文摘
一个exo-PG获得青霉菌viridicatum在深层发酵纯化同质性。酶的表观分子量为92 kDa,最佳酸度和温度为活动5和50 -c . exo-polygalacturonase exo-PG显示一个概要文件,释放半乳糖醛酸与高度的酯化果胶的水解(D.E.)。离子增强酶的稳定性及其活动的30%。的1.30在没有和1.16毫克在这个离子的存在。相对于离子的存在从1.76增加到2.07摩尔 。
1。介绍
果胶酶是酶组降解果胶物质和分类根据其作用机理在methylesterases (EC.3.1.11.1)去除高甲氧基组或部分酯化galacturonan;聚半乳糖醛酸酶催化糖苷键的水解以随机的方式(endopolygalacturonase-EC.3.2.1.15)或从nonreducing homogalacturonan释放galacturonic或digalacturunic酸残留(exopolyglacturonases EC.3.2.1.67和EC 3.2.1.82)和裂解酶(PL),裂开的糖苷键trans-elimination (pectato lyase-EC.4.2.2.2和exopectato lyase-EC。4.2.2.9)[1]。
生产果胶酶的真菌通常是受介质的组成,尤其是碳和氮源和物理化学条件如pH值、温度和曝气,除了发酵系统。固态(SSF)或淹没发酵(SmF)已经提出了酶生产在实验室条件下利用农业和农业的和工业的废物,和几种形式的PG纯化从发酵过程2,3]。
PG的净化是一个重要的工具,其属性的理解和揭示其结构和功能机制的重要知识,这些酶的作用在植物感染过程中,在工业应用中,生物质降解和它们的重要性。真菌后卫通常是单体的蛋白质与碳水化合物5 - 81%和分子质量的内容从13到82 kDa [4- - - - - -8]。
在之前的文献[9),我们描述的净化exo-PG所产生的青霉菌viridicatumRFC3社保基金,酶表现出24 kDa的分子量和强烈刺激。在本文中,我们报告的生产聚半乳糖醛酸酶的真菌在SmF,橙色甘蔗渣和麦麸作为碳源,和另一个的净化exo-PG从早期的酶具有不同的物理化学性质。
2。材料和方法
2.1。微生物
所使用的微生物是青霉菌viridicatumRFC3、孤立从腐烂的蔬菜在圣荷西,力拓Preto SP,巴西和维护股票文化Sabouraud葡萄糖琼脂(Oxoid)含0.3%柑橘果胶C。
2.2。媒体、微生物的培养、酶的生产
聚半乳糖醛酸酶是由深层发酵(SmF)在一个包含100毫升500毫升锥形烧瓶消毒(C / 30分钟)的液体培养基中含有3%碳源(1.5%地面橙色甘蔗渣,由Bascitrus (Mirassol, SP)和1.5%麦麸)和1 g的和毫克。7。媒介是消毒C 30分钟,接种体积的分生孢子的悬挂在二层80相当于0.1%孢子在决赛中每毫升中等和培养C为4天。每一天,一个瓶被发酵材料过滤和离心10000克15分钟c .上层清液作为原油酶解决方案。
2.3。酶活性测定
Exopolygalacturonase (exo-PG)活动化验在反应混合物含有1%柑橘与酯化度果胶溶液(D.E.)的92%(σ)0.2米醋酸钠缓冲(pH值4.5)C 10分钟。减少组织的数量,发布的酶的作用,是衡量DNS法(10),表示为半乳糖醛酸。一个单位的酶活性(U)被定义为酶的释放量摩尔每分钟半乳糖醛酸的测定条件下(3]。
Endo-polygalacturonase (endo-PG)测量viscosimetrically通过添加2.0毫升的粗酶6.0毫升的0.2米citrate-NaOH缓冲区(pH值5.5)包含3%柑橘果胶92% D.E.(σ)。反应混合物被孵化C 10分钟,之后其粘度测定基本粘度计(Fungilab)。包含的空白原油热灭活酶。一个单位的酶活性(U)被定义为酶的数量减少了50%的初始粘度测定条件下每分钟。
2.4。酶纯化过程
1300毫升容量的粗酶解获得96小时的发酵后透析过夜对20毫米醋酸缓冲pH值4.5醋酸纤维素膜(法玛西亚)和集中通过超滤Quixstand台式的通用电气医疗集团10 kDa截止。交联葡聚糖的滞留物直接装载列(2.6 g - 75(法玛西亚)90厘米)平衡和40毫米醋酸缓冲(pH值5.0)和筛选了缓冲流量为0.3毫升。分数4毫升的收集和化验PG活性。这个过程的目的是估计的亚型PG酶存在于原油的解决方案。
在另一个试验中,同样体积的原油酶是由超滤浓缩Quixstand台式的通用电气医疗集团10 kDa截止,然后用50 kDa截止膜过滤和加载直接交联葡聚糖g - 75列在上面描述的过程。
从交联葡聚糖列,收集的蛋白质分数对应PG活性高峰,是汇集和加载问琼脂糖(奥德里奇30列1厘米)平衡和40毫米醋酸缓冲,pH值4.5。吸附材料与线性梯度筛选了氯化钠(0.0到1.0米),在相同的缓冲区,流速为0.6毫升。PG活性的蛋白质分数被透析脱盐一夜之间对20毫米醋酸缓冲,pH值4.5C。
2.5。分析电泳
纯化酶的分子量是由在一个迷你千变万化的sds - page II装置(108厘米)(Biorad)。电泳进行了4% (w / v)聚丙烯酰胺堆积胶和10% (w / v)解决凝胶三羟甲基氨基甲烷/甘氨酸缓冲液(pH值8.3)(11σ)的分子量标记M6539 (6.5 -180 kDa)在一个平行车道。乐队的蛋白质被银染色可视化。
分析等电点聚焦页面中执行Ettan IPGphor II等电点聚焦系统(Amersham)在12.5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳(1415厘米)含5% Pharmalyte(通用电气医疗集团),建立了酸度梯度从3.0 - -10.0,按照供应商的指令。这种凝胶是silver-stained蛋白质的决心。
2.6。蛋白质估计
蛋白质浓度测定的浓度范围1 - 10和10 - 100g由布拉德福德microassay [12),与牛血清白蛋白(BSA)作为标准。
2.7。纯化酶的性质
酶催化性质都是化验柑橘果胶(D为1%。E 92%,σ)作为底物使用上述酶活性测定的过程和实施三个复制。PG活性化验pH值的函数,在恩缓冲(pH值4.0 - -8.0),C,和温度,在pH值最优恩,孵化温度之间C和C。
重新测量的热稳定性研究纯化酶的活动解决方案保持了1小时后,在缺乏底物的情况下,温度5 -c .半衰期是由孵化酶的解决方案C 1小时。在这些测试中,初始和最终PG活动是在最佳pH值和温度决定的。
pH值纯化酶的稳定性被分散评价(1:1,v / v)酶解决方案0.1米恩缓冲区(pH值3.0 - -8.0)和0.1 M glycine-NaOH缓冲区(pH值8.0 - -10.5)和维护这些解决方案C 24小时。一个整除被送往确定剩下的活动最佳pH值和温度。
米氏常数(),从Lineweaver-Burk块酶活性测定的值测量92% D.E.柑橘果胶(σ)作为底物,在浓度1.0和10.0毫克在最佳pH值和温度。程序的结果绘制Grafit 5.0。
金属离子(Ag)的影响+K+,Na+、铜2 +、钙2 +,英航2 +、有限公司2 +、汞2 +、镍2 +、镁2 +、锰2 +、锌2 +、铬3 +,艾尔。3 +、铁3 +)和EDTA对酶活性化验浓度的2.0,5.0,10.0毫米的反应混合物。
底物特异性是由测试评估polygalacturonic酸、柑橘果胶D.E.(σ)的26%和92%,苹果果胶(87% D.E.-Sigma)在最佳条件下基质酶活性。
柑橘果胶的水解的产物(D.E. 92%)由纸色谱法分析了PG绘画纸上没有。1,用乙酸乙酯/异丙醇/水(,按体积)作为流动相。
3所示。结果与讨论
3.1。SmF PG的生产
在thesubmerged在含有橙色甘蔗渣和麦麸培养基中发酵碳源(图1),PG activityincreased 24和96小时的一批文化之间不断从3.0到4.1不等由三个重复。获得的酶活性低于社保基金相同的真菌(18 U)[9]。橙色甘蔗渣(压皮、纸浆、破布和种子)平均果胶含量223 g公斤1(干重)13,14),是一个很好的果胶酶的诱导物15,16]虽然麦麸是一个很好的营养来源17]。尽管如此,报告的PG活性低于获得酶生产SmF其他碳源。帕蒂尔和Dayanand18获得30.3 U的exo-PG黑曲霉DMF 27当他们使用去处种子向日葵和葡萄糖作为碳源。相同的真菌产生14.5 U果胶酶的培养基含有柑橘果胶(19]。相关的答:突变生产15.5 U果胶酶的培养基补充maltrin [20.]。
PG生产大幅增加时,还原糖含量下降和真菌生长的日志后阶段。还原糖的消费促进真菌生长和确保成功殖民统治中21]。另一方面,高水平的还原糖在中是一个重要因素限制酶的生产,由于异化的镇压(2]。
3.2。净化的PG
粗酶解获得96小时的发酵后,集中通过10 kDa截止和超滤分离在交联葡聚糖g - 75列,提供5山峰PG活性表明许多亚型(图2(一个))。在先前发表的作品中,我们获得了5 PG分数的固态发酵p . viridicatumRFC3上混合物(w / w)的麦麸和橙色甘蔗渣水分(67%17),而最近在另一个实验中,6 PG分数获得在同一介质,但水分的80% (9]。我们认为这两种媒体之间的水分差异可能影响PG亚型的表达,但是现在,在液体培养基中,我们发现相同数量的亚型在中水分含量较低。水势的影响()同种型表达细胞外酶的变化归因于真菌细胞膜的渗透性的变化,限制糖的运输和诱导物的存在与否22]。我们也报道细胞外酶的表达变化与变异的文化条件和发酵技术(17]。
(一)
(b)
的顺序生产果胶酶已经被其他作者报道在各种微生物(15]。果胶酶产生的微生物具有不同分子量相同,程度的糖基化和特异性,要么是因为转译后的修改从单个基因或蛋白质的表达不同的基因,这样的变异是重要的在平衡特定的行为模式(endo或挂式)和底物的亲和力5,23]。
粗酶解时的超滤浓缩10 kDa, 50 kDa截止膜过滤后不久,和集中加载材料交联葡聚糖g - 75列,只有一个聚半乳糖醛酸酶(PG III)峰值筛选了,表明大多数的PG分数从粗酶的低分子量且只有一个(PG III)保留了50 kDa膜(图2 (b))。相对应的PG,洗脱体积215到315毫升,在pH值应用于Q琼脂糖列4,与生理盐水溶液洗脱后(约0.5米),只有一个PG检测(图的峰值3)。SDS /页面显示这个PG峰值是均匀(图4)。三个阶段是必要达到37.7倍PG三世净化,最终收益率为3.4%(表1)。
3.3。PG的表征
摩尔质量的PGIII估计92.2 kDa(图4)。证实了同质性等电点聚焦,一个乐队与等电点(p我观察)5.4(图未显示)。
纯化高酯化果胶(PG三世表现出更高的活动图5(一个))表明PG polymethylgalacturonase。然而,活动柑橘果胶(5.1 U)明显高于苹果果胶,尽管有很高的D.E.(92%和82%,resp)。
(一)
(b)
聚半乳糖醛酸酶的作用方式对柑橘果胶D.E.(92%)也被评估在反应混合物通过测量粘度,估计endo活动。图5 (b)表明,这种酶有可怜的能力减少果胶溶液的粘度,主要exo-activity指示。纸色谱的分析发现,半乳糖醛酸酶水解的唯一产品孵化(图5分钟后6),加强exopolygalacturonase的证据(exo-PG)。
离子exo-PG三世活动的效果进行了测试在浓度为2.0,5.0和10.0毫米。离子汞2 +、锌2 +、镁2 +、铁3 +和铜2 +强烈抑制exo-PG活动时,Cr3 +和K+只是部分抑制。另一方面,离子如Na+、锰2 +,Ca2 +在5和2毫米,酶活性增强10%(和Ca2 +30%在5毫米)。EDTA抑制酶活性的7 - 17%,这取决于浓度(表2)。
Na+被描述为一个PG活性的诱导物春,胡贝尔(24]。二价离子如Ca2 +直接作用于果胶分子,稳定带负电荷的羧基组和间接刺激polygacturonase活动(25,26]。
铬离子的浓度3 +,艾尔。3 +、银+K+,倪2 +在反应混合物有关反常地抑制效果,最高的最低浓度。
Exo-PG三世显示最大活动pH值5.0和50%的最大活动(图8.0 pH值7(一))。这是稳定pH范围4 - 5,但Ca的存在2 +离子反应混合物导致增加酶的稳定性,与90 - 100%的完整的活动在更广泛的pH值范围4.0 - -9.0(图7 (b))。
:PG独自:PG加上Ca2 +。对温度、最佳50 - PG观察活动C(图8(一个))。在缺乏底物1小时,exo-PG三世显示85 - 100%的原始活动5 -C,同时C,酶失去了55%的初始活动。然而,在Ca的存在2 +(10毫米),PG保持在5 - 80 - 100%的初始活动C和当维持在70%左右C(图8 (b))。在另一项实验中,exo-PG III是维护每5分钟C 1小时(样本)的存在和缺乏Ca2 +。如果没有这个离子,这种酶保留50%的初始活动25分钟,而在它的存在,这种酶半衰期增加到37分钟(图8(c))。据埃尔南德斯等人。27),2 +保护酶对热变性和扮演了一个至关重要的部分在维持高温激活配置。
(一)
(b)
(c)
半衰期时间C exo-PG三世p . viridicatum高于被斯坦利et al。28三聚半乳糖醛酸酶纯化)p . pinophilum。那些PGI半衰期分别为10.6分钟,16.5分钟PGII, PGIII和9.5分钟。然而,PGAcrophialophora nainiana纯化的Celestino et al。29日)有一个半衰期为20分钟C和3分钟C。
exo-PG III对柑橘果胶(92% D.E.)是由Lineweaver-Burk阴谋。在Ca2 +底物的亲和力增加,从1.30 (0.04)到1.16 (0.05毫克。同样,观察一个进步在在这个离子的存在,值从1.76 (0.06)到2.07 (0.03)摩尔 。
其它净化exo-PGs显示广泛不同的动力学参数值,范围从0.11毫克到4.47毫克为和1.68摩尔 到1100年摩尔 为(30.- - - - - -33]。
exo-PG三世的属性p . viridicatum描述这项工作显示不同属性的另一个PG (exo-PG II)从相同的真菌9)如分子量(92 - 24 kDa, resp)和活动的最佳pH值(5.0和6.0,分别地)。此外,PG三世,事实证明,这项工作,净化是一个exo-PG被英航2 +在10毫米exo-PG II的稳定性增强,另一方面,其稳定性对pH值变化,热稳定性,底物亲和力改善Ca的存在2 +。
Ca的影响2 +和英航2 +稳定和活动的exo-PGs提出的更近一步提高果胶酶在生物处理应用程序使用时效率汁提取。
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