的行为羰基化合物的氧化曲线。

然而,Adobera奶酪了很高比例的蛋白质氧化,可能由于氨基酸与官能团能够直接在侧链氧化如赖氨酸、苏氨酸、精氨酸、脯氨酸(38]。

长期治疗CP的氧化蛋白质,改变氨基酸和二级,三级,四级结构相同的引起蛋白质构象变化和演变导致分裂,交联的形成、演变和构象变化。精氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、苏氨酸、色氨酸进行羰基化反应由于活性氧攻击由CP [39]。另一方面,蛋白质分离血清CP对待,它会修改组的侧链氨基酸,尤其是北半球−或NH2的部门肽债券和羰基官能团的增加(39]。

在我们的工作中,水解或蛋白质结构变化测试没有完成,但有报道称,蛋白质变性和聚合形成已报告在暴露于寒冷plasma-treated巧克力牛奶饮料造成不良的味道和气味40]。另一方面,另一项研究表明,冷等离子体效应可能不会引起明显的变化在乳制品感官性状,如果低压(Pa) 16日或氮气,因为没有活性氧的形成。然而,它可能会导致轻微的脂质氧化或重要蛋白质聚合如果使用空气和高电压(60 kV),延长治疗时间超过30分钟,导致产品质量损失和异味41]。

产生的脂解作用通常是甘油三酯的水解酶活性。由于脂类分解,产生游离脂肪酸和其他产品一起在以后的阶段的退化,如醇、酯、醛、酮、内酯。这些是主要的有机挥发性化合物的特征香气和口味的奶酪42]。ROS主要产生冷等离子体云与脂质破坏双键的不饱和脂肪酸,形成一种酸激进,它就会被氧化成脂氢过氧化物。氢过氧化物的分解可以启动不同的反应,如脂质或脂肪酸链的结合通过过氧化醚或桥梁的形成。氢过氧化物被转换成短链脂酰化合物和醛。二次氧化产品,如醛、食品中引起其他反应,产生不愉快的味道和负面影响产品的感官品质(39]。

在我们的研究中,由于CP治疗Adobera奶酪,观测到一些感官特征由于蛋白质和脂质氧化中包含的奶酪。迫切需要监管食品安全的前提下通过有效的CP卫生食品质量。大气CP的应用研究对于食品的应用程序,主要是作为一种工具消除微生物的消毒步骤。这导致增加兴趣使用CP消毒肉类,家禽和奶制品,所以有必要继续进行更多的研究来评估冷等离子体的疗效在不同食品的处理43]。

5。结论

介质棒放电反应器是一种有效的方法,微生物的失活Adobera奶酪片。可以减少每个菌株的细胞浓度超过5对数周期,以及在3表明细菌的混合物。另一方面,治疗应用于Adobera奶酪引起严重的氧化,蛋白质和脂质,导致改变口感和气味。进行进一步的研究来优化很重要,冷等离子体的流动和能量参数为应用程序之间可以找到一个平衡点微生物种群的减少,蛋白质和脂质氧化。我们将演示应用程序和治疗CP的局限性Adobera奶酪,因此,我们建议在未来的冷等离子体研究乳制品不仅应该考虑微生物失活的安全和质量的食物,而且还要验证的营养质量和消费者的感官知觉。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

一个。U和。P概念化的研究,提供了资源和管理该项目。一个。U, S。P C。年代设计的方法。一个。U, S。P, R。年代,和一个。D performed the formal analysis. A.U, S.P, P.M, and C.S performed the investigation. B.L, R.S, and C.S curated the data. A.U, J.S, A.D, and R.S wrote the original draft. R.S, C.S, P.M, and B.L wrote the review and edited the manuscript. All the authors have read and agreed to the published version of the manuscript.

确认

作者感谢提供的支持中心大学的科学和工程大学的瓜达拉哈拉开展这项工作。