结合一个COI具有下一代测序的微型条形码，用于加工肉制品中动物源成分的识别

摘要

为了揭示复杂或掺假加工肉制品中的动物种类，我们提出了一种新的结合细胞色素氧化酶的方法(COI)带有新一代测序(NGS)的微型条形码，可以准确有效地识别加工肉制品中的各种动物物种(猪、牛、羊亚科以及一些鱼、虾和家禽)。我们从51种可食用动物的140个序列中设计了一个通用引物。用克隆测序和微型条形码- (136bp)结合NGS方法分别鉴定了12个物种的生肉样品。通过Sanger测序，12个物种的微型条形码与目标物种序列完全一致。与克隆测序法相比，NGS法在准确性、灵敏度和检测效率方面都有明显的优势。在混合样品和7种深加工食品中均鉴定出不同种类的食用动物。此外,一些未标记的种类和可疑的污染是检测为好。

一。介绍

掺假食品的错误标签的问题，因为在2013年的欺诈性贴错标签的牛肉事件发生在欧洲，尽管严格的食品安全监管体系有所增加[1个]。关于食品欺诈行为并不少见，尤其是在鱼掺假[2个,三]。因此，食品真伪鉴定的科学研究和技术仍然具有挑战性，应该密切监测，因为它与公共健康、经济利益、宗教甚至生活方式都有密切的关系[4个]。动物源性深加工食品的物种鉴定技术是食品真实性的重要组成部分，尽管还需要进一步的发展。

在一般情况下，基于形态的传统的种类识别技术不适合于处理和熟肉制品。在过去的二十年中，DNA分子的检测方法，如PCR基因芯片和分子指纹技术，已成为物种鉴定成功的方法[5个,6个]。这种技术是基于信息的DNA片段和PCR技术（实时PCR，PCR-SSCP和PCR-RAPD），并已在食品真实性做法最近通过[7个–10]。然而，这些程序可能不是很适合重加工产品具有多个物种的成分。他们中的大多数可以识别特定的物种，但不是未知的或潜在的。此外，在设计特异性引物或耗时的困难是难以满足的准确和快速鉴定的需要。

随着测序技术的快速发展和DNA条形码数据库的不断更新和完善，物种鉴定领域出现了新的机遇。2003年，Paul Hebert和他的同事提出了一种适用于所有物种的DNA条形码存储库[11]。The 658 bp fragment of the cytochrome oxidase I (COI位于线粒体基因组）基因基于七个类别和动物物种的八个数量被选择用于物种鉴定。与刺胞动物门，平均的物种的98％的所研究的异常显示0％-2％种内发散度和11.3％的种间差异[12]. 赫伯特提议COI基因足以在多个物种之间进行区分，并作为大多数动物群的全球生物鉴定系统。在过去的十年里COI片段广泛用于从节肢动物到哺乳动物的不同物种动物的物种鉴定[13,14]和已经被用作用于食品认证物种鉴定工具，包括错误标记食品[15]。

另一种先进的分子技术，新一代测序（NGS）已经在动物和植物，转录组测序和宏基因组学研究的全基因组测序的研究中得到了广泛应用，如微生物多样性[16]。其中NGS技术扩增子测序与基因标记显示相结合的食品认证实践承诺，因为它能够满足检测目标生物体成分或揭示未知成分的需要。近年来，已经在中国的传统药物或动物DNA混合，但很少在加工肉制品[植物和动物来源的认证应用17,18]。

然而，它在肉类加工产品认证中的应用却面临着一些挑战。首先，由于罗氏454提供的技术在2016年被逐步淘汰，因此无法使用更长的读取时间。目前，NGS的读取长度仅为2 × 300 bp[19]。二，通用引物高保护应该被设计为混合肉制品。三，物种鉴定的靶基因的准确度应保证[20]。

为了考虑第一个挑战，一些小型dna标记(16S和12S核糖体RNA基因和细胞色素b (Cytb)基因）被设计[21–23]。他们已在检测被用于啮齿动物的样品（哺乳动物和鸟类）退化的原料的混合物[18,24]但很少用于加工食品的品种鉴定。16srrna引物的通用性有待于进一步验证，因为有人认为它的变异性小于COI和Cytb基因[25]。DNA条形码基于COI已证明可有效鉴别食用肉类品种[26]。广泛使用的Cytb的通用引物被认为是因为它们在很久以前就已经有了COI变得流行起来[27]。微型条形码的使用COI在2008年，他们在那里被用于物种鉴定主要真核生物组（动物，真菌，植物和原生生物）的第一次提到的[28]. 然而，这种小条码是有限的，因为它的启动位点没有足够的保守性来覆盖广泛的分类群[29]. 一些小型条码COI在鱼类物种鉴定中的探索与应用[15]、后生动物肠内容物[三十，以及海洋无脊椎动物[31]。

考虑到第二个和第三个挑战，迷你条形码COI将是它的准确性和普遍性更好的盯防，但是到目前为止，还没有为不同的肉产品认证采用了标准的小型条码[32]。相反，对于检测一种独特的成分或从混合物中发现未知成分，克隆测序可能是一个很好的方法，但各种工作程序和假阴性结果是难以避免的。扩增子测序(NGS)可能是一种更好的深度测序方法，更全面地呈现成分。

因此，对于肉制品揭示真正的动物成分，我们的研究旨在开发利用NGS技术与新的迷你条码混合物中的各种动物的鉴别方法。

2。材料和方法

2.1。引物设计

几百四十(n个 = 140)COI对动物的基因序列进行了BOLD（生命条码数据系统数据库下载，http://www.boldsystems.org/）和NCBI（美国国家生物技术信息中心，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。140个序列进行分析，用于搜索所呈现较小的种内间隙的目标区域和51个之间传统的经济物种，包括鱼类更大的种间差异（n个= 25)，虾(n个 = 6），家禽(n个 = 10），猪(n个= 3)，牛(n个 = 3), and Caprinae (n个 = 4). The priming sites were moderately conservative and universally enough for efficient amplification across all selected species. After multiple sequence alignments by MEGA v. 6.0.6 [33], a short fragment (136 bp) meeting the purpose was selected for further analysis.

最常采用的LCO1490[34]被选为我们的前底漆并命名为mini-COI-F： 5'-ggtcaaaatcataaagatgg-3'。反面底漆设计并命名为mini-COI-R：5'-ACTATAAAGAAGATTATTACAAAGGC-3'。引物的进一步的分析（引物二聚体，发夹结构，和特异性）通过寡7.0 [评价35]和BLAST（基本局部比对搜索工具，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。采用邻合树(NJ树)对微型条形码进行物种分化。我们使用MEGA v. 6.0.6中的P-distance模型构建了51种商业动物的目标DNA序列的NJ树。

2.2。样品采集

12种鲜肉和7种深加工食品均购自中国中山当地的一个食品市场。本研究的鲜肉样本由12个物种组成:牛(牛和水牛)、猪(家猪)、羊(羊)、鸡(家鸡)、鹧鸪、鱼(草鱼、鲢鱼、蓝鳞鲤、瓦鱼和鲳鱼)和虾(对虾)。经过大量加工的真实食品有肉丸(牛肉球、猪肉球、鱼丸、虾球)、调制牛排、香肠和中国香肠。

为了显示各样品的物种组成清楚，将样品分为四组：A，B，C和D A组由12层生肉的种类，但是PCR的并单独测序，组B和C是的混合物上述12种，B组与传统的克隆采摘进行测序，而C组用NGS测序，和组d由7种实重进行食品。的样本分组和检测方法的具体信息总结在表1个. A组用于确定动物种类。对12份生肉样品分别进行PCR产物测序鉴定。为了比较克隆测序法和NGS法检测混合样品中特有种的结果，我们设置B组和C组，A、B、C组的肉种相同，B组将12份生肉样品等重混合在一起，进行克隆测序。C组与B组制备方法相同，但用NGS法（扩增子测序）处理。D组采用新设计的小条码结合NGS方法进行检测：本研究采用新开发的NGS方法对7种深加工食品的动物来源进行了验证。

2.3。DNA提取和PCR扩增

A组用12把不同的刀从12份生肉样品的内部切取30毫克肌肉组织，以避免交叉污染。B组取A组标本，12种等重混合。C组的制备方法与B组相同，D组取每样200 g，与纯水按1 2（g/ml）的比例混合成糊状，用100 mg混合液提取DNA。为每个样品准备了三个平行试验。手术剪、绞肉机、搅拌器等工具使用前均经高温高压（121℃、0.25 MPa、20 min）和紫外线（1小时）消毒。DNA是用TIANamp基因组DNA试剂盒提取的。

在50中的靶片段的PCR扩增 μL总体积为10×PCR缓冲液(5μL），20 μ摩尔/ L的正向引物（1 μL），20 μ摩尔/ L的反向引物（1 μL)、2.5 mM dNTP (2μ5 U / L)μL Ex -塔克（1 ）μL), template DNA (50–200 ng/μL和1-3 μL）及ddh_2个O(最多50人μL).通过梯度温度PCR确定最佳退火温度。引物由中国苏州赛默飞世尔科技有限公司合成。

2.4。pcr直接测序以确定目标片段

First, the 12 selected animal species were identified by the normal length 658 bp DNA barcode for affirming their species [36]，然后对A、B、C、d组进行微型条形码扩增，为了验证微型条形码的预期物种鉴定结果与实际结果的一致性，将A组的微型条形码PCR扩增产物送至Thermo Fisher Scientific Corporation进行Sanger测序。所获得的序列使用核苷酸BLAST(上文提到的网站)进行分析，以确定其对应的物种。通过克隆测序和核仁测序，将这些序列作为进一步肉制品品种鉴定的参考数据集。

2.5。克隆测序

纯化，转化和克隆选择进行了向其中有迷你条形码B组获得要检测的阳性克隆的PCR产物，我们利用白蓝色噬斑的选择技术以从每个平行（重复独立实验鉴定130个阳性克隆）Sanger测序之前。

2.6。新一代测序流程和数据处理

对于组C和d都，我们使用安捷伦2100以评估（后PCR）的靶片段的DNA浓度。对于那些合格的样品（DNA片段的质量> 2.0 μg） BGI基因组学对DNA文库的制备、聚类和高通量测序进行了研究。选择Illumina-HiSeq 4000平台和PE150 bp测序策略。此外，我们选择Q20（>85%）以确保超过85%的序列被限制在1%的测序错误率内。

后测序和格式转换获得的原始序列数据。清洁读取诸如冗余用N基，适配器或多碱（超过10相同的基）读取被自动产生由readfq过滤（一个读传导系统）。高品质的读取被用于创建基于的读取重叠关系的标签。具有高变化的标签，使用FLASH [制造37]。reads重叠区域应大于15bp，失配率小于1%，不重叠的reads进行裁剪。通过USEARCH(一种独特的序列分析工具)对97% identity内的clean标签进行聚类，以生成不同的操作分类单元(Operational Taxonomic Units, OTUs) [38]。由于缺乏对动物的一个专门的数据库的，在NCBI BLAST使用达到的OTU的种类标注。

为了证明不同样品之间的相关性，主成分分析（PCA）在R统计环境（v3.0.3）[被加工39与ade4包[40]. 热图是使用基于聚类分析的gplots包生成的。聚类分析方法是利用欧氏算法和完备算法计算序列距离和序列丰度。

3.结果

3.1。小型条码之间的物种分化

NJ树的微型条形码COI(136 bp) and the standard barcode (658 bp) from 51 species are shown in Figures1（甲）和1（b）。根据微型条形码NJ树(见图)1（甲）），36种可在种的水平来区分（种间差异为超过2％），而其他（从属的15种加卢斯，安瑟，俄勒克罗米斯，卡拉修斯，和盘羊)只能在属级分化（同一属种间分化小于2%）。除了阿金特斯（标有粗体分支），其他的种内差异为2％以内。根据标准条形码NJ树（见图1（b）），41种可在种的水平上进行区分。其他（从属10种加卢斯，安瑟,Alectoris)只能在属级上进行区分。三种鱼类（以粗大的分枝为标志）的种内分化大于2%。

从图形比较NJ树1（甲）同1（b）其中，小条码（136 bp）的物种序列差异小于标准条码，如小条码无法识别5个物种，但小条码仍保留了标准条码的基本物种差异信息，成功地将大多数物种识别到物种水平。

3.2。目标片段的扩增条件和验证的优化

为了检测靶物种尽可能全面，PCR扩增条件进行了优化。12动物起源肉种类分别扩增并进行梯度PCR温度。我们发现，最好的退火温度在A组的物种为48℃，高品质的片段，而S12（中国鲳）在43℃下扩增最好。有时，48℃和45℃将导致在琼脂糖凝胶电泳S12阴性结果。在43退火温度℃，不能保证识别精度对所有研究的物种。因此，为了保证识别精度和NGS的测试检测灵敏度，对混合物中的退火温度设定在48℃。Finally, amplification was conducted under the following conditions: initial denaturation at 94°C for 3 min, followed by 30 cycles of 98°C for 10 s, 48°C for 30 s, and 68°C for 1 min, and a final extension at 68°C for 7 mins.

A组中的所有物种是由优化扩增方案成功地扩增和扩增的片段通过PCR直接测序验证。测序质量以及与测序信号映射分钟杂峰。After alignment in BLAST, the mini-barcode (136 bp) of each species showed 100% identity with the target species sequence.

3.3。生肉混合物的克隆测序检测

95.9%的平行试验克隆成功测序并鉴定到种级。在物种水平上确定的物种如表所示2个（见B组）。共检出9种，未检出3种（S6、S11、S12）。由于48°C不适合S12的检测，因此预计检测结果为阴性。但是，没有发现S6(背带吊裤带)及S11 (Branchiostegus argentatus）是出乎意料的。此外，其他三个物种（S4，S9，和S10）与各只有一个克隆来检测。三种（S1，S2，和S3）与在每个并行测试10-77个克隆进行检测。尽管肌肉组织的相等质量的不同种类，不同物种之间的序列丰度显著变化。此外，我们还意外地发现了两个克隆序列是从核基因（43U 9号染色体序列）中，用99％相同盘羊黄花GenBank数据库中的序列（CP011894.1）。也许，在O.加拿大一枝黄花以及导致假扩增的引物。

3.4。通过NGS生肉混合的检测

在读取质量过滤后，每个样本保留96.56%（239万次干净读取）。98.97%的OTU序列与GenBank数据库中的目标物种序列完全一致。

上确定种类的水平的品种列于表2个(见C组)所有12个物种均通过NGS检测，克隆测序仅检测到9个物种。S12 (中国鲳)以3 ~ 50的低序列丰度(<0.01%的总OTU序列丰度)进行检测。其余物种的丰度范围为0.04% ~ 28.37%。4个物种(S1、S2、S3和S4)的丰度分别为28.37%、28.20%、27.12%和8.97%。意想不到的物种,O、 加拿大，也有0.22%的丰度。

在深度测序的情况下（每次测试有40-50亿个单一读数），检测到一些意想不到的生物体，如鸭子、鳙鱼、苍蝇、蟑螂和人类。鸭的丰富度为0.08%，其余种类均小于0.01%。

3.5条。用NGS检测加工肉制品

测序后，至少1370000清洁读取双（剪接前的合格读取）与用于样品的94.16％的读利用率得到。检测每个样品的标记的成分（参见表三). 除了两种鱼类外，大多数生物都被鉴定到物种水平（与目标物种序列的一致性超过98%）(Upeneus和Trachystoma petardi）和虾的一个种（赤虾）。此外，未标记的成分被发现同时（以粗体物种表三)。的未标记的种类野猪从YW样品（鱼糜）用28.3％丰度总OTU序列的检测，并且每一个剩余的未标记的物种是约0.002％-5.2％。两个可疑的污染成分（牛和Trachysalambria curvirostris)大多数样品的丰度在0.01-0.08%之间。

由于可疑污染物的所述样本中存在的，主成分分析和聚类分析被用于评估样品之间的独立性。基于所述OTU序列和物种注释，在R（v3.0.3）执行的PCA图和热图在图被呈现2个。在PCA情节，得到两个主要组分（PC1和PC2）和PC1占全局变量信息和PC2 46.52％21.64％。在热图，各样品的主要成分呈现超过1％的相对丰度和在蓝色显示。21个测试组合物的鉴别是由PCA图和在热图簇树（垂直集群）中所示。

PC1(十- 协调）直观地反映XW（虾球），NJW（牛筋球），和NP（调制牛排）的样品中清楚地区别。测试在LC（中国香肠）的相对集聚，SNNY（猪肉丸），XC（香肠）和YW（鱼丸）很可能归因于猪肉成分。在热图的群集树表明，每个样品内的所有并行测试分组在一起。因此，存在检测结果的高重复性，且每个样品的相对独立性是不同对每个样品。

四。讨论

一般来说，迷你条码显示了与标准相似的物种识别COI基于51个物种的条形码分析。一些近缘种(普通牛和水牛)可以用迷你条码彼此区分。然而，很难区分同一属内的物种，例如，盘羊。他们的微型条形码比对显示99.26%的身份O、 白羊座其他两个品种之间的其他两个物种和98.53％的一致性。然而，也有由它们中的每间高同一性（平均97.27％）COIstandard barcode (658 bp), but the identity was still lower than intraspecies divergence [11]。为了区分近缘种好，基因标记的组合利用率可能是更好的选择，以获得更多的参考信息。

对于检测的意外序列盘羊黄花来自核基因的(丰度为0.22%)，极有可能是微型条形码太短，无法严格区分COI基因。以来O.加拿大一枝黄花原产于北美西部的干旱环境，不被认为是肉食动物，从中国中山是不可能在市场上得到这种动物的。这种情况只发生在研究的绵羊品种中，并且O、 白羊座以1.39%的丰度率进行检测。

根据混合样品的克隆的测序结果，S12的负检测很可能在48℃的更高的退火温度有关的低的扩增效率。有趣的是，这在独立扩增试验显示出高的扩增效率一些物种（S4，S5，S7，和S8）显示出低的检测率。虽然混合样品的主要生物可以通过克隆测序检测，假阴性或低检出率对于一些物种逐渐频繁。在克隆测序的检测结果的变化似乎是相关的PCR扩增偏压[18,41]，阳性克隆的随机选择，和相对丰度克隆进行检测。

NGS方法对混合样品中单个物种的检测具有较高的灵敏度。结果表明，S12扩增效率较低，且存在一些意想不到的成分或可疑污染物。可疑的污染物,鸭子和自大鲤鱼可能杂费附着在其他肉类样品在市场上买的,而苍蝇和蟑螂污染物可能是来自实验室的工作环境或处理设施,因为我们每年放大成千上万的苍蝇和蟑螂基因检测的实验室。人类可能归因于缺乏对操作规程的关注或安全协议,在操作过程中，偶尔被操作者的唾液污染。虽然污染物的检测灵敏度较高，但大多数指定物种(0.04% ~ 28.37%)和污染生物(0.01%以下)的检测丰度存在显著差异。

在比较B组和C组，该NGS方法在研究中显示，以检测混合样品中独特物种优异能力之间的结果。这种方法的优点包括（1）同时识别多个生物体在重加工产品，（2）发现意外成分或污染物;（3）高效，和（4）高的测序和数据的利用率高的精度。相反，在研究中也发现了NGS（扩增子测序）的一些缺陷：（1）这是无法避免的混合品种间扩增效率的差距，但值得一提的是其它NGS技术，作为全基因组鸟枪法可以得到这个问题的周围[42];(2)混合样品中检测到的丰度与成分质量之间不存在线性关系。考虑到PCR扩增偏倚和多拷贝基因在不同生物中的差异[29,43]，扩增子测序或使用的其它方法NGS的修改，可以更好地考虑用于进一步定量配料[44]。

NGS法检测了D组7种深加工肉制品中的所有标记种和部分未标记种。某些丰度在0.01%至0.08%之间的成分可能受到污染。某些低扩增度物种的丰度也较低。因此，为了区分污染和产品中添加的成分，使用来自D组的已知物种进行对照样品可以更好地避免污染的偏倚结果。由于空白对照样本无效，环境中少量DNA浓度无法扩增序列。此外，我们发现，为了防止交叉污染，通常的避免污染的方法是不够的。相反，在操作过程中要注意细节，确保用具的清洁。器皿仅在用DNA清道夫溶液清洗后使用，环境中的任何DNA在开始制备每个样品前都应进行紫外线降解。

5.结论

我们开发了组合的方法COI迷你条形码与NGS物种鉴定从生肉混合物动物起源物种的重和加工的肉产品。通过使用新的迷你条码，食用菌种（鱼，虾，鸟和哺乳动物）可准确识别。已知的物种和意想不到的种类的识别呈现的有利精确度，灵敏度，并且该方法的效率。为了避免食品污染，谨慎操作，清洁用具，和noncontaminated环境应得到保证。为了密切相关的物种之间进行区分，并减少竞争效率的影响，不同的DNA标记物的组合利用应予以考虑。这种方法提供了优势，以食品安全程序通过提供应用程序一个更好的协议，以确定动物源性成分和组成的加工肉制品。

数据可用性

用于支持本研究结果的所有样本数据，可根据要求从相应作者处获得。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

本研究由国家重点研发计划（批准号：2016YFF0203205）和中山市资助项目（批准号：2018B1022）资助。

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