抗微生物药物耐药性趋势金黄色葡萄球菌摩洛哥北部家禽携带的菌株:初步分析

摘要

通过食物消费将抗生素耐药性传播给人类是一个全球性的公共卫生威胁。本研究旨在评估鼻咽部运输金黄色葡萄球菌并调查抗菌药物敏感性和毒力相关基因。在Tangier屠宰场采集鸡的鼻咽拭子，并立即运输到微生物实验室进行表型鉴定和抗生素敏感性评估。16S rRNA的存在nuc,mec一个,mec所有分离株均采用PCR方法检测C、Panton-Valentine白细胞杀死素(Panton-Valentine leukocidin, PVL)和中毒性休克综合征毒素1 (toxic shock syndrome toxin 1, TSST-1)基因。共采集鼻咽拭子548份，其中17份(3.4%)金黄色葡萄球菌积极的。半数以上(54%)菌株对青霉素耐药，对四环素耐药29.4%，对红霉素耐药23.5%，对环丙沙星耐药17%。的mec一个和mec在所有回收的菌株中均未发现C。的金黄色葡萄球菌回收时，29.41%的分离株为致毒菌株;PVL和TSST-1编码基因阳性率分别为17.64%和11.76%。抗生素耐药和致毒趋势金黄色葡萄球菌在丹吉尔食用的家禽携带的病毒引起了极大的关注。应采取预防和遏制措施，以限制抗性基因在食物链中的传播，并降低其增加的速度。

1.介绍

世界卫生组织(世卫组织)指出，抗生素耐药性被认为是全球人类健康日益严重的威胁[1,2］．根据美国疾病控制与预防中心(CDC)的数据，至少有280万人感染了耐抗生素感染，超过3.5万人因此死亡[3.]。英国一项关于抗菌素耐药性的研究估计，全世界每年有70万人死于抗菌素耐药性感染[4]。

众所周知，动物工业食品生产设施是人类接触耐抗生素的一个来源金黄色葡萄球菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)5,6]。该系统采用密集限制，需要为治疗和/或预防目的定期实施抗生素，同时在家禽生产系统中使用抗生素作为生长促进剂，以确保不断增长的世界人口获得足够的食物[5,7,8］．大量食用动物促进了新的抗抗生素细菌的选择，这将增加人畜共患病传播的风险[6]。人畜共患的耐药细菌和耐药基因不仅可传染给与家畜有职业性接触的人，也可通过与动物直接接触、通过食物链或通过环境传染给社区中的其他人[9,10]。

金黄色葡萄球菌是一种病原体，已知会寄生并感染人类和动物，也会污染食物[6,11,12］．的致病性金黄色葡萄球菌与大量促进宿主免疫应答粘附和逃避的毒力因子的表达有关[13]。某些毒素与特定疾病密切相关，死亡率高，如中毒性休克综合征毒素(TSST)和潘通-瓦伦丁白细胞杀素(PVL)毒素，直接参与坏死性肺炎的病理，诱发白细胞增多和组织坏死[12- - - - - -14]。

的进化金黄色葡萄球菌在抗生素时代，出现了许多有毒菌株，其中许多包括获得耐甲氧西林的抗生素[15,16]。在世界范围内，MRSA的高负担首先在医疗设施中报告，其次在社区中报告，最后在家畜环境中报告[6,10,15- - - - - -18]。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌可能在所有地理区域的不同生态位之间传播，造成重大的医疗费用[2- - - - - -4,6,9,10,17]及食用动物业的有关经济损失[2,11,15- - - - - -17]。

尽管抗生素耐药性对牲畜的潜在影响巨大，但我们对抗生素耐药性的了解金黄色葡萄球菌在丹吉尔食用动物之间的运输仍然有限。

据我们所知，目前的研究旨在确定，这是丹吉尔第一次，年代．葡萄球菌通过禽鼻咽部携带来描述抗菌药物敏感性和TSST和PVL毒素基因在恢复菌株中的分布情况。

2.材料和方法

2．1．隔离金黄色葡萄球菌以及来自鸡的MRSA

2016年2月至5月在丹吉尔的大型肉鸡屠宰场取样。屠宰后立即使用普通无菌干棉签(Euroturbo, Deltalab, Spain)分批随机抽取鸡鼻咽样本。所有样品保存于4°C，待表型和分子检测分析。

2．2.检测金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

拭子接种到含有6.5% NaCl的10 ml Mueller-Hinton培养基(Oxoid, Basingstoke, UK)中，然后在37°C孵育过夜，并在选择性培养基chromogen (UriSelect™4 Medium)上传代。一个金黄色葡萄球菌每个盘子上都有隔离带。

进一步进行表型鉴定金黄色葡萄球菌过氧化氢酶、革兰氏染色和dna酶检测。

2．3.PCR分子鉴定

所有分离株均通过PCR检测16S rRNA编码基因，nuc,mec(19]。对甲氧西林的耐药性也进行了测试mec如上文García-Álvarez等所述，通过PCR检测C基因[20.]。

如Denis等报道的，采用PCR方法筛选PVL和TSST-1的编码基因[21]。金黄色葡萄球菌株ATCC 29213 (nuc-阳性)，ATCC 2011S359 (mecc阳性)，ATCC 43300 (mec一个积极的),FRI913 (结核菌素-阳性)和MW2 (lukS/ f - pv阳性)作为PCR阳性对照。

２.４.抗生素敏感性测试

所有的金黄色葡萄球菌对获得的菌株进行了对11种抗生素的敏感性评估:青霉素、头孢西丁、四环素、氯霉素、磺胺甲恶唑/甲氧苄啶、克林霉素、红霉素、环丙沙星、福西地酸、庆大霉素和卡那霉素。根据欧洲抗菌药物敏感性检测委员会(EUCAST)的建议，为每种抗菌药物敏感性建立断点[22]。万古霉素(盐酸万古霉素;Sigma-Aldrich;采用源自EUCAST的方法，采用微量肉汤稀释法测定所有分离株的mic [22]。

3.结果

3．1.抗生素敏感性

金黄色葡萄球菌在542份检测样本中有17份(3.1%)被检测出。我们发现，大约三分之二(11/17,64.7%)的菌株对一种抗生素产生了耐药性，8个菌株(47.05%)对至少两种抗生素产生了耐药性。甲氧西林敏感人群的多药耐药模式金黄色葡萄球菌应变列于表1．对青霉素耐药9株(52.94%)，对四环素耐药5株(29.4%)，对红霉素耐药4株(23.5%)，对环丙沙星耐药3株(17.64%)。17个都没有金黄色葡萄球菌分离株对头孢西丁、克林霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、磺胺甲恶唑/甲氧苄啶和万古霉素耐药。

3．2．毒素基因筛选

总的来说，从17金黄色葡萄球菌3株(17.64%)PVL阳性，2株(11.76%)TSST-1编码基因阳性。这些金黄色葡萄球菌殖民地进行mec一个和mecC基因。

4.讨论

几项特别关注抗菌素耐药性食源性传播风险的研究报告了存在的情况金黄色葡萄球菌以不同比率饲养的家禽[18,23- - - - - -26]。

目前的研究表明金黄色葡萄球菌鼻咽的马车(17/542;3.1%),鸡．不幸的是，我们无法将我们的发现与摩洛哥的数据进行比较，因为没有关于鼻咽运输的研究金黄色葡萄球菌在全国范围内都有。我们最近发表了一项研究[27，以确定鼻部运载率金黄色葡萄球菌在农场动物。然而，比较这两项研究相当困难。在我们之前的工作中，在筛查前的三个月里，动物农场没有抗生素治疗的历史;相比之下，我们没有关于在这项工作中使用抗生素治疗的信息。

我们普遍存在的金黄色葡萄球菌与在阿尔及利亚不同地区进行的一项研究相比，家禽的鼻咽携带率仍然非常低，该研究报告的比率因家禽种类而异，在48.4%至73.6%之间[23]。尼日利亚的另一项研究称，鸡的死亡率为38.33% [25]。较高的金黄色葡萄球菌在南非德班都市区周围的肉鸡屠宰场和零售店中发现的含量在40%至54%之间[24]。

根据来源国、资源环境、家禽标本、取样方法和屠宰期间的卫生做法，毒株发生和易感性的数据已显示随时间而变化[23,24,26]。旨在确定总体发生的荟萃分析金黄色葡萄球菌在不同地理区域的家禽生产[26]的研究结果显示，MRSA的合并流行率在非洲为16%，在欧洲为15%，在南美洲为27%，在北美为1%，在亚洲为2%。基于分子分型，该meta分析的数据表明，MRSA菌株可能沿着生产链从动物传播到人类，反之亦然。在一些非洲国家，从家禽和家禽产品中分离出的MRSA的频率更高，这与我们的结果不一致，阿尔及利亚为36% [23]，尼日利亚占38.33% [25]，南非占32.60% [24]。无论禽肉上的这些机会致病菌是在屠宰前/后立即出现，还是可能受到肉类加工人员的污染，都对食物安全构成威胁，并严重影响公众健康[5]。在我们的研究中没有发现MRSA菌株。

在我们的研究中，我们发现52.94%的菌株对青霉素耐药，对四环素耐药29.4%，对红霉素耐药23.5%，对环丙沙星耐药17.64%。然而，我们的分离株对头孢西丁、克林霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、磺胺甲恶唑/甲氧苄啶和万古霉素均无耐药性。我们的耐药模式通常低于公布的数据。Mkhize等研究从家禽中回收的菌株对四环素的耐药率较高(79.4%)，其次是氨苄西林(65.1%)、头孢西丁(60.3%)和红霉素(57.1%)[24]。Benrabia等人最近的另一份报告显示，82.5%的病例对四环素耐药，70.6%的病例对红霉素耐药，68.6%的病例对克林霉素耐药，50%的病例对环丙沙星耐药[23]。然而，我们的大多数耐药模式仍然高于另一项由Mairi等人进行的研究，他们报告了青霉素、头孢西丁、氧氟沙星、红霉素和二甲胺四环素的抗菌素耐药率分别为73.9%、4.3%、1.4%、8.6%和1.4% [18]。目前研究中的抗菌素耐药性比率高于我们之前报道的农场动物(分别为29.4%和23.5%，而四环素和大环内酯类分别为16.7%和11.9%)。有趣的是，我们在目前的工作中观察到环丙沙星的耐药率为17.64%，而这种抗菌药物耐药性在上述研究中没有出现[27]。

一般而言，拟在丹吉尔食用的家禽携带的菌株与大多数非洲国家所列的菌株相比，耐药率较低[23- - - - - -25]。然而，考虑到受抗性影响的分子的性质，以及如果不采取预防和遏制措施来限制抗性基因的增长和传播，可能导致的潜在后果，目前的发病率引起了巨大的关注．事实上，这些抗性基因可以通过水平转移在同一宿主的细菌之间进行交换[28，也可以通过与动物直接接触，或通过食物链进入社区和环境，从而避开障碍进入其他物种[6,10]。

有趣的是，似乎显示出耐药性的抗生素是那些在世界各地和摩洛哥家禽养殖中使用的抗生素[7,29]。这类抗生素的频繁使用和持续暴露可以为对这些抗生素有抗性的突变体创造一个选择性的环境。因此，这些耐药性可在我们的机构中大量使用，或可作为跟踪人畜共患病传播的标记[30.,31]。此外，在家禽分离株中观察到的对氟喹诺酮类药物的耐药性证实，摩洛哥的大问题是在人类医学、兽医医学或近亲繁殖中不恰当地使用这种分子，从而导致对各种细菌产生耐药性，例如金黄色葡萄球菌以及肠道微生物群的其他菌株[7,8,29,32]。

摩洛哥意识到抗生素耐药性的负担，自2002年以来一直试图通过法律规范家禽养殖(49-99;2002)。国家食品健康安全办公室(ONSSA)通过其食品安全监测项目证实，家禽养殖符合国际安全标准[33]。然而，监测和控制系统仍然不足，仍面临若干挑战，特别是在合理使用抗生素和为治疗、预防或增肥目的提供抗生素处方方面[7,8]。在食用动物生产中过度使用抗菌药物，特别是四环素，如生长刺激抗生素，被认为是最重要的做法之一，这可能会导致耐药突变体的选择[7,8]。摩洛哥仍然有可能轻松地遏制抗生素耐药性问题。尽管如此，我们仍应认真考虑实施“一个健康”概念，该概念建议在人类、动物和环境保健的所有方面开展有效的多部门、多学科和跨国合作[34,35]。

除耐药外，致毒素率相对较高金黄色葡萄球菌由于从鸡身上提取的菌株对动物和人类健康的影响，引起了许多研究人员的极大兴趣[10,14,18]。在社区中出现健康人士携带的相同毒力基因[36]或在同一地理区域的农场动物[27]显示了这种毒性基因传播和分布的可能性[10,12]。虽然还没有评估不同菌株之间的系统发育关系，但可能提示毒力基因跨越物种屏障的能力。

我们的工作有一些局限性。这是一项单中心研究，开展时间短，鉴定出的分离株数量较少。因此，很难认为这项研究与流行病学有关。缺乏分子分型技术来鉴定这种病原体的流行克隆是我们工作的另一个限制。因此，我们不能对鼻咽部运输提供确切的结论金黄色葡萄球菌在我们的地理区域，抗生素耐药性模式，以及毒性基因在家禽中的传播。

5.结论

总之，据我们所知，我们的研究首次在摩洛哥北部展示了抗生素耐药性模式，并揭示了更高的致毒素率金黄色葡萄球菌在供人食用的家禽中。这些发现需要进一步的研究。为了管理这一全球负担，评估抗生素耐药性通过食物链传播的风险至关重要。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

作者想要感谢家禽屠宰场，它允许我们为这项研究收集样本。作者也要感谢所有的工作人员在抽样过程中给予的帮助。

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