净化和近年来的二级结构镰刀菌素sp。LD8

文摘

近年来,从镰刀菌素sp。(LD8)是固体发酵获得的。固体发酵培养基被柠檬酸缓冲液提取,提取被丙酮沉淀和净化的交联葡聚糖g - 100。结果表明,纯化酶的具体活动近年来比天然酶的22.7倍。酶的复苏是23.9%。纯化酶给一个乐队在sds - page凝胶,以及近年来的分子量约为64 kDa。酶的等电点为4.5。酶的性质也进行了研究。结果表明,最佳温度和pH值是60°C和6.0,分别;一半的温度失活是50°C,和最稳定的酶pH值为6.0。,酶是8.9毫克·l⁻¹和2.02毫克·最小值⁻¹·毫升⁻¹通过使用摘要研究从岩藻vesiculosus作为衬底。组成的二级结构的估计了近年来红外光谱、二阶导数谱和曲线拟合酰胺我乐队的光谱分析。结果表明,(58.6%)和表是占主导地位的组件螺旋是最少(12%);的内容词和随机线圈分别为15.39%和14.5%,分别。

1。介绍

硫酸多糖,名叫摘要研究,可以从许多海洋褐藻中提取。藻的主要结构特征差异摘要研究源自他们的物种;的支柱,隔绝昆布属植物cichorioides(1)是由(1 - 3)联系fucopyranose残留物,金银花主要是(1 - 3)fucopyranose残留物(75%)和一些有关(1 - 4)fucopyranose联系(25%)(2];摘要研究从墨(3),f . evanescens(4),而f . distichus(5)是显示包含一个骨干组成的交流(1 - 3)和(1 - 4)a-L-fucopyranose残留有关。

调查人员筛选摘要研究很感兴趣这是孤立的从不同的褐色藻类物种;摘要研究由几种不同的生物活性包括抗凝剂(6- - - - - -8)、抗血栓形成的抗凝血酶活性(9],抗病毒[10),和其他活动(11]。摘要研究的生物效应依赖于分子质量,硫酸盐含量和糖成分(12,13]。低分子量摘要研究(LMWF)可以通过近年来(E.C.3.2.1.44)酶解及酶可以水解,硫酸LMWF没有删除替代组。

近年来可以从无脊椎动物的肝胰腺中提取14,15,海洋细菌16- - - - - -25[],海洋真菌26- - - - - -28]。

有一些论文关注近年来从海洋真菌的发酵条件26- - - - - -28和海洋细菌23,29日),一些论文有关方法进行了净化的近年来肝胰腺(14和海洋细菌的报道17,20.- - - - - -22]。为了阐明真菌近年来的结构,我们研究近年来分离出不同种类的真菌。目前的工作是致力于净化和近年来从海洋真菌的结构分析镰刀菌素LD8 sp。

2。材料和方法

2.1。化学物质

摘要研究从岩藻vesiculosus从西格玛化工有限公司,交联葡聚糖;g - 100购买从淀粉微球生物科技公司(瑞典)。摘要研究从昆布属植物sp.购买从日照Jiejing海洋生物科技发展有限公司有限公司(中华人民共和国)。所有其他的化学试剂都是分析纯级中国制造的。

2.2。微生物

海洋真菌LD8隔绝的沙被确认为北海在德国镰刀菌素sp。(LD8),它可用于近年来的合成。固态介质LD8由7.5 g麦麸,0.5 g海带粉,0.1克葡萄糖,0.04 g NaNO₃、人工海水和7.5毫升250毫升玻璃瓶(27]。

2.3。化学分析

蛋白质的浓度是由布拉德福德法(30.]。

2.4。酶测定

2.4.1。近年来活动

近年来活动二硝基水杨酸的测定技术(31日)估计的释放还原糖在540 nm如下:混合酶的组成1毫升衬底溶液(1% (w / v)从岩藻vesiculosus溶解为0.02摩尔·l⁻¹柠檬acid-sodium柠檬酸缓冲,pH值6.0)和0.1毫升酶解决方案(粗提物或纯酶)在50°C的环境10分钟,使用灭活酶解作为空白CK。用海藻糖作为标准,校准曲线函数(:海藻糖的数量,毫克;:540海里的吸光度,)。

一个单位(IU)近年来的活动被定义为酶的释放量1μ摩尔的海藻糖在试验条件下每分钟。

2.4.2。Fucosidase活动

Fucosidase活动在下列条件下测量:反应混合物中含有1毫升衬底(1%的解决方案-nitrophenyl --L-fucoside (w / v)溶解为0.02摩尔·l⁻¹柠檬acid-sodium柠檬酸缓冲,pH值6.0)和0.1毫升酶解决方案(纯化酶)在40°C 2 h孵化。一个单位(IU) fucosidase活动被定义为释放的酶量1μ摩尔的在试验条件下每分钟-nitrophenyl。

2.4.3。淀粉酶测定

反应混合物含有可溶性淀粉1毫升的2% (w / v)在醋酸缓冲(pH值5.5)和1毫升的酶解决方案是用颤抖的在40°C孵化了30分钟。反应停在沸水中煮5分钟,离心后释放还原糖测定二硝基水杨酸法(31日]。一个单位(IU)的淀粉酶活性的定义是解放的酶量1μ摩尔还原糖(葡萄糖)每分钟在试验条件下。

2.5。近年来的提取、净化和纯度鉴定

LD8种植在28°C 48 h在250毫升瓶固态介质。

在4°C以下步骤都完成了除了被明确表示。

50克发酵培养基与柠檬酸提取柠檬酸味钠缓冲(pH值6.0)为0.5 h。过滤后通过six-layer carbasus,滤液离心机在15000克0.5 h,然后冰冷的丙酮添加到上层的最终浓度为66.7% (v / v)与温和的搅拌。不溶性材料是通过离心15000 g为0.5 h。沉淀溶解在pH值6.0,0.02摩尔·l⁻¹柠檬柠檬酸味钠缓冲和离心机在15000克0.5 h,并明确解决方案收集使用。酶解集中到约10毫升低温真空浓缩,然后加载到交联葡聚糖g - 100列(2.5×100厘米),平衡与0.1摩尔·l⁻¹柠檬柠檬酸味钠缓冲。酶的筛选了在室温下的流量0.33毫升·最小值⁻¹;分数收集每隔20分钟。酶活性最高的分数集中,集中通过低温真空浓缩10毫升,在去离子水透析,冻干,储存在−18°C。

进行了sds - page鉴定纯化酶的纯度和计算蛋白质的凝胶。SDS - page是7% (w / v)含有10% (w / v) SDS聚丙烯酰胺凝胶;分子标记是肌球蛋白(220 kDa),2巨球蛋白(170 kDa),牛乳糖(116 kDa),转铁蛋白(76 kDa)和谷氨酸脱氢酶(53 kDa)。蛋白质被Coomassie彩色明亮的蓝色r - 250。

2.6。纯化酶的特性

Isoelectrofocusing进行凝胶棒。电极的解决方案是2% (w / v)在阴极的氢氧化钠溶液和5% (v / v)磷酸溶液在阳极。每个凝胶都集中在100 V 2马2 h,紧随其后的是150 - 160 V, 4马5 h,它允许大幅focalisation近年来。等电点聚焦后,凝胶切成0.5厘米测量pH值和酶活性。蛋白质氨基黑染色0.5% (w / v)。

pH值的相对活动近年来确定通过检测近年来活动的pH值范围3 - 8与三种缓冲(50更易与解决方案·l⁻¹柠檬酸钠缓冲,50更易·l⁻¹钠磷酸盐缓冲剂,50更易·l⁻¹碳酸钠缓冲)在50°C。的pH值稳定酶研究通过检测酶被孵化后的剩余活动3 h在室温下不同的pH值。获得最佳反应温度、混合组成的1毫升衬底溶液(1% (w / v)岩藻vesiculosus溶解为0.02摩尔·l⁻¹柠檬acid-sodium柠檬酸缓冲,pH值6.0)和0.1毫升孵化酶解决方案在不同的温度下10分钟。酶的热稳定性研究,0.1毫升的解决方案是孵化温度范围从30到80°C 1 h,然后迅速在冰浴冷却5分钟,然后取出25°C。剩余酶活性检测50°C 10分钟。

酶的底物特异性是由使用不同的检查,从岩藻vesiculosus和昆布属植物sp.基质。米氏常数()和最大反应速度(双重相反图法)计算的莱恩威弗和伯克32]。

2.7。近年来红外光谱评估二级结构

红外光谱被记录在MAGNA-IR750傅里叶变换光谱仪(INCOLET INSTRVMENTW,美国)。的频谱范围从1500 ~ 2200厘米⁻¹,32岁的光谱分辨率扫描收集4厘米⁻¹。纯近年来(10毫克)100毫克的干拌溴化钾(KBr)。水蒸气从样品间清除。的频谱酰胺我乐队获得了近年来,self-deconvolution和曲线拟合的方法被用来分析近年来的二级结构。

3所示。结果

3.1。净化的近年来

两个蛋白峰(E1和E2)被观察到。E2(图峰值显示近年来活动1),其纯度被sds - page检测(见下文)。粗酶提取纯化66.7%丙酮沉淀和g - 100交联葡聚糖凝胶色谱法(表1)。近年来活动的净化折叠1毫克的蛋白质从1-fold提高到23.9倍,回收率从100%下降到22.7%。近年来较高的分数(管没有活动。65年至87年)是集中和集中到10毫升。排除从碳源用于减少碳水化合物(淀粉、海带多糖),培养fucoidanase-related酶如fucosidase和淀粉酶活性的纯化蛋白测定,但没有fucosidase或淀粉酶活性(表2)。

3.2。近年来的等电点和分子量测定

结果展示,等电点电泳纯化近年来给一个乐队,和酶的等电点是pH值4.5(图2)。

纯化近年来给一个乐队在sds - page凝胶,这表明,相对纯近年来已获得。近年来的分子质量约为64 kDa的sds - page(图3)不同Dendryphiella arenariaTM94 (180 kDa)。分子标记是肌球蛋白(220 kDa),2巨球蛋白(170 kDa),牛乳糖(116 kDa),转铁蛋白(76 kDa)和谷氨酸脱氢酶(53 kDa)。

3.3。pH值对近年来活性和稳定性的影响

pH值对近年来获得的活性的影响镰刀菌素sp。LD8如图4。最大的酶活性在pH值6。这种酶的最佳pH值非常接近,从海洋真菌Dendryphiella arenariaTM94和弧菌sp。存在,而近年来从肝胰腺的最佳pH值Patinopecten yessoensis是5.5。

pH稳定性的影响也被确定。结果表明,酶显示稳定pH值6.0,而在pH值为5.0和8.0,一个活动大约50%的损失发生后6 h孵化在室温(25°C),分别。

3.4。温度对近年来活性和稳定性的影响

近年来的最大活动的最适温度是60°C(图6.0 pH值5(一个))。30°C的活性近年来降低到12.5%,而在80°C到18.75%。结果表明,近年来的最佳温度TM94高于近年来弧菌sp。存在,其最适温度是40°C (33]。

近年来的剩余活动后检查preincubating在不同的温度下1小时,和酶的温度损失了一半活动50°C(图5 (b))。它在80°C以上完全灭活。的温度损失了一半活动是不同的弧菌sp。存在和Dendryphiella arenariaTM94。的酶Dendryphiella arenariaTM94和弧菌sp。存在显示一半失去了失活的最佳温度是在56°C和40°C,分别为(33]。

3.5。的决心,亲和力,近年来

近年来检查使用的动力学参数岩藻vesiculosus摘要研究和昆布属植物sp.作为底物。的酶由Lineweaver-Burk方法的值是8.9毫克·l⁻¹和10.9毫克·毫升⁻¹,分别。与此同时,值两个基板是2.02毫克·最小值⁻¹·毫升⁻¹和2.06毫克·最小值⁻¹·毫升⁻¹,分别。摘要研究从酶显示更高的亲和力岩藻vesiculosus。

3.6。近年来的第二个结构

近年来的原始红外光谱是显示在图6。乐队在1620 ~ 1700厘米⁻¹可以主要归因于((C = O))和酰胺即酰胺的形状我带是近年来代表二级结构。的乐队1650 ~ 1658厘米⁻¹,1600 ~ 1640厘米⁻¹,1640 ~ 1650厘米⁻¹,1660 ~ 1695厘米⁻¹地区被分别分配到螺旋,表,随机线圈,词的结构。

二阶导数和治疗可进行曲线拟合,定量估计的相对比例代表一种二级结构的每个组件。第四阶导数函数计算了PeakFit 4.12软件的数量来确定组件酰胺我地区的二阶导数光谱和曲线拟合过程(表3)。根据这个乐队组合,近年来酰胺我概要文件包含四个主要组件,可以联系螺旋,表,随机线圈,词结构表显然是最强烈的组件。结果表明,表的主要组成部分(58.6%),螺旋是最少(12%)和内容的词和随机线圈分别为15.39%和14.5%。

4所示。讨论

近年来从海洋无脊椎动物可能是孤立的石决明sp,海参、海绵和软体动物(34),是由海洋细菌假单胞菌atlanica,p . carrageenovora,p . alteromonas,弧菌sp。芽孢杆菌sp, HTP2Pseudoalteromonas citrea、家庭flavobacteriaceae [19,24)和海洋真菌Dendryphiella arenariaTM94 [26),镰刀菌素sp。LD8 [27),黑曲霉,青霉菌purpurogenum,毛霉菌sp。28]。

近年来在不同的生物有不同的分子量。分子量()LD8近年来64 kDa;它靠近近年E1, E2和E3的弧菌sp。存在(39 kDa, 68 kDa, 68 kDa, resp。) (33),而的LD8近年来从肝胰腺低于近年来的Patinopecten yessoensis(100 - 200 kDa) [14),Dendryphiella arenariaTM94 (180 kDa) (35]。

近年来从镰刀菌素sp。LD8 pH值和温度更敏感。LD8近年来的催化活性达到最大值pH值6.0,这是非常接近,近年来的细菌弧菌sp。存在和Dendryphiella arenariaTM94。酶活性下降迅速LD8当pH值低于6.0或以上。在pH值为5.0和7.0,酶活性的酶保留68.2%和86.4% pH值6。近年来从LD8相对更高的最佳温度(60°C)与细菌弧菌sp。存在(37°C), Flavobacteriaceae SW5(室温),和海洋真菌Dendryphiella arenariaTM94 (50°C)。半失活温度LD8近年来是50°C,而细菌弧菌sp存在65°C。33]。

二级结构的温度效应LD8近年来研究了高斯拟合的deconvoluted光谱近年来酰胺我地区(36,37]。减少的词的结构和增加螺旋酰胺我地区被观察到的治疗温度低于60°C。虽然治疗温度高于60°C,的内容螺旋,表,随机线圈,词没有变化。上面的结果是符合我们的结论最优酶反应温度是60°C;酶活性下降迅速LD8 pH值低于或高于6.0。建议近年来的酶活性密切相关的比例螺旋和词结构没有直接关系表和随机线圈结构。

缩写

LMWF:	低分子量摘要研究
:	米歇利斯常数
:	最大反应速度
:	分子量。

确认

这项工作是由安徽省自然科学基金会的资金支持(没有。03043104),安徽省优秀青年(没有科学和技术基础。04043051)、安徽高等学校科学研究基金项目为年轻老师,合肥大学科学研究和发展基金。

引用

1. s . d . Anastyuk n·m·舍甫琴科,e . l . Nazarenko et al .,“高度的结构分析硫酸fucan褐色海藻昆布属植物cichorioides通过串联谱和ESI质谱。”碳水化合物的研究,卷345,不。15日,第2207 - 2206页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. 问:j . Wang, z, h .张x妞妞,“结构性研究小说fucogalactan从褐藻中提取的硫酸昆布属植物粳稻”,国际期刊的生物大分子卷,47号2、126 - 131年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. Bilan, a . a . Grachev a . s . Shashkov n . e . Nifantiev和ai Usov,”的结构,从褐色海藻墨L。”碳水化合物的研究,卷341,不。2、238 - 245年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. s . d . Anastyuk n·m·舍甫琴科,e . l . Nazarenko p s Dmitrenok和t . n . Zvyagintseva”的结构分析,从褐色海藻岩藻evanescensMALDI-TOF和串联ESI质谱。”碳水化合物的研究,卷344,不。6,779 - 787年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. Bilan, A . A . Grachev n . e . Ustuzhanina A . s . Shashkov n . e . Nifantiev和ai Usov,”一个高度常规分数从褐色海藻岩藻distichusL。”碳水化合物的研究,卷339,不。3、511 - 517年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. i r·l·阿尔伯克基k·c·s·奎罗斯,l·g·阿尔维斯·e·a·桑托斯·e·l·雷特和h·a·o .罗查”Heterofucans从Dictyota menstrualis抗凝活性,”巴西医学和生物学研究杂志》上,37卷,不。2、167 - 171年,2004页。视图:谷歌学术搜索
7. p . a . s . Mourao”使用硫酸fucans作为抗凝血和抗血栓形成的代理人:未来的视角,“当前的药物设计,10卷,不。9日,第981 - 967页,2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. w·j·金,y . k .古·m·k·荣格et al .,低分了体重的“阻凝活动fuco-oligosaccharides由酶消化,从韩国的孢子叶Undaria pinnatifida”,档案调药的研究,33卷,不。1,第131 - 125页,2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. t . Nishino t . Yamauchi m .崛江t . Nagumo铃木和h”影响的摘要研究激活纤溶酶原u-PA和t-PA物”血栓形成的研究,卷99,不。6,623 - 634年,2000页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. 维多·d·j·谢弗和v . s .,“抗艾滋病活性提取物和化合物从藻类和蓝细菌,”生态毒理学和环境安全,45卷,不。3、208 - 227年,2000页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. h . Maruyama h . Tamauchi m .桥本,t . Nakano抗肿瘤活性及酶的免疫反应Mekabu从孢子叶中提取的Undaria pinnatifida”,在活的有机体内,17卷,不。3、245 - 249年,2003页。视图:谷歌学术搜索
12. t . Nishino c·西冈h . Ura所言,和t . Nagumo隔离和局部特征的小说硫酸氨基糖fucan商业化岩藻vesiculosus摘要研究。”碳水化合物的研究卷,255年,第224 - 213页,1994年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. l . Chevolot福柯,f . Chaubet et al .,“进一步的数据结构的棕色海藻fucans:与抗凝活性的关系,“碳水化合物的研究,卷319,不。1 - 4、154 - 165年,1999页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. t .藤、k . Koyabu和m .和田“酶的酶在肝胰腺鲍鱼活跃(1)原油CM-cellulose酶和未被吸收的分数,”日本Nogeikagaku Kaishi53卷,第95 - 87页,1979年(日本)。视图:谷歌学术搜索
15. k . Kitamura m .学者和t . Yasui酶降解的摘要研究近年来肝胰腺的Patinopecten yessoensis”,生物科学、生物技术和生物化学,56个卷,第494 - 490页,1992年。视图:谷歌学术搜索
16. w . Yaphe和k·摩根”的岩藻多糖酶水解假单胞菌王者世界和假单胞菌carrageenovora”,自然,卷183,不。4663年,第762 - 761页,1959年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. T s Furukawa先生藤、d四郎和a . Ide”fucoidan-degrading酶的生产,近年来,摘要研究硫酸酯酶弧菌sp,存在。”日本Suisan Gakkaishi卷,58页。1499 - 1503年,1992年(日本)。视图:谷歌学术搜索
18. i . y . Bakunina, o . i Nedashkovskaya s a Alekseeva et al .,“海洋proteobacterium摘要研究的退化Pseudoalteromonas citrea”,Mikrobiologiya卷。71年,41-47,2002页。视图:谷歌学术搜索
19. t .酒井法子,h .木村,加藤,“海洋酶的菌株Flavobacteriaceae利用海带,”海洋生物技术,4卷,不。4、399 - 405年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. t .酒井法子,k .不能,加藤,“隔离和表征fucoidan-degrading海洋细菌,”海洋生物技术,5卷,不。5,409 - 416年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. t .酒井法子,k .不能k . Shimanaka k . Ikai寡糖结构和加藤,”来自Cladosiphon okamuranus摘要研究与海洋细菌酶消化。”海洋生物技术,5卷,不。6,536 - 544年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. t .酒井法子,h .木村,加藤,“净化硫酸fucoglucuronomannan裂合酶的菌株Fucobacter玛丽娜和研究其酶消化,适当的条件”海洋生物技术,5卷,不。4、380 - 387年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. j . p . Wang Cai, s秦et al .,”海洋细菌的发酵芽孢杆菌sp, H-TP2近年来和酶的属性。”食品与发酵工业,30卷,页13 - 15,2004(中国)。视图:谷歌学术搜索
24. a . m . Urvantseva y Bakunina, o . i Nedashkovskaya s . b . Kim和t . n . Zvyagintseva”的分布细胞内酶水解酶在海洋细菌的家庭Flavobacteriaceae”应用生物化学和微生物学,42卷,不。5,484 - 491年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. 诉Descamps,科林,m .拉哈伊et al .,“隔离和文化的海洋细菌降解硫酸fucans从海洋褐藻,”海洋生物技术,8卷,不。1,27-39,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. j . k .吴问:Wu燕et al .,“生产近年来从海洋真菌Dendryphiella arenariaTM94固体基质发酵。”ESMB5卷,12 - 14,2002页。视图:谷歌学术搜索
27. 问:吴,j . Cai、吴k和s .秦“LD8近年来海洋真菌固态发酵。海洋科学。”海洋科学卷28日,汽车2004页。(中国)。视图:谷歌学术搜索
28. r·m·r·的看法是从c·n·a·冈萨雷斯l . Pastrana和j·a .特谢拉”的识别和评价真菌菌株的酶降解潜力,”第十届国际化学和生物工程研讨会论文集(CHEMPOR ' 08)布拉加,页2106 - 2109年,葡萄牙,2008年9月。视图:谷歌学术搜索
29. t .酒井法子,t·卡瓦依,加藤,“隔离和表征fucoidan-degrading海洋菌株及其近年来的”海洋生物技术》第六卷,没有。4、335 - 346年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. m·m·布拉德福德”,迅速和敏感的方法定量微克量的蛋白质利用的原则染料绑定,”分析生物化学,卷72,不。1 - 2、248 - 254年,1976页。视图:谷歌学术搜索
31. g·l·米勒”,使用二硝基水杨酸试剂测定还原糖,”分析化学没有,卷。31日。3、426 - 428年,1959页。视图:谷歌学术搜索
32. h·莱恩威弗·d·伯克,“酶解离常数的测定,美国化学学会杂志》上卷,56号3、658 - 666年,1934页。视图:谷歌学术搜索
33. t . s . Furukawa先生藤、d四郎和a . Ide“净化和一些性质exo-type近年来弧菌sp,存在。”生物科学、生物技术和生物化学,56个卷,第1834 - 1829页,1992年。视图:谷歌学术搜索
34. r·丹尼尔·o .贝尔托j . Jozefonvicz和n . Goasdoue降解藻(Ascophyllum结节性消化腺中包含的)摘要研究了酶活性的海洋软体动物梳状突起马克西姆斯,”碳水化合物的研究,卷322,不。3 - 4、291 - 297年,1999页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. 问:吴,m . Zhang k . Wu b . Liu j . Cai和r .锅”,净化和特点,近年来获得Dendryphiella arenariaTM94。”应用藻类学杂志,23卷,不。2、197 - 203年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. 美国马研究制备、酶学性质以及近年来从海洋镰刀菌素的表征中国,安徽农业大学硕士论文,2006。
37. 马,h·肖,吴,r .锅和j . Cai”调查近年来红外光谱的光谱,光谱和光谱分析卷28日,页。590 - 593年,2010年(中国)。视图:谷歌学术搜索

版权

版权©2011吴千千et al。这是一个开放分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。