文摘

桉树marginatal在传统医学有重要价值,最近已被证明拥有许多体外药理属性。本研究的主要目标是酚类化合物的提取参数优化桉树marginatal .叶子使用由超声波辅助萃取技术相比,浸渍使用响应面方法作为预测工具。因此,总酚和类黄酮含量一直在优化,考虑四个变量:提取时间、温度、液体到固体比,和乙醇浓度。最优ultrasound-assisted总酚和总类黄酮提取方法获得的内容是确保以下参数:t= 49.9分钟,T= 74.9°C,液体到固体比率= 39.5 ml / g,乙醇= 58.48%。最优提取已进行LC-ESI-MS分析。这种技术允许我们识别十酚类化合物:四个主要酚酸没食子酸(27.77±0.06µg / g DW)和原儿茶酸(37.66±0.04µg / g DW)和六个黄酮类化合物如quercetrin (150.78±0.02µg / g DW)和hyperoside (39.19±0.03µg / g DW)。这些绿色、高效的过程应该是一个有前途的选择来指导工业设计phenolic-rich植物提取物的生产。

1。介绍

桃金娘科是一个很大的常青树,在文献和许多同义词包括科学Calyptranthes oneilliLundell,Calyptranthes jombolona野生,尤金尼亚cuminiDruce。它包含大约3000个物种等桉树。这是一个大而强壮的树属于家庭;然而,一些物种现在分布在世界各地。它代表了大约27%的木材总量,是最重要的一个。桉树marginata很容易被它的花和水果。许多研究表明,抗氧化活性,这通常是由于与有趣的酚类成分,这种植物可以被广泛用于食品和医药行业1- - - - - -7]。以前的工作表明,桉树就像任何药用植物提供了一个原始的化学成分。每个器官分离属性重要因为它包含精油和酚类化合物,酚酸、黄酮和单宁。使植物更宏伟的构成和礼物本身作为一种天然的财富,因为它是在各个领域的使用,主要是医学领域(1,3]。如今,没有描述的特殊性桉树明显超过其精油和酚类成分的性质,这是现在很受大众欢迎渴望有效治疗自己用简单和自然的手段和指定为有趣的生物和生理目的和活动。事实上,许多研究团队发现桉树marginatal .提出几个属性的抗氧化,抗菌,抗癌,抗炎,抗真菌。此外,它是专为放松,情绪障碍,并缓解发烧,咳嗽,呼吸问题,甚至治疗痤疮的所有通过减少皮脂(3]。Ultrasound-assisted提取新技术用于一些领域如化妆品、制药、化学、食品等行业。此外,赛弗拉et al。8)和Ezzoubi et al。9]提到,超声波萃取允许他们得到提取物富含生物分子萃取时间短,比较传统提取技术。此外,Chemat et al。10)表明,香芹酮提取Carum carvi使用超声波治疗l .种子是高于使用索格利特获得。已经完成的比较研究[11]研究酚类化合物的提取收益率金合欢confusa使用超声波、浸渍和协助下提取热量。他们证实,超声治疗是最快速和高效的技术,它允许大幅增加的速度酚醛内容比其他方法的研究。

这项工作的目的是最大化获得的总酚和类黄酮提取内容桉树marginatal使用超声波和浸渍方法。为了达到这个目的,我们使用了Box-Behnken设计结合响应面方法(RSM)优化四个参数:提取时间(分钟)、温度(°C),液体到固体比率(ml / g),乙醇浓度(%)。此外,个人的酚类化合物存在于最优提取条件已确定并使用LC-ESI-MS量化。

2。材料和方法

2.1。植物材料和样品制备

桉树marginatal .树叶收集2020年1月,从Souiniet arboreta来自东北部省份突尼斯(35°54 N和8°48E半干旱生物气候下,492)。凭证标本的桉树marginatal . (LGVR 2020)是沉积在有机化学LR17ES08实验室,科学学院斯法克斯,斯法克斯大学突尼斯。只有健康的叶子已经收获在不同高度和立即运送到我们的实验室。在同一天,叶子都是地面使用电动磨(Retsch穆勒、Grindomix GM200,库尔特·Retsch GmbH Co .,公斤,汗,德国),10000转/分钟的速度,使用0.5 mm筛改善与溶剂接触。

2.2。浸渍和Ultrasound-Assisted提取
2.2.1。浸渍提取

简单地说,20克桉树marginata树叶粉被浸渍提取下根据实验设计和连续搅拌使用磁实验室瓶tt - ssm - 200, TT-DMS系列310 rad 1800 rpm(11分钟−1)(表1)。

表1
根据一项实验计划的操作条件。
2.2.2。Ultrasound-Assisted提取

提取方法都使用一个Elmasonic S60H超声波浴(埃尔玛汉斯Schmidbauer GmbH Co ., Singen。理想(德国)12]。的桉树marginatal .叶粉(2.5 g)是放置在一个烧杯(100毫升)和混合适量的提取解决方案(根据实验设计)(表1)。悬架是沉浸在水的烧杯的超声波设备和辐照预设提取时间。

对提取方法,提取当时绘画纸没有过滤。4纸和蒸发在40°C真空旋转蒸发器,直至干燥。每个样本被保存在冰箱+ 4°C到使用。实验进行了一式三份(表1)。每个提取方法是重复三次。

2.3。实验设计

响应面方法(RSM)是用于调查四个独立变量的影响总酚和类黄酮含量桉树marginatal .树叶提取物(13]。提取时间(分钟X1)、温度(°C,X2),液体到固体比例(ml / g,X3),乙醇浓度(%,X4)被选为独立变量,优化提取。样品在室温下保持避免热敏化合物的降解。在这项研究中,进行了实验中心合成设计(CCD)。值给出的实验因素水平表1和2。

表2
选中的CCD设计因素和水平。
2.4。总酚类和黄酮类化合物的内容

根据Folin-Ciocalteu总酚含量是评价方法根据Khedher et al。5)与轻微修改使用紫外可见分光光度计(贝克曼杜800)。总酚含量计算基于一个没食子酸校准曲线(R2没食子酸当量= 0.9978)和表达为毫克(GAE) / g干重(DW)。此外,先前报道的总类黄酮含量估计本hm et al。6]。总类黄酮含量是量化使用槲皮素标准曲线(R2= 0.9954)和槲皮素的表达为毫克当量/ g DW(量化宽松政策)。

2.5。LC-ESI-MS分析

LC-ESI-MS分析进行了使用LC-electrospray ionization-tandem质谱(日本岛津公司,日本京都)配备电喷雾电离(ESI)。一个Aquasil C18柱(热电子、Dreieich、德国)(150毫米×3×3毫米μ米)进行的Aquasil C18警卫队列(10毫米×3毫米,3µ米,热电子)被用于分析。流动相是在H(0.1%甲酸2O, v / v)和B(0.1%的甲酸甲醇,v / v)与线性梯度洗脱:0-45分钟,10 - 100% B;45 - 55分钟,100% b Reequilibration持续时间是5分钟之间独立运行。列温度维持在40°C,流动相流速为0.4毫升/分钟,注入体积是5µl。质谱仪的操作在负离子模式下的毛细管电压−3.5 V,喷洒气体流量的1.5 l / min,干气流量的12 l / min,一块源温度达到400°C, DL(线)溶解温度为250°C,从50到2000 Da全扫描光谱,和消极的电离模式−4500 V的电压源。酚类化合物的量化是在280和335海里使用四点回归曲线(R2= 0.989)标准(7]。

2.6。软件

NemrodW 2007软件被用于构建实验设计和实验数据的回归分析。

3所示。结果与讨论

寻找的条件,提高酚类化合物的提取桉树marginata叶子用浸渍和ultrasound-assisted方法。这是非常重要的考虑影响系统行为的变量。因此,分别综述了初步测试,以确定他们的实验领域以获得一个适当的RSM设计通过分析他们的一般模型反应。

3.1。的单因素实验初步研究浸渍和超声波提取方法
3.1.1。提取时间的影响

提取时间是一个重要的参数来减少能量和提取过程的成本14,15]。因此,提取时间范围从30到105分钟浸渍和从10到60 ultrasound-assisted提取方法。如图1(一)和图2(一个),我们可以注意到,最大TPC一直显示在60分钟和30分钟的浸渍提取和超声波提取,分别为(147.18和209.15毫克GAE DW / g,分别)。此外,提取时间> 60 > 30分钟提取方法不仅TPC也减少交通(图1(一)和图2(一个))。结果是在协议与报道Khedher et al。5)表明,最高TPC GAE(332.55毫克/ g DW)获得了一段提取t= 60分钟。最后结果也根据这些报道Ghafoor et al。16),Alu 'datt et al。17),Rubio-Senent et al。18),和风扇等。19]谁声称不再提取时间alperujo在水热条件下可能会引起降解酚提取或聚合反应和萃取时间增加总酚含量也降低了抗氧化活性和目标化合物的氧化造成的,主要是黄酮类化合物。

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图1
萃取时间的影响(a)、温度(b),比s / m (c)和乙醇(%)(d)对总酚和类黄酮含量桉树marginatal .叶子使用浸渍提取方法。
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图2
萃取时间的影响(a)、温度(b),比s / m (c)和乙醇(%)(d)对总酚和类黄酮含量桉树marginatal .叶子使用ultrasound-assisted提取方法。
3.1.2。温度的影响

酚类化合物的溶解度随着温度的增加而增加用于提取之间因为温度上升使传质容易溶剂和固体物质17]。显示在图1 (b)和图2 (b)提取、温度影响显著(p< 0.05)TPC和薄膜电路内容;浸渍和超声波提取方法,我们研究小组显示最高的TPC 50°C(分别为147.18和209.15毫克GAE / g DW)。另一方面,使用温度> 50°C显著降低(p< 0.05)TPC和薄膜电路(∼100 - 160毫克GAE QE / g / g DW和∼30 - 50毫克DW,分别)研究了提取方法。通过比较结果与文献中报道,可以得出结论,温度是一个重要因素有很大一部分酚醛内容;然而,这些化合物对热敏感;据估计,提取温度的增加导致实质上减少当温度超过沸点的溶剂。这将是蒸发在空气中引起体积的减少是由破坏萃取效率(20.,21),Samaram et al ., 201523- - - - - -25]。

3.1.3。液体到固体的影响比

液体到固体比例中扮演着重要的角色在酚类化合物的提取影响经济复苏。实际上,它的作用在提高萃取率的行为,因为它影响植物和溶剂之间的浓度梯度,保证材料的转移是引用文献[26]。因此,研究不同液固比的影响在酚类化合物的提取桉树marginata叶子,一个不同的液体到固体比例R变化从15到40毫升/ g。图1 (c)和图2 (c)表明TPC的最高价值和薄膜电路得到30 ml / g: 147.18毫克GAE DW / g和49.75毫克QE / g DW浸渍提取法和209.15毫克GAE DW / g和75.07毫克QE / g DW的超声波提取方法。这些数据让我们检查的重要性在提取溶剂量,但这并不妨碍我们说超过30 ml / g的获得酚醛内容不更可取的讨论朱镕基et al。26)和Mohammadpour et al。27]。不过,我们可以得出这样的结论:存在一个额外的溶剂系统中相当于一个低浓度的固体,这导致减少气蚀现象。作为文献表明,获得的液体到固体比有影响相当大的酚类化合物(20.,28]。

3.1.4。乙醇浓度的影响

对提取溶剂的性质是重要分子选择性,它必须有一个强大的亲和力和一个伟大的溶解能力。水作为溶剂提取的生物分子存在于植物来源;其极性溶解一些极地酚类化合物。此外,其他溶剂,如乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯及其混合物与水被广泛用于酚类化合物的提取没有毒性和丰富的原因,即使其他更有效的溶剂比水和乙醇29日]。不同浓度的乙醇已经从0%变化到100%;这些显著的效果如图1 (d)和2 (d)。酚含量最高已显示使用40%的hydroethanolic溶剂,而提取100%的乙醇混合物的低价值。几个类似的结果表明,乙醇的比例在提高性能提供了一个重要的角色对于酚类提取使用超声波治疗(30.- - - - - -33]。

3.2。响应面方法
3.2.1之上。模型拟合和响应面分析

响应面方法(RSM)是27日进行实验测试。获得的回归方程拟合多项式模型中的每个反应的实验数据如下方程(表3)。良好的适应回归模型估计的确定系数(R2),它的适应性响应值衡量,由于实验变异的因素及其相互作用。该模型很适合实际的数据R2接近一个。确定模型的系数(R2)分别为0.881和0.923,表明结果具有良好的精度,这证明了建立模型的能力范围的范围内使用。

表3
的反应在TPC和交通两种提取方法。

三维(3 d)响应面呈现2因素(斧头X和斧Y)和反应(斧头Z)(数据3和4)。数据3(一)和4(一)显示时间和温度之间的交互使用超声提取和浸渍方法,而s / m配给和乙醇浓度已经固定。增加t和T影响显著的TPC和交通。然而,经过长时间的提取时间和高温,TPC和交通减少。这些结果可以解释一些酚类化合物的降解过程如前所述Zhang et al。(2019)和(34]。的影响t和比例如图3(b)和4(b)。TPC和交通这两个因素的增加而增加,我们的研究小组得出结论,增加比s / m增强酚醛树脂化合物的溶解度。TPC和薄膜电路达到最大后增加t和乙醇的比例(数据3(c)和4(c))。像描述的那样et al。35),一些多酚易溶于有机溶剂(乙醇)。TPC和薄膜电路增加而增加T和比s / m(数字3(d)和4(d))。根据Kamarudin et al。36),增加T提高溶剂的渗透进入细胞。

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图3
响应曲面图TPC (mg GAE g1 DW)桉树marginata叶子提取物作为时间的函数、温度、比s / m,乙醇浓度浸渍和ultrasound-assisted提取方法获得的。提取时间(分钟X 1)、温度(°C,X 2),液体/固体比例(ml / g,X 3),乙醇浓度(%,X 4)。
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响应曲面图的交通(mg QE g1 DW)桉树marginata叶子提取物作为时间的函数、温度、比s / m,乙醇浓度浸渍和ultrasound-assisted提取方法获得的。提取时间(分钟X 1)、温度(°C,X 2),液体/固体比例(ml / g,X 3),乙醇浓度(%,X 4)。
3.2.2。优化的提取

使用超声波的方法,最大的TPC(∼210毫克GAE / DW)获得了超声时间为49.9分钟,温度为74.9°C,液体到固体比例是39.5 ml / g,乙醇的比例是58.48%。然而,最优条件使用浸渍方法如下:t= 88分钟,T= 74.42°C,液体到固体= 40毫升/ g,乙醇的比例等于59.65%最大化总酚类化合物(∼150毫克GAE DW)。出于这个原因,阿联酋可能被认为是一个经济和绿色提取方法提取生物活性的化合物。结果表明,UAE-RSM方法是非常有用的为了提高酚类和黄酮类植物原料中提取内容。

3.3。识别和量化的酚类化合物桉树marginatal .提取

两者的化学成分桉树marginatal .提取后获得的浸渍和ultrasound-assisted提取参数分析与LC-ESI-MS -模式(图5)。基于质谱和比较与参考化合物和文献数据(4,6,7,37- - - - - -39),发现化合物分为酚酸如金鸡纳,高卢人,原儿茶,p香豆、salviolinic反式阿魏,反式肉桂酸和类黄酮等hyperoside、芦丁、quercetrin,柚皮苷,槲皮素和柚苷配基。保留时间,pseudomolecular离子和每个确定酚类化合物的浓度在桌子上4。例如,化合物7 (tR21.742分钟)被确认为槲皮素糖苷配基,被分配根据m /主要峰的存在z609年以及在m /强大的高峰z301年在其ESI-mass光谱在负模式。化合物7女士2质谱在m /显示碎片z463年和301年,这可能是属性失去rhamnosyl glucosyl根,分别。这些结果证实了芦丁的存在(7]。此外,化合物的质谱12米/显示峰值z301的频谱的女士2分段表示各种离子物种:273、257、193和121。主碎片造成的损失28 Da,导致在m /碎片离子z273年。在m /碎片离子z257也损失获得的有限公司2分子。同时,在m /离子z取得了193年和121年分别通过消除- c6H4O2和C7H4O2从离子m /z301年。这些结果是一致的槲皮素的存在,如上所述,以前由Rigane et al。37]。另一方面,化合物13被确认为柚苷配基,根据(mh)−离子在m /z271年以及离子产生的女士2谱在m /z227、177、151、119和107年,在协议获得的片段的标准(40]。

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图5
高效液相色谱色谱酚类化合物的提取获得的浸渍(a)和超声(b)提取方法。1、奎尼酸;2、没食子酸;3、原儿茶酸;4,p香豆酸;5,反式阿魏酸;6,hyperoside;7,芦丁;8、quercetrin;9、柚皮苷;10、salviolinic酸;11日,反式肉桂酸;12日,槲皮素;13日,柚苷配基。
表4
酚类化合物中发现桉树marginatal .树叶提取最佳提取条件。

表中给出的量化确定酚类化合物4显示两种提取方法之间的显著差异(p< 0.05)。因此,我们的研究小组显示中的主要酚酸桉树marginatal . ultrasound-assisted提取得到的是原儿茶酸为37.664µg / g DW没食子酸(27.77紧随其后µg / g DW)。另一方面,没食子酸中的主要酚酸桉树marginata叶子通过浸渍(12.17µg / g DW)。另一方面,salviolinic酸存在于两个研究样本(0.75∼µg / g DW)。此外,从表4,我们可以得出结论,quercetrin中的主要黄酮类化合物量化两个研究提取物(181.10和150.78µg / g DW,分别由浸渍和ultrasound-assisted提取),其次是hyperoside(96.47和39.19µg / g DW,分别由浸渍和ultrasound-assisted提取)、柚皮苷(19.00和8.80µg / g DW,分别通过浸渍和ultrasound-assisted提取)、槲皮素(3.21和2.06µg / g DW,分别由浸渍和ultrasound-assisted提取)。另一方面,芸香苷和柚苷配基出现在非常低的金额:1.2∼µ0.2 g / g DW和<µg / g DW,分别由浸渍和ultrasound-assisted提取。据-赛义德et al。41),主要的非易失性化合物中确定桉树酚类化合物,对提取物的抗氧化活动作出了重大贡献。一般来说,几种酚类化合物如高卢、原儿茶、鞣花酸、槲皮素、槲皮素糖苷,柚苷配基,儿茶素,表儿茶素、芦丁、槲皮甙、芹黄素,杨梅酮已被隔离桉树提取(41,42]。此外,桑托斯et al。40)确定表儿茶素、儿茶素、槲皮素葡糖苷酸鞣花酸rhamnoside,鞣花酸,galloyl-bis-hexa-hydroxyphenyl (HHDP)葡萄糖,没食子酸,绿原酸,甲基鞣花酸戊糖桉树茅,桉树urograndis,桉树maidenii提取物。此外,桑托斯和同事(40识别和量化的酚类化合物桉树茅,桉树urograndis,桉树maidenii使用HPLC-MS技术。本研究通过比较获得的与我们的研究团队,我们可以得出这样的结论:酚醛成分中桉树森林物种和树叶显著不同。从这些结果,我们得出的结论是,这项研究可能提供有用的信息为工业生产生物活性化合物的提取桉树marginatal .叶子使用最佳工况参数。

4所示。结论

我们所知,本研究成功地用RSM为了优化总酚和总类黄酮的提取桉树marginatal .叶子使用浸渍和ultrasound-assisted提取方法对提取时间、温度、液体/固体比,和乙醇浓度。因此,最佳浸渍条件的应该如下:t= 88分钟,T= 74.42°C,液体到固体比例= 40毫升/ g,和乙醇的比例等于59.65%,而超声获得的最佳条件如下:t= 49.9分钟,T= 74.9°C,比率solvent-solid = 39.5 ml / g,乙醇比例为58.48%。酚类化合物的水平发现RSM,分别,GAE∼150毫克/克DW和GAE∼210毫克/克DW浸渍和ultrasound-assisted方法。

因此,该方法符合绿色流程定义的条款,因为它减少了加工时间,允许使用的替代溶剂(水乙醇)和可再生天然产品,并确保一个安全的和高质量的提取/产品。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以从相应的作者。

附加分

实际应用:桉树marginatal .叶子被细化使用“绿色”技术的一种有效的替代协议为了获得酚醛丰富的提取。因此,用响应面方法作为一种新的工具,超声波和浸渍方法的优化工艺参数包括提取时间(分钟),温度(°C),液体到固体比率(ml / g),乙醇浓度(%)。酚类化合物中发现的广泛桉树marginata为进一步应用程序提供了丰富的天然促进健康的特工在医学和功能食品。

的利益冲突

作者报告说,他们没有利益冲突。

作者的贡献

Ghayth Rigane和Hanene Ghazghazi贡献同样这项工作。Soumaya Hasni Hajer Riguene执行实践经验和写道,其后,和检查结果。Moufida a . Oueslati Olfa Khedher和阿米尔Bouallegue执行一些实际经验,协调所有的分析,计算结果和统计数据。Hanene Ghazghazi, Ghayth Rigane, Ridha本萨勒姆监督科学研究。

确认

作者感谢中国高等教育和科学研究、突尼斯、农业部、财政支持和教授Mohamed Rigane有用讨论英语。