香精油的抗炎作用草果植物脂多糖刺激RAW264.7细胞的果实

摘要

炎症是细胞损伤、感染或自身免疫激活的重要生理反应。促炎介质的过量产生可能导致慢性炎症，导致许多疾病，如风湿性关节炎、哮喘、多发性硬化和动脉粥样硬化。在这项研究中，我们首次评估了香精油的抗炎作用草果植物在RAW264.7小鼠巨噬细胞模型中的果实（AAE）。因此，AAE能有效地抑制LPS诱导的RAW264.7细胞产生一氧化氮₅₀数值为0.45 ± 0.11 μAAE还剂量依赖性地降低了两种促炎蛋白iNOS和COX-2在受刺激细胞中的表达。植物化学分析显示，挥发油的主要成分包括1,8桉叶醇（48.22%）、香叶醇（9.24%）、奈拉尔（6.72%），α蒎烯(2.43%)、和α-松油醇（2.28%）可能由于其抗炎特性而对抑制作用有很大贡献。结果表明AAE在慢性炎症预防中的潜在用途。

1.介绍

慢性炎症是长时间炎症反应的不良现象。促炎介质如细胞因子、白细胞介素、一氧化氮(NO)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧化酶(COX-2)的过量产生可能导致各种疾病，如风湿性关节炎、哮喘、多发性硬化和动脉粥样硬化[1]因此，控制促炎症反应是预防炎症性疾病发展的明智策略。自古以来，食物就被确定为预防疾病的重要来源。越来越多的证据表明，增加某些食物的摄入可能降低心血管疾病的风险，癌症和炎症[2，3.]。

草果植物Roxb.是姜科植物的一种，在越南和其他亚洲国家是一种常见的香料和食品调味品。这种植物的果实被用于传统医学中，用于治疗咳嗽、腹痛、呕吐、腹泻和疟疾。种子油在印度被用于有益于消化系统茎，适用于眼睑，以消除炎症[4，5]。到目前为止，关于该植物的化学成分和生物活性的研究还很少。最近,答:植物的在对37种越南植物区系的筛选程序中，精油被显示为有前途的抗利什曼病剂[6].甲醇提取物答:植物的表现出显著的抗菌活性粪肠球菌，金黄色葡萄球菌，产气肠杆菌，奇异变形杆菌,铜绿假单胞菌MIC值为3.41 ~ 9.63 mg/ml [7]。

在这项研究中，我们调查的植物化学成分的精油答:植物的结果表明，在LPS刺激的RAW264.7细胞中，一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, iNOS)和环氧合酶-2 (cyclooxygenase-2, COX-2)对炎症过程中两种关键酶的表达均有抑制作用。

2.材料和方法

2．1．植物材料和精油制备

果实答:植物的是2019年11月在河江省新鲜采集的。这些样本由生态与生物资源研究所(VAST) Nguyen The Cuong博士进行分类学鉴定，代金券样本保存在海洋生物化学研究所。样品(500 g)在cleenger型蒸馏器中蒸馏4 h，分离精油，用无水钠干燥₂所以₄．获得的油(AAE)在−5℃下保存直到使用。

2.2.精油的GC/MS分析

使用安捷伦GC7890A仪器与质量选择检测器(安捷伦5976C)进行GC/MS分析。HP-5MS熔融石英毛细管柱米 × 0.25 毫米内径×0.25 μM薄膜厚度)。载气为氦气，流速为1.0 ml/min。入口温度为240°C，烘箱温度程序为:60°C至220°C, 4°C/min，然后20°C/min至240°C。分流进样方式为1:142，检测器温度为240℃，进样体积为0.1μl、 MS接口温度为240°C，MS模式，即探测器电压为1300 五、 质量范围为40-400 Da为1.0扫描/秒。根据成分的保留指数，并通过将其质谱裂解模式与MS库（NIST08，Wiley09）中存储的质谱裂解模式进行比较，对成分进行识别。根据总离子电流计算成分相对含量，无需标准化。数据处理为MassFinder4.0。

2.3.细胞培养

本研究中使用的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系来自美国类型培养物收集中心（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）。细胞保存在补充有10%胎牛血清（美国犹他州洛根市Hyclone）和青霉素（100单位/毫升）-链霉素（100单位/毫升）的DMEM中 μg/ml）（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市Invitrogen）。培养物保存在一家公司₂培养箱加湿空气5%CO₂在37°C。

２.４.NO生成抑制试验

如前所述，检测样品对LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞产生NO的影响[8]。细胞按2 × 10播种于96孔板⁵细胞/孔培养18 h。用AAE对板进行预处理(从0.1开始µ克/毫升到100µG /ml)孵育30 min，再加或不加1μg / ml有限合伙人(大肠杆菌0111:B4；西格玛·奥尔德里奇，美国）。100 μL上清转移至其他96孔板，100μ加入l的Griess试剂。用XMark酶标仪(BioRad，美国)在570 nm处读取反应溶液的吸光度。用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)法评价96孔板中剩余的细胞液[9]以已知的NO生成抑制剂豆蔻素作为阳性对照[10]。

2．5．免疫印迹分析

RAW264.7细胞被收集并在裂解缓冲液(150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 5 mM原钒酸钠，蛋白酶抑制剂鸡尾酒(BD Biosciences))中裂解，然后在4°C和15,000 rpm下离心10分钟。等量的蛋白质在SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)上分离，转移到PVDF膜(Millipore，德国)。将膜在5%脱脂牛奶中室温封闭1小时，用合适的一抗进行探针检测，洗涤，然后与相应的二抗孵育。α-使用tubulin作为加载控制。该信号是使用ECL(增强化学发光)系统(GE Healthcare, UK)开发的，并在凝胶成像系统Azure c300 (Azure Biosciences, UK)中检测。利用ImageJ对捕获的图像进行分析和量化 ．1.53a（美国马里兰州国立卫生研究院）。

2.6.统计分析

数据以均数±标准差(SD)表示。统计意义由双尾未配对的学生的评估t测试和值小于0.05被认为具有统计学意义。

3.结果与讨论

3．1.气相色谱-质谱联用仪分析AAE中的植物化学成分

香精油答:植物的根据水果干重计算，通过水蒸馏获得的水果（AAE）产量为1.49%。通过GC/MS数据结合MS库分析，共鉴定出25种化合物（表1）1)．AAE的主要化学基团为单萜，占总含量的81%以上。其中，1,8-桉树脑(或桉树脑，48.22%)，香叶(9.24%)，海葵(6.72%)，α-蒎烯（2.43%），α松油醇(2.28%)、和β-蒎烯(2.18%)是水果油中含量最多的单萜。发现了四种脂肪醛，包括n-辛醛，2-辛烯醛(E, E)-十进位的，和(E, E)-十二醛，约占AAE含量的8.26%，同时只有一个倍半萜E-nerolidol(1.69%)。我们的研究结果与之前的报道一致，其中以单萜为主，脂肪醛和倍半萜基团的存在[6]。水果精油中含有55.2%的1,8-桉叶素，略高于我们的研究结果。两项研究中主要单萜类的相对数量分布相似。两种样品中单个化合物数量的差异可能是由于样品来源、采集季节或环境因素的变化造成的。高含量的1,8-桉叶脑不仅存在于答:植物的还有其他一些砂仁种类包括答:tsao-ko(23.87% - -45.24%)11- - - - - -13]及答:subulatumRoxb（20%–89%）[14- - - - - -16]取决于用于分析的设备部件。

3．2.AAE通过抑制iNOS和COX-2的表达减少lps诱导的RAW264.7细胞NO的产生

NO是各种生理和病理生理反应中的重要信号分子[17]。在lps刺激的巨噬细胞中寻找NO产生的抑制剂已经成为世界范围内开发抗炎药物的努力。通过检测AAE对lps刺激的RAW264.7细胞产生NO的抑制作用，研究其体外抗炎活性。初步筛选结果表明，当AAE浓度为100时，能有效抑制NO的产生(约100%)μg/ml。我们通过测定AAE的IC进一步评估其抑制活性的效力₅₀作为结果，IC₅₀AAE值确定为0.45 ± 0.11 μG /ml，略高于阳性对照小豆蔻素(0.59±0.18)μg / ml)。筛选浓度的AAE处理24 h后对细胞活力无影响(数据未显示)。接下来，我们研究了AAE对炎症过程中两个关键酶的影响:iNOS(诱导型一氧化氮合酶)，主要负责NO的生成和COX-2(环氧化酶2)，负责生成炎症介质如前列腺素E2 (PGE2)。western blot结果显示，AAE剂量依赖性地抑制了两种酶的表达。值得注意的是，浓度为0.3μg/ml时，AAE对iNOS和COX-2表达的抑制作用仍明显(图)1 (b)).据我们所知，这是首次报道这种有效的答:植物的精油。

植物化学物质被认为是植物样品生物活性的主要贡献者。在我们的研究中，我们发现水果精油具有显著的抗炎作用。AAE的主要成分，如图所示，是1,8-桉叶素，约占总油含量的48%。有趣的是，1,8-桉叶素分子机制研究表明1,8-桉叶醇可有效降低促炎细胞因子如TNF-IL-1的表达βIL-6和IC₅₀取值范围为0.2 ~ 7.0μ它被发现是一种有效的NF-抑制剂κB激活[18]。1,8-桉树脑在各种动物模型中也显示出其抗炎特性。该化合物被用于治疗支气管哮喘的临床试验。当使用强的松龙作为辅助治疗时，1,8-桉树脑在哮喘的呼吸量和质量上有显著改善。当强的松龙剂量减少36%时，效果仍然维持[19].AAE的其他主要成分，如α-蒎烯[20]，α-松油醇[21]，香叶醇[22]、neral和geranial [23也显示出抗炎作用。结果表明，果油中主要单萜对其抗炎活性有重要作用。

其他几种植物精油的抗炎特性砂仁物种被报道。果提取物答:tsao-ko在LPS刺激的RAW264.7细胞中显示出强大的抗炎作用[24]进一步的研究表明，由于该提取物诱导血红素加氧酶-1的表达，从而增加了Nrf-2的激活，因此达到了上述效果。从不同的提取物和分离的化合物中也获得了类似的效果答:tsao-ko［25- - - - - -27]Agnihotri等人研究了苹果果实精油的局部抗炎作用答:subulatum结果表明，与标准药物双氯芬酸相比，挥发油的活性适中[14].文件摘要A.紧凑型，类黄曲霉,答:vilosum也证明了它们的抗炎活性在体外和体内[28- - - - - -30]。有趣的是，很少有关于砂仁抗炎精油。在我们的研究中，我们报道了AAE是一种很有前景的抗炎剂，它能有效抑制lps诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞中一氧化氮的产生、iNOS和COX-2的表达。值得注意的是,答:植物的在传统上被用作一种常见的香料，表明其在治疗中具有安全效果。

4.结论

这是第一次，水果精油的抗炎特性草果植物Roxb。被调查。挥发油对一氧化氮的产生有明显的抑制作用;LPS刺激RAW264.7巨噬细胞中两种促炎酶iNOS和COX-2的表达。植物化学研究表明，植物挥发油中含有多种抗炎成分，包括1,8桉树脑(48.22%)、香叶(9.24%)、缬草(6.72%)、α蒎烯(2.43%)、和α-松油醇（2.28%）。这些发现表明答:植物的水果是预防慢性炎症的另一种天然来源。进一步的研究是必要的，以评价抗炎症的作用机制和非常有前景的精油的体内评估。

数据可用性

用于支持这项研究结果的数据包括在文章中。

的利益冲突

所有作者都声明他们没有利益冲突。

致谢

这项研究是由越南国家科学和技术发展基金会(NAFOSTED)资助的。104.01 - -2017.307。

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