PWS/AS MS-MLPA确认15q11.2微复制的母系来源

摘要

染色体15q11.2-q13长臂的近端区域与各种神经发育障碍有关，包括普拉德-威利(PWS)和安杰曼(AS)综合征、自闭症和其他由缺失和重复引起的发育异常。此外，这一区域还包括导致PWS或AS的印迹基因，这取决于亲本。这种印迹可以通过甲基化敏感(MS)多重连接依赖探针扩增(MLPA)来基于甲基化状态诊断PWS或AS。母亲在15q11.2-q13处产生的微复制与自闭症和其他神经精神障碍有关。多种方法被用于确定15q11.2-q13微缺失和微重复的源父母。在目前的研究中，一名患有发育迟缓的4岁非畸形女性患者被发现患有新创通过寡核苷酸基因组阵列在15q11.2内复制约5 Mb。为了确定这种微重复对临床表型的意义，需要确定起源的父母。PWS/AS MS-MLPA分析通常用于区分15q11.2-q13缺失和单亲本二体(UPD)，导致PWS或AS。然而，我们的研究表明，PWS/AS MS-MLPA也可以有效区分15q11.2-q13重复序列的亲本来源。

1.介绍

位于15q11.2-q13区域的1-5普通断点(BP1-BP5)的多个片段重复导致非等位同源重组(NAHR)，导致各种缺失和微重复事件[1)(图1）.经典的PWS/AS缺失(I类或II类)的两侧要么是BP1或BP2，要么是更远端的BP3 [1］．BP2和BP3之间的区域包含一簇甲基化的印记基因，包括SNRPN和UBE3A，分别以父系或母系方式表达，但并非两者都有。该区域的缺失或单亲二体（UPD）导致PWS或AS，具体取决于异常染色体的起源亲本[2］．BP1和BP2之间的区域包含4个进化保守的非印迹基因(NIPA1，NIPA2，CYF1P1和TUGCP5)是与神经功能障碍相关的易感区域[1］．伴BP3和BP4的缺失可能导致多种异常表型，包括身材矮小、发育不良、小头畸形和肌张力减退[3.］．15q13.3微缺失综合征发生在BP4和BP5之间，与神经认知功能障碍的可变表型有关，包括智力残疾、自闭症、癫痫和精神障碍，外显率降低[4］．涉及15q11.2-q13区域的母亲复制也与自闭症、发育迟缓、智力障碍、癫痫和张力减退有关[5是一种公认的遗传综合症[6］．虽然病例数量很少，但单靠父亲的重复似乎并不能完全穿透自闭症表型[6］．

图1

15号染色体表意文字显示15q11.2-q13中的断点BP1–BP5和PWS/AS常见缺失区域（绿色）。位于每个断点区间的基因如下所示（蓝色=父系表达/母系印记；紫色=母系表达/父系印记；黑色=双等位基因表达/无印记）。^＊APBA2是MS-MLPA中的一个非印迹基因(见图)2）.

(一)

(b)

(一)
(b)

图2

MS-MLPA检测15q11.2重复序列。轴表示BPS和碎片大小-轴表示探针峰值比。(a) MLPA拷贝数峰值比:红色= PWS/AS区域探针;green = non-PWS/AS区域探针。1 = TUBGCP5;2 = APBA2;3 = NIPA1;女性患者X(2个拷贝)和Y(0个拷贝)染色体。(b) MS-MLPA酶切5个HhaI甲基化敏感探针:4 = SNRPN内含子1;5 = SNRPN外显子1;6 = SNRPN内含子1; 7 = SNRPN promoter; 8 = NDN; * = HhaI digestion controls.

甲基化CpG残基的常规临床检测包括使用甲基化敏感酶进行RFLP，然后进行Southern blot，使用亚硫酸氢盐处理DNA样本进行甲基化特异性PCR，使用等位基因特异性PCR，然后进行凝胶电泳，甲基化敏感高分辨率熔化(MS-HRM)曲线分析[6), MS-MLPA。

MS-MLPA检测CpG残基甲基化状态以及基因拷贝数。本实验室使用的MS-MLPA ME028-B1 PWS/AS探针混合物是通过MRC-Holland购买的，包含5个印迹基因探针NDN(1探针)SNRPN(4探针)。这些探针包含HhaI的识别位点，这是一种甲基化敏感限制性内切酶，用于确定该区域的甲基化状态。其余探测用于检测副本数的变化。当检测到一个拷贝数变化(CNC)时，甲基化状态表明这个CNC是母系的还是父系的。如果没有检测到CNC，则甲基化状态区分正常双亲本遗传和UPD。对于每一个病人,根据MLPA分析的拷贝数(患者样本中单个探针与对照DNA样本之间的标准化荧光峰比值)和相应的甲基化比率(MS-MLPA分析的HhaI消化和未消化探针之间的标准化荧光峰比值)分配基因型患者样本的印迹区域)。峰值比率(拷贝数)为1.0(两个拷贝)，甲基化比率为0.5(父、母等位基因)代表野生型序列;峰值比率为1.0(两个拷贝)，甲基化比率为1(仅限母体等位基因)或0(仅限父系等位基因)分别代表PWS或AS的UPD; a peak ratio of 0.5 (one copy) with a methylation ratio of 1 (maternal alleles only) or 0 (paternal alleles only) represents either a PWS or AS deletion, respectively; and a peak ratio of 1.5 (three copies) with a methylation ratio of ~0.7 (2 of 3 maternal alleles) or ~0.3 (2 of 3 paternal alleles) represents either a maternal or paternal duplication, respectively. Although the PWS/AS MS-MLPA kit is used extensively in molecular diagnostic laboratories for PWS/AS analysis, there have been few reports of using this kit for the identification of parent-of-origin for duplications of 15q11.2-q13. Parent-of-origin of proximal 15q duplications using MS-MLPA was determined initially in a cell line from the Coriell Repository (GM12135) [7]，随后在病人中[8］．

2.案例介绍和讨论

在目前的研究中，一名4岁的发育迟缓的非畸形女性患者被发现为II级新创在15q11.2(RP11-1071C22x3)dn范围内，在BP2和BP3之间复制约5mb。arr [hg19] 15q12 . (23,664,484-28,602,810)x3 (CombiMatrix Diagnostics, Irvine, CA)。MLPA分析显示，PWS/AS区域内所有15号染色体探针经连接和PCR扩增后的峰值比(拷贝数)均为~1.5(图)2(一个)).对NIPA1和TUBGCP5基因(圈)，位于BP1和BP2之间，靠近PWS/AS区域APBA2基因(圈)位于BP3和BP4之间，PWS/AS区远端，拷贝数正常~1.0。对5个甲基化敏感探针中的4个进行连接、酶切和PCR扩增，结果甲基化率为~0.7(图中所示)2 (b)).第五个甲基化敏感探针，NDN，具有已知的过度饮食倾向（MRC Holland），导致甲基化率明显降低0.41。剩余的非甲基化敏感探针的峰值比为~1.0。该MS-MLPA模式表明该患者的15q11.2重复是母体来源，MLPA结果表明该重复可能代表导致com的互惠产物mon PWS/AS删除。

为了验证MS-MLPA结果，我们分析了该先证者及其父母位于15号染色体上的8个未连接的微卫星标记。一个标志,GABRB3(父亲= 193/201;孕产妇=185/197)，证实有一个母体复制，有一个父系和两个母体等位基因(185/197 /201). 远端的标记GABRB3与正常双亲遗传一致，近端标记为非信息性。这表明，在15q11.2-q13中，由于母体减数分裂交换和重组的不平等，出现了重复。

综上所述，MS-MLPA检测方法不仅可以区分PWS或AS中缺失和UPD，还可以区分15q11.2-q13重复序列的亲本来源。因此，MS-MLPA可以作为一种辅助技术来阐明微阵列或核型检测15q11.2-q13重排的病因机制。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

工具书类

1. R.D.Burnside，R.Pasion，F.M.Mikhail等人，“BP1和BP2之间近端15q11.2的微缺失/微复制：神经功能障碍的易感区域，包括发育和语言延迟，”人类遗传学，第130卷，第4期，第517-528页，2011年。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
2. A.Hogart，K.N.Leung，N.J.Wang等人，“染色体15q11–13重复综合征大脑揭示了基因表达的表观遗传改变，而不是通过拷贝数预测的。”医学遗传学杂志第46卷，第46期2, pp. 86-93, 2009。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
3. J. A. Rosenfeld, L. E. Stephens, J. Coppinger等人，“15q13上断点3和4两侧的缺失可能导致异常表型，”欧洲人类遗传学杂志第19卷第2期5, pp. 547-554, 2011。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
4. N. Hoppman-Chaney, K. Wain, P. R. Seger, D. W. Superneau, J. C. Hodge，“15q13.3单基因缺失的鉴定:CHRNA7导致15q13.3微缺失综合征表型的进一步证据”，临床遗传学，第83卷，第83期4, pp. 345-351, 2013。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
5. A. Ingason, G. Kirov, I. Giegling等，“母亲在15q11-q13处衍生的微复制:精神疾病中印迹基因的含义”，美国精神病学杂志第168期4, pp. 408-417, 2011。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
6. N. Urraca, J. Cleary, V. Brewer等，“间质重复15q11.2-q13综合征包括自闭症，轻度面部异常和典型的脑电图特征。”自闭症研究，第6卷，第4期，第268-279页，2013年。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
7. M.Procter，L.-S.Chou，W.Tang，M.Jama和R.Mao，“通过甲基化特异性熔化分析和甲基化特异性多重连接依赖性探针扩增对Prader-Willi和Angelman综合征进行分子诊断，”临床化学号，第52卷。7, pp. 1276-1283, 2006。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
8. U.Aypar、P.R.Brodersen、P.A.Lundquist、D.B.Dawson、E.C.Thorland和N.Hoppman，“起源的父母重要吗？应该对具有多个Prader Will/Angelman综合征临界区拷贝的患者进行甲基化研究，”美国医学遗传学杂志A辑，第164卷，第164号10, pp. 2514-2520, 2014。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索

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