磺胺类药物残留：蜂蜜质量在捷克市场

摘要

在这项研究中，我们确定在捷克共和国（布尔诺）在市场上销售的蜂蜜中四种磺胺化合物（磺胺嘧啶，磺胺，磺胺甲恶唑，磺胺噻唑和）。这些化合物的含量在50级蜂蜜具有不同植物和地理来源进行监控。分析前处理包括，用10％三氯乙酸（TCA），并用乙腈和二氯甲烷双提取酸性水解。通过超高效使用在正电离模式三重四极杆（QQQ）串联质谱（UPLC-MS / MS）液相色谱法（进行色谱分析ESI⁺)。分离，流动相为甲酸（A）和0.05％甲酸的甲醇溶液（B），用0-3分钟梯度洗脱0.05％水溶液：10％B;3-3。6 min: 90% B; and 3.6–5 min: 10% B, flow rate 0.30 ml/min. Three positive samples (6%) were found containing sulfadiazine (232.88 and 618.87 μ克/千克）和磺胺甲恶唑（62.64 μ克/千克）。根据原产国，其中两个蜂蜜都来自欧盟（EU）国家，一个被标记为欧盟和非欧盟国家的混合蜂蜜。

1.介绍

消费者把蜂蜜有益健康的天然产物，正因为如此，有质量和产生的健康益处的预期。价格高主要是由于季节性因素和蜂蜜在市场上有限的可用性的疾病蜂巢强度，对环境的污染，或在天气在任何一年的突然变化下降的结果。因此，蜂蜜是食品掺假非常频繁的目标。同样是在与有关蜜蜂抗生素的使用不符合立法的情况下，真实。

磺酰胺是对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，以及在人类和兽医学治疗原生动物使用广谱合成抑菌剂。这些药物都是很好的治疗药物和便利，并导致其在家畜的过度使用。其结果是磺胺类药物残留的动物起源（牛奶，肉，蛋，鱼，或蜂蜜）的食物。这对消费者潜在危害在耐药微生物，过敏反应，或毒性作用[发展方面1，2]。磺胺类药物的一种具体应用是对蜜蜂使用。1944年，黑斯曼和奇尔德斯试图在预防美国幼虫腐臭病的使用磺胺噻唑（Paenibacillus幼虫)。多年来，磺胺类药物也曾被用于治疗欧洲的“污病”(蜜蜂球菌plutonius），并在打击nosemosis斗争最近（疾病的api，N. ceranae）以下的烟曲霉素在欧盟的稀缺性。磺胺类药物也常常组合使用二氨基嘧啶（甲氧苄啶）。用磺胺噻唑钠的制剂作为活性成分被注册为美国幼虫腐臭病的控制，尽管这些药物，在蜂蜜抗生素残留导致该登记的在20世纪70年代撤出[的报警存在的表观功效2-8]。的使用和农药残留在环境中的存在可能是因为菌落崩症（CCD）的。这也有一个连锁农作物的产量效应，其中蜜蜂传粉的作用是不可替代[9]。

目前没有最大残留限量（MRL）在欧盟用于蜂蜜磺胺（和其他兽药产品），和治疗荨麻疹的与这些抗微生物剂被禁止[10，11]。但是欧洲立法不能支配生产者的行为贸易蜂蜜，所以它的质量往往不符合规定要求的，特别是有关非法使用欧盟抗生素和其他化学。这个问题也涉及到欧盟，其中对蜂群的治疗条件有很大的不同以外的国家。来自这些国家的蜂蜜，然后进入欧盟市场。在瑞士，蜂蜜最大残留限量设定为50 µ克/千克总磺酰胺，而在中国，相同的值被分别设置为每个磺酰胺[五]。作为监测计划的一部分，每个欧盟国家和国家参考实验室通过监测这些物质促进蜂蜜贸易并监督其遵守情况。尽管如此，仍有残留病例报告。食品和饲料快速警报系统(RASFF)确保在所有欧盟国家及时报告食品残留物，并从市场撤出任何不明或危险的产品[12，13]。

必须根据法律的要求选择食品样品制备的分析前方案和足够敏感的分析方法。大多数研究使用酸性水解(盐酸，三氯乙酸，或柠檬酸)作为测定蜂蜜中磺胺类物质的必要步骤。这将分析物转化为自由形式，并与超声处理、回火和萃取结合使用。在多残留分析中，考虑到抗生素族群及其理化性质，使用McIlvaine缓冲液和螯合剂(乙二胺四乙酸二钠盐，EDTA)。pH值范围宽的SPE墨盒或离子交换柱(Oasis HLB、Sep-Pak C18、SCX、Bond Elut)通常用于不同条件下(在线/离线)的固相萃取(SPE)。液-液萃取(LLE)通常利用乙腈与二氯甲烷的结合。液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)是测定样品中磺胺类化合物的主要分离方法。柱前或柱后衍生化后的荧光检测也被使用[1，8，14-17]。

本研究旨在评估欧盟成员国捷克共和国2018年第一季度市场上蜂蜜中磺胺残留的现状，并评估其是否符合欧洲法律。

2.材料和方法

2.1。标准和化学品

在这项研究中使用的所有标准和试剂均为分析纯。磺酰胺（SA）的标准：磺胺嘧啶（SDZ），磺胺多辛（SDX），磺胺甲恶唑（SMZ），磺胺噻唑和（STZ）均99.9％（Sigma-Aldrich公司，德国）;乙腈和甲醇LC-MS和二氯甲烷进行HPLC（Merck公司德国）;98-100％甲酸（Sigma-Aldrich公司，德国）;三氯乙酸，P.A.，和氢氧化钠（五角，捷克共和国）;氩气（林德气体，德国）。水LC分析，蒸馏水和去离子使用的Aqua渗透03（捷克共和国）。

2.2。仪表

以下设备在我们的研究中使用。从克恩分析实验室（巴林根，德国）分析天平;超声波浴（Kreintek，斯洛伐克）;水浴GFL 1002（GFLmbH，德国）;轨道摇床GFL 3005（留言Merci，捷克共和国）;pH计211的微处理器（哈纳仪器，罗马尼亚）;Hermle centrifuge, type Z 326 K (Labortechnik GmbH, Germany); vacuum pump ME 2NT (Vacuumbrand, Wertheim, Germany); vacuum rotary evaporator (Büchi Labortechnik AG, Flawil, Switzerland); Acquity H-Class UPLC separation module with triple quadrupole mass detector (QqQ) (Waters, USA); Acquity UPLC BEH C18 chromatographic column 2.1 × 100 mm, particle size 1.7 µ米（沃特斯，爱尔兰）;氮气发生器（派克，UK）;和真空泵SOGEVAC SV 40 BI（莱宝GmbH，德国）。使用是MassLynx 4.1软件（美国Waters公司）的结果进行处理。

2.3。蜂蜜样品

在这种监测研究，不同的植物和地理来源的50个蜂蜜是从捷克购买的零售商。来自欧盟国家的蜂蜜（：对样品进行分类的起源的区域分成三组第1组， ),来自欧盟和非欧盟国家的蜂蜜混合物（第2组， ),及来自欧盟以外地区的蜂蜜(第3组， )。

2.4。标准解决方案

SA的标准储备液通过在甲醇中溶解;the concentration of the stock solutions was 0.4 g/l, and they were stored at 4 ± 2°C for at most one month.

0.5，1.0，和5：在三种浓度制备用于该模型研究SA的工作溶液 µ克/升。在12次重复制备和加工的工作溶液的每一浓度根据第2.五。

2.5。样品制备

样品使用由Verzegnassi等人公布的协议的修改版本进行处理。[18]。称取2克蜂蜜，溶解在10毫升的10% TCA中。为了从蜂蜜基质中释放磺胺键并更有效地提取，对溶液进行超声处理15分钟，并在64℃水浴中软化1小时。冷却后，用1M和0.1M NaOH调节样品的pH至6.5。双液-液萃取(LLE)时，加入乙腈(8ml)和二氯甲烷(2ml)。混合物在振动筛上彻底摇动5分钟，5℃5000 rpm离心10分钟。有机层被转移到一个地面烧瓶中。溶剂在55℃的真空旋转蒸发器上蒸发干燥。样品在1ml的流动相A(0.05%甲酸)中重新组成，过滤到小瓶中进行分析。

使用与样品相同的程序处理的基质校准溶液从库存溶液中稀释，浓度范围为0.1-100μg / l (0.1;0.5;1;5;10;20;50;100年μg / l)。

2.6。色谱条件

磺胺物上的Acquity H-类UPLC进行分析。For separation, an Acquity UPLC BEH C18 column 2.1 × 100 mm with 1.7 μ粒径为m。采用MassLynx 4.1软件进行数据处理、定量评价和确认。流动相为水(a)和甲醇(B)的混合物，各含0.05%甲酸。建立梯度:0-3 min, 10% B;3-3.6 min, 90% B;流速0.3 ml/min，柱温35℃，注量5µ运行时间为5分钟。个别分析物的测量参数列于表中1。

2.7。质谱检测参数

Direct infusion of analytes was used to optimize the mass detector, and the concentration of each analyte was 2 mg/l. The precursor ions for SDZ, SDX, SMZ, and STZ (311; 251; 254; and 256 m/z respectively) were monitored in MS full scan. The subsequent MS/MS daughter scan revealed product fragments at 156, 108, and 92 m/z that correspond, respectively, to [M + H-RNH₂]⁺[M] + H-RNH₂-所以]⁺和[M + H-SO₂]⁺。所有的磺胺类化合物都具有相同的离子片段(156、108和92 m/z)，它们来自相同的结构骨架。

在正离子模式下的串联四极杆（QQQ）（进行质谱检测ESI⁺);流动相用甲酸酸化生成质子化分子。其余参数为萃取器电压3v、射频电压0.1 V、源温度120℃、溶析气体温度350℃、溶析气体流量650 l/h、雾化气体流量50 l/h、碰撞气体流量(氩气)0.2 ml/min、碰撞压力4.10^-3 mbar.

采用多反应监测(MRM)，每个磺胺选择两种产品离子(用于定量和确认过渡)。单个分析物的质量检测器设置和梯度值如表所示2。

3。结果与讨论

蜂蜜药品残留问题已引起人们的重视，在过去几年中被紧随其后的是专业和普通公众都。监测是由有关国家监管当局保证。通过RASFF门户网站，就可以从供应商和蜂蜜的生产跟踪可能的疑虑。Dmitrienko等。[19报告了食品中一系列抗生素残留物:20%磺胺类、19%氟喹诺酮类、15%氨基糖苷类、15%霉素、15% -内酰胺类、8%恶唑烷酮类和8%四环素类。2009-2013年，抗菌药物残留的发生率为71%，其中磺胺类占35%，其次为四环素类(15%)、硝基呋喃类(13%)、林酰胺类(13%)、氨基糖苷类(10%)、硝基咪唑类(8%)、大内环类(5%)和喹诺酮类(3%)[16]。很明显，磺胺类药物仍是抗生素治疗的首选药物之一。2008年至2018年10年间，向RASFF系统提交了78份关于蜂蜜和蜂王浆中兽药残留的报告，其中磺胺类药物23例(占29%)。阳性样品的浓度范围从3到865μ克/公斤。磺胺类药物发现是磺胺噻唑，磺胺甲恶唑，磺胺二甲嘧啶，磺胺二甲嘧啶，磺胺二甲氧嘧啶，磺胺嘧啶和[13]。磺酰胺（磺胺噻唑磺胺二甲嘧啶和）从乌克兰和摩尔达维亚蜂蜜残留的三起案件已报告在捷克共和国。除了在土耳其，中国，波兰，德国，墨西哥，比利时，葡萄牙，立陶宛，保加利亚，匈牙利，埃及，塞尔维亚[蜂蜜捷克，欧洲其他国家也记录磺胺类药物残留13]。捷克农业和食品检验局（CAFIA）也记录情况下，蜂蜜中所含除了磺胺二甲嘧啶和磺胺噻唑[氨基糖苷类抗生素链霉素和氯霉素的残留物20-22]。其中磺胺报道，研究一致包括磺胺噻唑，磺胺甲恶唑，磺胺嘧啶和[3，7，18，23]。其他如磺胺二甲嘧啶，sulfamoxole和sulfachloropyrazine只零星报道15，24]。此外，标准适合我们的分析方法对这些化合物，没有现成的，因此，我们决定只包括磺胺嘧啶，磺胺噻唑，磺胺甲恶唑，磺胺，并在我们的实验。

表3显示了我们的蜂蜜分析结果购买了捷克市场。它包括来自欧盟国家的蜂蜜（第1组)、欧盟及非欧盟国家的混合蜂蜜(第2组)，以及来自欧盟以外地区的蜂蜜(第3组)。值被给出为平均值的三个平行测定;“×”表示没有检测到所监测的分析物。发现含磺酰胺（以粗体突出）三蜂蜜，为此，SDZ（2x）和SMZ（1×）分析物在检测到232.88，618.87，和62.64 μ克/千克，分别与根据证实[12]。有两个案件分别来自第1组他们违反了法律。在第三种情况下，样本来自第2组，并且它可以假设SDZ残留的高水平可能是由于在非欧盟国家蜂巢治疗。然而，“零容忍”的立法也适用于这种蜂蜜对于到SAS。出人意料的是，没有任何的第3组样品中含有一定量的SAs。这可能是由于捷克市场上蜂蜜稀缺，只能从非欧盟国家获得。

Galarini等人[16]从意大利市场27种抗生素（磺胺，硝基咪唑类，喹诺酮类和）在74个蜂蜜分析。在九个蜂蜜（12％），在浓度发现磺胺2 μ克/公斤。这个频率是由意大利国家参考实验室的结果证实，与磺胺类药物的11％发生在样品2001和2007年间，包括高和低质量的蜂蜜中1500个蜂蜜样品。在波兰，20种蜂蜜进行了检查，并在浓度1在10个样品（50％）被发现5.6磺胺 μ克/公斤[25]。只有一种蜂蜜含有3.9μ克/千克的sulfamoxole通过Hu等发现。[24]总分51个样品进行分析。三十蜂蜜原产于希腊和进口的蜂蜜是由Economou的等分析。[23]。其中4个磺胺噻唑阳性(5.3和5.9)μ克/千克）和磺胺甲基异恶唑（1.5和3.4 μ克/千克）。作为展望2020方案的一部分，涓-博拉斯等。[7] 279个蜂蜜分析磺胺类原产于西班牙的瓦伦西亚地区。六个样本中的5-9阳性磺胺 μ克/千克，三个用于在磺胺嘧啶13-100 μ克/公斤。Verzegnassi等人[18]分析了蜂蜜原产于墨西哥，法国，瑞士，新西兰，越南等十磺胺类药物残留，发现磺胺甲恶唑为10.5 μg/kg和磺胺噻唑在114μ克/公斤。该值不符合瑞士通过了最高残留限量（50 μ克/千克总磺酰胺）。作为质量控制监测，Vidal等部分。[15]分析了磺胺类，大环内酯类，四环素类，喹诺酮类和在16个蜂蜜从西班牙（阿尔梅里亚，格拉纳达）和磺胺二甲嘧啶和磺胺氯哒嗪的发现的残基的内容。Frerichs等。[3[调查了德国蜂蜜(源自德国的蜂蜜和进口蜂蜜)，并评估了兽药残留物的存在。他们的研究强调了一个事实，即50%的蜂蜜至少含有一种抗生素残留物。分析的重点是磺胺类药物、甲氧苄啶和四环素类药物。进口样品来自阿根廷、印度和中国。最常见的残留是磺胺甲恶唑(1316)µ克/千克）和甲氧苄啶（239 µ，常作为复方磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、四环素、表环素、土霉素。一种产自汉堡的蜂蜜磺胺噻唑呈阳性，浓度为1305μ克/公斤。

试点试验的用于验证该分析方法的结果示于表1和4。表1示出了矩阵的校准曲线的基本参数用于定量分析物。这些参数包括线性，相关系数（> 0.996），保留时间，以及用于对每个分析物的校准曲线方程。表4列出了恢复（[R，内精度(重复性，RSD)_[R)和中间精度(再现性、相对误差(RSD))_[R） - 两种表述为百分比相对标准偏差。该测量是在三个浓度水平（0.5，1和5中进行 μ克/升）与12个并行重复。恢复值取决于分析物和浓度达到的范围60.5-94.6％。重复性（≤31.6％）在同一天进行了评价，同时可重复性（≤28.8％）是在不同的三天进行评估。检测限（CCα）为14.4，27.6，34.5，44.7 μ克/公斤;检测功能(CCβ）分别为27.3，51.0，68.6，91.7和 μ克/公斤为SDX，SMZ，STZ，和SDZ（表4)。

这些报告明确指出抗生素，特别是磺胺类，非常频繁的蜂蜜检测。尽管这是在欧盟国家禁止它们在养蜂以及他们在进口的蜂蜜存在。如何推断将考虑对蜂蜜设定的MRL仍然仍然没有得到解决[26]。无论如何，首要目标应是确保蜂蜜的质量和安全，以卫生和消费者的健康为前提。

4.结论

这项研究的目的是评估四个磺胺类药物残留在捷克市场上销售的50个蜂蜜的存在。分析前进行制备使用验证的方法的修改版本。在串联质谱法结合液相色谱法被用于由法律规定的量化和确认。磺胺嘧啶（232.88和618.87 μ克/千克）和磺胺甲恶唑（62.64 μ克/千克）进行检测。阳性标本属于欧盟国家组的蜂蜜（第1组)，以及来自欧盟及非欧盟国家的混合蜂蜜(第2组)。这是禁止对使用磺胺药物（关于违反第1组），或监管不力的蜂蜜贸易的（关于第2组），其中磺胺治疗，仍然允许在非欧盟国家的治疗蜜蜂疾病。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包含在本文中。

的利益冲突

作者宣称，他们没有利益冲突。

致谢

这项研究是由该项目的IGA VFU布尔诺的二千○一十六分之二百一十四/ FVHE支持。

参考

1. I.吉兰，L.瓜迪奥拉，L. Almela和E. Nunez的-德利卡，“同时测定的9个磺胺通过LC-MS对原料蜜样品的常规控制，”食品分析方法第10卷第1期5，第1430至1441年，2017年。查看在：出版商网站|谷歌学术
2. 金，张，赵，“用液相色谱-串联质谱法定量蜂蜜和蜂王浆中兽药残留的多分类方法的开发和验证”，食品化学卷。221，第1298至1307年，2017年。查看在：出版商网站|谷歌学术
3. H. Frerichs, A. Himmelreich, G. Naumann，《蜂蜜中保存完好的污染痕迹》。调查兽药和全球原产地蜂蜜中的美国污秽物，"和健康杂志第10卷第1期1, 2015年39-43页。查看在：出版商网站|谷歌学术
4. W. Reybroeck，E. Daeseleire，H. F.德Brabander和L.赫尔曼，“抗菌药物养蜂”兽医微生物学卷。158，没有。1-2，第1-11页，2012。查看在：出版商网站|谷歌学术
5. R.苏，李X.，W.刘，王X.和H.洋，“从被加上超声雾化的中空纤维蜂蜜磺胺顶空微”农业与食品化学杂志卷。64，没有。7，第1627至1634年，2016。查看在：出版商网站|谷歌学术
6. D.奥尔索，L.弗洛里亚诺，L. C.里贝罗，N. M. G.班代拉，O. D.普列斯特斯和R. Zanella，“基于超高效液相色谱 - 串联质谱法同时测定多类杀虫剂和蜂蜜样品在抗生素，”食品分析方法卷。9，没有。6，第1638至1653年，2016。查看在：出版商网站|谷歌学术
7. M.胡安 - 博拉斯，A Periche，E.多梅内克和一埃斯克里切，蜂蜜包装公司“的日常质量控制作为重点，以保证消费者的安全。磺酰胺的存在下的情况下，分析用LC-MS-MS，”食品管理卷。50，第243-249，2015。查看在：出版商网站|谷歌学术
8. T. S. Thompson和D. K. NOOT，“磺酰胺在通过液相色谱 - 串联质谱法测定蜂蜜，”analytica的化学ACTA，第551卷，no。1-2，第168-176页，2005。查看在：出版商网站|谷歌学术
9. B. T. Veach，T. K. Mudalige和P.黑麦，“的RapidFire质谱具有增强的吞吐量作为替代在蜂蜜磺胺液 - 液盐辅助提取和LC / MS分析，”分析化学卷。89，没有。6，第3256-3260，2017。查看在：出版商网站|谷歌学术
10. 2009年12月22日关于药物活性物质及其分类的第37/2010号规例，有关动物源性食品的最高残留限量, 2010年。
11. 2009年5月6日欧洲议会及理事会第470/2009号规例(欧共体)，订明共同体制定动物源性食品中药物活性物质残留限量的程序，2009年。
12. 委员会决议六百五十七分之二千零二/ EC 2002年8月14日实施理事会指令96/23 / EC关于分析方法的性能和结果的解释,2002年。
13. RASFF门户网站，“在线搜索的数据库，” 2018年，https://webgate.ec.europa.eu/rasff-window/portal/?event=searchresultlist。查看在：谷歌学术
14. Y. A.哈默尔，R.穆罕默德，E. Gremaud，M. H. LeBreton和P. A.盖伊，“多筛选的方法来监视和通过液相色谱 - 串联质谱法量化蜂蜜42个抗生素残留，”色谱A的卷。1177，没有。1，第58-76，2008年。查看在：出版商网站|谷歌学术
15. J. L.兰，M. del Mar的Aguilera的-路易斯，R. Romero的冈萨雷斯，和A. G. Frenich，“通过超高效液相色谱 - 串联质谱法在蜂蜜抗生素残留的多类分析，”农业与食品化学杂志卷。57，没有。5，第1760至1767年，2009年。查看在：出版商网站|谷歌学术
16. R. Galarini，G. Saluti，D. Giusepponi，R.罗西和S.莫雷蒂，“多类判定的蜂蜜27种抗生素”食品管理卷。48，第12-24，2015年。查看在：出版商网站|谷歌学术
17. K. E. Maudens, G. F. Zhang, W. E. Lambert， "高效液相色谱柱后衍生化和荧光检测对蜂蜜中12种磺胺类物质的酸性水解定量分析"色谱A的卷。1047，没有。1，第85-92，2004。查看在：出版商网站|谷歌学术
18. L. Verzegnassi，M. C.萨沃伊-Perroud和R. H.施泰德，“液相色谱 - 电喷雾离子化串联质谱法来检测的蜂蜜10种磺胺的应用，”色谱A的卷。977，没有。1，第77-87页，2002年。查看在：出版商网站|谷歌学术
19. S. G. Dmitrienko，E. V. Kochuk，V. V. Apyari，V. V. Tolmacheva和Y. A.佐洛托夫“在样品制备技术和磺酰胺的方法的最新进展检测综述，”analytica的化学ACTA卷。850，第6-25，2014。查看在：出版商网站|谷歌学术
20. CAFIA年度报告，2018年，http://www.szpi.gov.cz/en/file/cafia-annual-report-2015.aspx。
21. CAFIA年度报告，2018年，http://www.szpi.gov.cz/en/file/cafia-annual-report-2016.aspx。
22. CAFIA年度报告，2018年，http://www.szpi.gov.cz/en/file/cafia-annual-report-2017.aspx。
23. a . Economou, O. Petraki, D. Tsipi和E. Botitsi， "用液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中磺胺类物质、甲氧苄氨嘧啶和氨苯砜的测定及根据委员会第2002/657/EC号决议对禁用化合物的验证"Talanta卷。97，第32-41，2012。查看在：出版商网站|谷歌学术
24. S.胡，召M.，Y. Xi等人，“非定标筛选和磺胺类药物的测定：色散微固相提取的方法来利用液相色谱法高分辨率质谱牛奶和蜂蜜样品的分析，”农业与食品化学杂志卷。65，没有。9，第1984-1991，2017。查看在：出版商网站|谷歌学术
25. 《蜂蜜中磺胺基残留的固相萃取与液相色谱分析》，兽医研究所普瓦维的公告卷。46，第111-117，2002。查看在：谷歌学术
26. 23法规（EC）没有八百八十零分之二千零十七上建立在特定食品药理活性物质用于食品的另一个来自同一物种和最大残留限量制定了药理活性物质Derived中的使用最大残留限量的2017年5月一种或多种其他物种, 2017年。

版权

版权所有©2018桑德拉Dluhošová等。这是下发布的开放式访问文章知识共享署名许可，其允许在任何介质无限制地使用，分发和再现时，所提供的原始工作正确的引用。