文摘

黄腌鳕鱼有典型的黄色,独特的味道,和低盐含量由于其特殊的原始咸鳕鱼的固化过程涉及的几个浸泡在水里生咸鳕鱼,交替与干燥步骤。本研究的目的是评估的主要官能团细菌参与这个过程,涉及产品的物理化学性质。共有28从冰岛鳕鱼由两个本地公司。七个阶段的固化过程进行了分析。从这七个阶段的每一个,四个鱼样品进行微生物和理化分析(水分、盐含量、pH值、总挥发性基本氮(TVB-N)和三甲胺氮(TMA-N))。细菌计数使用或然数方法进行有氧和足够的文化媒体,蛋白水解,sulphite-reducing,生物胺,trimethylamine-producing和氨化细菌。与微生物菌株分离出的最高稀释被用来描述主要的细菌生长。结果表明,总需氧数量从3.9增加日志或然数/ g在原始咸鳕鱼5.9日志或然数/ g在最后。蛋白水解、氨化和三甲胺细菌生产商也增加到8,7.5,和6.5日志或然数/ g,分别。盐含量的增加(从17%到8%)和水分减少(53%到67%)在salted-raw-codfish浸泡,有利于sulphite-reducing和生物amine-producing物种,确认脱盐提高潜在的破坏者。 The subsequent drying step benefits proteolytic, ammonifying, and trimethylamine-producing bacteria, with a corresponding non-protein-nitrogen content (TVB-N and TMA-N) increase. The dominant bacteria during yellow curing belong to the genera葡萄球菌,Psychrobacter,假单胞菌,产碱杆菌属有一个清晰的内容之间的正相关关系葡萄球菌和Psychrobacter和TVB-N TMA-N浓度。葡萄球菌种虫害的步骤的主要细菌产品有较高的盐浓度;因此,它可能是特别有用的作为一个指标来控制工业黄色固化过程和可能发展的一个重要的角色最终这个产品的特征。

1。介绍

盐鳕鱼保存,巴斯克人,推出了基于方法论应用于鲸鱼肉(1]。咸鳕鱼已经几个烹饪食谱地中海美食的基础。葡萄牙黄腌鳕鱼站在纽芬兰的光固化方法,葡萄牙,这一知识被带到欧洲的渔民(2]。这种方法提供了一条琥珀颜色,含盐量较低,一个典型的味道到最终产品。目前,据葡萄牙立法(DL。25/2005 1月28日),黄色治愈鳕鱼产品12 - 16%的盐含量和45%的水分干燥后用黄颜色特征。

在传统的方法中,原始的咸鱼,报浸泡清洗,可以几个小时,连续干燥和press-pilling时期(3]。这个治疗执行较低的盐、鱼越来越倾向于微生物的开发,主要是slime-forming细菌。因此,必须干这个原料浸泡后,通常在大约27°C的气氛有大约50 - 55%的相对湿度在第一干燥周期和在随后的60 - 65%。干燥时间必须进行12 h (3,4]。

黄色的黏液形成治疗可以通过press-pilling期间观察到的和干燥的初始阶段。鱼的肉表面一层semigreasy和粘性的闪闪发光的物质,和气味非常典型的强大和辛辣的5]。

一项研究由Dussault [5)这个黄色的细菌学治疗显示,在治疗的最初几天,微生物总量的急剧增加,从10⁴到10⁵每厘米²,肉的表面,随后逐渐下降,在随后的干燥操作。主要微生物群由Micrococci,无色菌,黄杆菌属,假单胞菌,八叠球菌。许多微球菌菌株表现出越来越蛋白水解活性最高在2%氯化钠和下降为零在12%氯化钠,和大约50%的文化能够减少氧化三甲胺(TMAO)三甲胺(TMA)。这个观察可能导致假设特征风味和香味的黄色治愈必须是由于活动的Micrococci [5]。高水平的基本TMA和总挥发性化合物(TBV)指标的细菌侵蚀6,7]。自由氨基酸和TMA黄腌鳕鱼中的值高于dry-heavy-salted鳕鱼可能与细菌数量的差异,这些黄色的腌鳕鱼更高比dry-heavy-salted鳕鱼(4]。

古代有关咸鳕鱼细菌和一些最近的研究是由几位作者5,8- - - - - -20.];然而,很少有关于微生物的进化信息数量和多样性和微生物所扮演的角色在黄色的治疗过程。

有一个不断增长的需求对黄腌鳕鱼特别在喜庆的季节,它有经济价值高于白人咸鳕鱼(dry-heavy-salted),这是明显的在浏览网站(商业或餐厅http://www.napoleao.eu/cc/portuguese-gourmet;http://Culinarybackstreets.com/cities-category/Lisbon/2020/bacalhau),因为其独特的知觉的特点大大欣赏美食市场据戈麦斯et al。21]。

然而,由于其过程和储存期间恶化的风险更高,产生少量需要经验丰富的手工。

本研究的目的是代表的主要微生物功能群在固化过程,建立微生物指标,保存产品和产品之间的边界已经在破坏阶段与物理化学性质有关,这可能成为有用的工业过程控制。研究结果将有助于干涉的工艺流程,这将使黄色治愈一个可控的过程,而不是科学,因为它今天仍然发生,一个手工的过程基于经验主义导致许多商业损失。

2。材料和方法

共有28从冰岛鳕鱼由两个当地工厂生产他们在商业条件下见图1。

生腌鳕鱼已经斩首,开了,烧毁的(没有被干)提出约4 - 5公斤。选择标本在水中浸泡24小时,press-pilling之后,鱼去人工干燥48 h 22°C下相对湿度54% (1^圣干)。然后,他们提交给另一个紧迫的后面跟着另一个干燥周期22°C / 48 h在相对湿度为45% (2^nd干)。这个过程后,鱼被存储在鹿°C和75%的相对湿度(最终产品),直到第一次恶化的迹象(3个月后)和腐败的外观与黏液和令人不快的气味(5个月后)。从这七个阶段的每一个(原始鳕鱼,浸泡后,1^圣干,2^nd干燥,最终产品,3个月后,5个月后),4鱼样品微生物和理化分析被执行。

部分从腰、尾巴和翅膀肌肉无菌来自每个鱼,和10 g的混合样本收集胰蛋白胨的兜包袋包含90毫升生理盐水(0.1%的tryptone-Scharlau 07 - 154和1%的氯化钠)。均化后的三角胸衣4分钟,一系列的10倍稀释。

使用最可能的细菌数量进行数量(或然数)过程和适当的培养基:有氧嗜中温(酵母extract-Scharlau 07 - 079 - 2.5克;胰蛋白胨5克;葡萄糖1 g-Scharlau;1%氯化钠),蛋白水解和氨化细菌使用媒体被Pochon和Tardieux [22(铁),sulphite-reducing细菌媒体Lyngby-Oxoid CM0964没有琼脂),histamine-forming细菌通过媒体由奈文等。23],TMA-producing细菌增长媒体肉汤oxitrimethylamine [24]。数量是4天后孵化的28°C,根据初步研究出版。蛋白水解和氨化细菌培养时间是15天22]。所有结果都表示为日志或然数日志/ g的鱼。

2.1。表型特征的主要菌株

0.1毫升的整除,从最高的稀释与微生物增长在每个液体培养基中,在相应的琼脂媒体传播特点,选择主要的细菌菌落。分离纯化和提交一个简单的表型鉴定革兰氏染色反应、细胞形态学、过氧化氢酶和细胞色素氧化酶活性。53分离菌株进一步增长的测试在不同的温度下(15、30和37°C)和不同氯化钠浓度(0,1,10,15%)在营养琼脂(Oxoid CM003)。

2.2。从分离菌株中提取细菌的DNA

生物量从纯化细菌文化在营养琼脂(Oxoid CM003)被转移到管包含10毫升的0.3%盐水无菌溶液达到5麦克法兰标准细胞悬液;然后,1毫升被转移到微型离心机管(Microfuge 18贝克曼),在10000转离心5分钟。

恢复细胞是用生理盐水洗。细胞溶解,被冻结在-20°C,然后暂停加热10分钟的100°C。立即离心获得的暂停。5分钟后在10000 rpm, 1μL细胞溶解细胞制备用于引物的PCR反应CsM13 [25]。放大了的thermocycler (Biometra),根据Chambel et al。26]。

可视化的PCR产物进行水平电泳室(法玛西亚)电泳电源每股收益600。DNA片段沾0.2毫克/毫升的溴化乙锭和可视化紫外线透照器和图像系统联盟4.7 Uvitec剑桥。数据图像与BioNumerics 6.6软件进行了分析。

2.3。16 s rRNA分离株基因测序,计算数据和序列分析

基于孤立概要文件和BioNumerics分析,31株代表集群的选择(数据没有显示)和用于放大的16 s rDNA引物PA 5 - - - - - -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3(27)和1392 r 3 - - - - - -ACGGGCGGTGTGTRC-5(28)或907 r 3 - - - - - -CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-5(29日]。

从每个选定的应变,1μL的DNA混合5μL 10 x缓冲区(NH(60毫米₄)₂所以₄670毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值8.8,0.1%渐变20),2μL MgCl 50毫米₂,1μL (10μM核苷酸,1μ50 pmoles / LμL底漆PA, 1μ50 pmoles / LμL底漆1392(或907 r)和0.2μ5 U / LμL Taq DNA聚合酶(w1,英杰公司)。完成了PCR混合物与消毒Milli-Q水到50μL的最终体积。

进行PCR扩增的Thermocycler (Biometra),根据Chambel et al。26],PCR产物纯化PCR Jetquick旋转列技术来完成净化设备(基因组)和测试通过执行在1%琼脂糖凝胶上电泳的样品1 h在90 V和进一步的启示与溴化乙锭如上所述。所选菌株与两个引物测序104 f (GGCGVAYGGGTGAGTAA)和907 r (30.]。

序列组装从相应的色谱使用浓度2.33 BioEdit和序列比对使用Clustal X2 GeneDoc gd322700(共识序列编辑)来解决任何含糊之处。结果16 s rRNA序列比较与基因库的DNA序列数据库使用爆炸程序(基本局部比对搜索工具)。至少500到525个基点位置模糊排序和< 1%,99%的序列相似性限制需要考虑两株属于同一物种的使用(31日]。

2.4。理化分析

样品的腰、尾巴和翅膀鳕鱼肌肉被削减和均质/鱼。测定水分、盐含量、pH值、总挥发性基本氮(TVB-N)和三甲胺氮(TMA-N)在每个鱼样本进行复制。根据采用AOAC公认的水分和盐含量进行(32]。一个酸碱计744年瑞士万通是用来确定pH值;TVB-N和TMA-N根据[中描述的方法进行了分析33]和[34),分别。

自由氨基酸,含氮量测定采用使用一个内部的方法IPIPMA-titrimetric 25 g的碎肌肉准备使用方法,提取20%的三氯乙酸溶液(Scharlau,巴塞罗那,西班牙),氢氧化钠中和15%的酚酞和37%的甲醛。结果TVB-N、TMA-N和自由氨基酸被表示为毫克的N / 100 g的鱼肌肉。

2.5。统计分析

“单向方差分析”STATISTICA 7项目的方差分析(2004年美国stat-sof)执行,检查后正常和方差的同质性,使用图基测试,验证了显著差异。假设没有确认时,使用了非参数克鲁斯卡尔-沃利斯检验。水平的意义被定义为0.05 ( )。

3所示。结果

3.1。微生物结果

结果表明,总需氧数量从3.9增加日志或然数/ g在原始咸鳕鱼5.9日志或然数/ g在最终产品;蛋白水解、氨化和三甲胺细菌生产商也增加到8和7.5和6.5日志微生物/ g,分别(图2)。在咸鳕鱼浸泡,sulphite-reducing biogenic-amine-producing细菌是青睐。

所有组的细菌研究,定义为在图2后,发现浸泡的步骤。然而,在这个阶段,有微生物的数量变化组和其中一些不再检测。

后的产品2^nd干燥和最终产品的特点是高含量的蛋白水解,氨化,TMA-producing微生物(图2)。群TMA生产者到达最大值后2^nd干燥阶段,剩下的小变化到5个月的存储。

所有的菌株分离浸泡阶段显示增长和15%盐(表1)。这些值增加而恶化的开始出现后,检测到3个月的存储、发音5个月,86%的菌株革兰氏阳性和发达的媒介15%氯化钠71.4%。

所有隔离菌株显示温度的增长能力15°C和30°C(表1)。

在37°C的温度,很明显,大部分的隔离后第一次干能够成长。

16 s rRNA基因测序的孤立的革兰氏阴性菌株(图3)显示,占主导地位的属Oceanisphaerae,产碱杆菌属,Psychrobacter。

产碱杆菌属种虫害主导在最初的干燥和最终产品时没有发现阶段和腐败过程开始。Psychrobacter种虫害中可以找到所有学习阶段,包括储存3和5个月后,但发病率较高的干燥。基于测序革兰氏阳性菌株(图3),被确定为60%葡萄球菌spp。,这属主要阶段的产品有更多的盐,也就是说,在原始的和最终的固化和更明显的阶段3和5个月后的存储。

3.2。物化的结果

浸泡后水分含量达到最大值,显著降低( )在随后阶段的干燥并保持在50%以下3个月后(图4)。

盐含量显著减少浸泡,值降至10%以下。在干燥阶段,有统计上显著的增加( )但总是呈现值低于15%,甚至在3和5个月的存储(图4)。

在黄色的养护过程中,pH值保持6直到存储3个月,在这段时间,有一个显著增加( )达到6.5。这pH值增加伴随着显著增加( )TBV-N、TMA-N和自由胺基酸(图的内容4),实现90、20和150毫克N / 100克的鱼,分别。

4所示。讨论

在复杂的矩阵鳕鱼,很难区分可行的微生物的主要团体,因为他们的复苏是困难的和依赖方法,文化传媒,孵化条件。因此,它是决定使用多个管方法理解微生物群体的人口动态。这一分析集中在管在高稀释了正增长为了建立的主要细菌属固化过程的不同阶段。结果可以量化的主要微生物组的整个过程和识别最相关的微生物属。

有关的主要微生物组量化,得到了更高的标准偏差值(图2)反映样品的复杂性。生腌鳕鱼的微生物计数小于10⁵细胞/ g非常低比较新鲜的鱼(35,36),这表明盐的效果是有效的抑制或死亡的很大一部分在盐的微生物群礼物。

鳕鱼随浸泡最少、水分和盐浓度降低在这个阶段,因为它是被水。有优势的革兰氏阴性菌株在浸泡阶段已经被佩德罗et al。37),发现在罗德里格斯等的工作。14]。革兰氏阴性菌株被认定为属于产碱杆菌属种虫害和Psychrobacterspp。虽然确定了菌株与精度只属的水平,可以承认,这些细菌来自海洋环境,构成这些属的鳕鱼的栖息地,因为大多数物种都是典型的寒冷环境海洋或陆地6,36,38- - - - - -40]。

在干燥阶段,上升non-protein-nitrogen重合,显著增加盐的比例由于减少水分。干燥器的温度可以作为选择性的因素,解释说,第一次干燥后,有一个更高比例的菌株能够增长的温度37°C(表1)菌株相比,孤立在前面的阶段。的属产碱杆菌属主要在干燥阶段,但这是有可能找到吗Psychrobacter种虫害在养护阶段,包括在原始的鳕鱼和变质的产品,这是可以理解的,因为这是一个halotolerant细菌(38]。一般来说,属的成员Psychrobacter分解脂肪的展出活动,能够水解氨基酸如亮氨酸(41]。根据加西亚洛佩兹和马拉多纳42),他们不是与TMA在大量生产,但至少有两个物种,p . cibarius和p . maritimus显示,轻微TMA生产期间储存在4°C。虽然这TMA产生略,的存在Psychrobacter种虫害可能与不愉快的气味释放被宠坏的鱼(41]。在第二次干燥,增加一个数量级的蛋白水解细菌观察(图2)为代表Psychrobacterspp。(图3),它似乎是主要的固化过程的主角。

经过3个月的存储、特征的形成黏液和令人厌恶的气味谴责与氨的形成强烈的微生物活动和三甲胺显著增加证明( )在最相关的物理化学参数,这样TVB-N TMA-N, pH值,鳕鱼3和5个月后的存储。pH值的增加是按照已经被Botelho [43)还发现,黏液形成之后,pH值的上升。

评价3个月后的存储显示有显著降低( )在组蛋白水解和氨化细菌的内容,仍在腐败的状态。事实上,在鳕鱼样品3和5个月后,肌肉分解没有观察到,与预期的相反黏液形成和不愉快的和辛辣的气味。这使得明显,蛋白质水解并没有达到一个极端的程度会导致组织瓦解。另一个可能的理由减少微生物内容是困难的微生物多糖的提取矩阵可以减少其量化。在腐败阶段,细菌组盛行的是那些使用蛋白质水解产生的化合物,生物合成其他含氮化合物负责知觉的特征的变化(44- - - - - -47),即TMA生产者和氨化细菌尽管显著( )减少后者的内容。

对于整个生产过程,主要分离的革兰氏阳性菌株被确认为百分比葡萄球菌spp。,他们不仅在原始的鳕鱼,也被发现在鳕鱼3和5个月;他们是主要的。然而,这不是发现在浸泡阶段。分离的菌株都增长了10%盐和37°C,从而揭示能力抵制产品的高盐浓度,干燥温度过程中使用。该属的一些菌株已经用作发酵剂在腌制肉类产品,以蛋白水解活性,导致高non-protein-nitrogen内容(48]。

关于产品至少3个月,属的患病率更高葡萄球菌凝固酶阴性检测。的菌株鉴定为属于属葡萄球菌,没有标识为物种金黄色葡萄球菌。分离菌株被认定为属于物种表皮葡萄球菌(同源性在98%到94之间)或物种葡萄球菌equorum(同源性99%到94)。

虽然葡萄球菌种虫害是占主导地位的属,来证明它的使用作为一个黄色腌鳕鱼腐败微生物指标,参与其他属的细菌包括其他革兰氏阳性细菌必须承认。

5。结论

鳕鱼的黄色的养护包括高微生物活性官能团的变化明显的水平和理化参数特别是pH值,和TVB-N TMA-N内容。最重要的官能团参与如下:蛋白水解细菌,即Psychrobacterspp。(这是活动整个过程);TMA-producing细菌,如Psychrobacterspp。产碱杆菌属spp。,葡萄球菌spp。和氨化细菌。

葡萄球菌种虫害被发现的主要细菌的处理阶段产品有较高的盐浓度。根据我们的结果,属葡萄球菌检测和量化可能特别有用,因为微生物指标控制工业黄色固化过程和可能发展的一个重要的角色最终这个产品的特征。

正是在20世纪的中间,有一个更大的兴趣学习更多关于黄色的固化过程。黄色的商业地位腌鳕鱼和当前的附加价值,它代表美食美味值得进一步的科学研究。本研究是在这种背景下开发允许获得知识转移到工业生产更多的控制,同时减少损失。

数据可用性

相应的作者((电子邮件保护))将提供所有的微生物和化学信息数据用于支持本研究的发现。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作得到了科学技术基金会(格兰特SFRH数量/ BD / 42241/2007,未经中华人民共和国交通部)及其出版由CERNAS-Research中心自然资源,环境和社会,农业大学理工学院Coimbra的。,葡国科英布拉