偶然发现的纯合子的p。意大利M348K无症状病人证实了许多面临囊性纤维化

文摘

囊性纤维化(CF;人类219700号)是一种常染色体隐性疾病由突变引起的雌性生殖道囊性纤维化跨膜电导调节基因,从而导致异常粘稠的粘液分泌物在多个器官,其主要临床特征是胰腺功能不全、慢性支气管感染、男性不育。我们报告的情况下47岁显然正常男性导致突变的纯合性p。从nonconsanguineous M348K父母。渊源者是筛选使用标准的70种不同的测试小组NanoChip 400平台。大规模并行焦磷酸测序454 JS机器允许第二层次的分析。病人首先筛选与两个不同的平台可以在我们的实验室中,获得一个模棱两可的信号p。R347P突变。因为这个原因我们决定澄清的不和谐的结果雌性生殖道状态由下一代测序(上天)使用454小乐器。病人没有航母的p。R347P突变,但总会在强调一个纯合子替换从T > 1043位置的编码区,造成一种氨基酸替换从蛋氨酸、赖氨酸(p.M348K)。偶然发现的p。M348K纯合子突变个体,没有任何特色的古典或模CF形式,允许我们确认p。M348K是良性罕见的多态性。

1。介绍

囊性纤维化(CF;人类219700号)是一种常染色体隐性疾病由突变引起的雌性生殖道囊性纤维化跨膜电导调节基因,从而导致异常粘稠的粘液分泌物在多个器官,其主要临床特征是胰腺功能不全、慢性支气管感染、男性不育(1]。近年来它已经被承认,与多种临床表现的疾病雌性生殖道突变。大约10%的患者表现为轻度的CF,轻微的呼吸道症状,胰腺癌相关的充分性正常,或边缘汗水测试结果2]。自CF是高度可变的临床特点,诊断CFTR-related障碍(CFTR-RD)可能是非常复杂的。

直到现在已经有超过1900种不同的突变报道,人口分布之间的不同(http://www.genet.sickkids.on.ca/app)。在意大利,CF发生率大约是1:2700人指示承运人个人的速度约为1:25 (3]。

我们报告的情况下47岁的意大利男性是写给我们部门提交雌性生殖道突变筛选,初步体外受精过程中,因为他的合作伙伴提出了一个减少卵巢储备的个人历史。

病人筛选使用两个不同的平台可以在我们的实验室中,获得一个p模棱两可的结果。R347P突变。因为这个原因我们决定验证的雌性生殖道地位下一代测序(门店)。这种创新的分子生物学方法揭示了纯合性的核苷酸替换(c.1043T >),导致氨基酸蛋氨酸的变化赖氨酸在348位置(p.Met348Lys)。不包括在当前这个序列变异雌性生殖道突变筛选小组推荐的美国大学医学遗传学和美国妇产科医生大学的校长。在随后的后续测试咨询病人没有报告任何特定的临床症状与CF。

在这项研究中,首次上天允许我们识别一个意大利患者同型结合的氨基酸替换,p.M348K。此外,在这种背景下,我们强调使用捷的分子分析雌性生殖道基因可以帮助扩大的频谱雌性生殖道突变促进识别已知的、罕见的或新的突变导致疾病,以及基因组变异,需要功能描述。挥动454初级允许CF基因检测的准确和具有成本效益的方法,适合常规临床实践和准备一个有效的替代Sanger测序。

2。病例报告

47岁男性被称为人工辅助受孕之前我们的医院做一个检查。他的病史是完全负面的(a)血缘关系;(b)不孕不育,因为他的父亲是与前妻所生的女儿;(c)胰腺或急性肺部感染;(d)先天性输精管的双边发育不全(CBAVD),轻度肺表达与支气管扩张、特发性慢性胰腺炎,脂肪痢,高胆红素血,鼻窦炎,过敏性支气管肺的,和哮喘。此外,精液调查完全是正常的。这个人拒绝接受sweat-test自从他常参与培训,不允许执行这种类型的生化评价。

从外周血基因组DNA是孤立的一个商用CE-IVD工具包(高纯PCR模板制备包,罗氏诊断,美国、http://www.roche.com/index.htm)和DNA浓度和纯度spectrophotometrically测量(NanoPhotometer Implen,慕尼黑,德国,http://www.implen.de/)。此外,DNA完整性验证了0.8%琼脂糖电泳。最初,59岁的病人筛选使用标准面板不同CF突变,通过反向点INNO-LiPA洇雌性生殖道19日,雌性生殖道17 +静脉注射8 polyT更新和雌性生殖道意大利地区(Innogenetics,根特,比利时)。可疑INNO-LiPA雌性生殖道结果是测试CF70工具包(美国CA Nanogen) NanoChip 400机器。

NanoChip技术基本上是一个向前allele-specific寡核苷酸(麻生太郎)基于试验是放置在一个电子控制微阵列格式。每个NanoChip由400点附在铂丝连接。DNA带负电荷的电子引导一个测试网站,网站绑定链霉亲和素生物素化的样本。变性后,CF 70电子表格数据分析表明每个突变的基因型从绿到红的信号比荧光探针(绿色和红色)和检测到的信号经过严格的清洗程序(4]。整整两个不和谐的结果,编码序列和外显子/内含子的连接雌性生殖道基因是由上天。特别是,我们使用雌性生殖道MASTR v2试验(Multiplicom分子诊断),遵循制造商的指示。扩增子分别纯化使用Agencourt Ampure XP工具包(贝克曼库尔特)和随后量化与光周期计480(罗氏诊断)通过Quant-iT PicoGreen dsDNA分析工具包(表达载体)。克分子数相等的池是放大来生成一个扩增子库使用GS初级钛emPCR工具包(罗氏诊断)后,制造商的指示。四百五十四测序随后454 GS初级v 2.7系统上执行(罗氏)使用GS初级钛测序工具包(罗氏诊断)。我们使用一个新的内部生物信息学工具,名为“扩增子套件”,能够自动分析每一个GS初级序列运行。分析包括不同的步骤:(a)测序质量控制检查(“覆盖”雌性生殖道扩增子),(b)的识别变异(致病与否),和(c)评价功能变异的影响意义的不确定性(VUS开头)通过处理一些预测工具(如筛选和PolyPhen)。几个过滤器被应用于丢弃测序错误和区分多态性和基因突变。确认p。M348K突变,由门店,桑格排序的雌性生殖道外显子8。因此,DNA样本是放大使用特定的引物雌性生殖道E8F: 5′-CTCAGGGTTCTTTGTGGTGT-3′和雌性生殖道E8R: 5′-AATGCCACTCTCATCCATCA-3′。循环测序反应是使用相同的引物和大染料终止工具包3.1 v(应用生物系统公司)。测序PCR产物进行了分析使用ABI3500基因分析仪(应用生物系统公司)和一致的参考序列NG_ 016465.1雌性生殖道基因。

初步分析是收集的测序软件和由SeqScape软件(应用生物系统公司)诉3。

雌性生殖道Inno-LiPA工具包的筛选显示的弱野生型区间p。R347P突变。因为这个结果也证实reextracted DNA样本,病人广泛70突变的基因通过NanoChip面板技术。在这种情况下NanoChip技术显示绿色信号标准雌性生殖道标记有一个G: R值> 5。这一发现强调了野生型基因型p。R347P突变。虽然这个结果可能会让人安心,两种技术之间的差异提出一个完整的筛选雌性生殖道基因检测可能的改变或突变由于Inno-LiPA试验发现的异常反应。

新兴上天让我们分析的完整雌性生殖道编码区及外显子/内含子结点。”雌性生殖道扫描”显示纯合子替代从T > 1043编码区域的位置。密码子348 (ATG)改为亚美大陆煤层气有限公司,造成一种氨基酸替换从蛋氨酸、赖氨酸(p.M348K)(图1(一)),这并不保守,因为蛋氨酸(一种非极性氨基酸)取代了赖氨酸(极性氨基酸)。这个结果证实了当时桑格排序(图1(b))。

3所示。讨论

到目前为止,超过1900雌性生殖道突变和已报告300多态性(http://www.genet.sickkids.on.ca/app)。广泛报道的文献中,的频率雌性生殖道突变是不同的根据地理区域(5]。最简单和快速突变研究方法涉及使用定义面板的突变,可以覆盖超过80%的人口的疾病风险。然而,高雌性生殖道遗传异质性是一个限制因素时使用这种方法。事实上,突变面板包含在各种商用工具不能完全覆盖所有全世界的地理区域。因此,低检测率可以提供高度的第一层囊性纤维化筛选试验,最重要的是在缺乏家庭风险的情况下,比如在病人需要雌性生殖道基因检测在试管过程之前。在这些条件下测试雌性生殖道失踪的概率是非常高的。事实上,自2003年以来,我们已经筛选了超过9000个人(90%的评估只在不育或试管筛查程序的上下文中):伟大的一部分(大约96%)导致负面最初水平雌性生殖道测试。虽然大量的负面的雌性生殖道的结果可能是合理的预防方法在试管过程之前,我们还应该考虑到,所有这些人都与商业分析工具能够覆盖风险率接近85%。因此,我们不能排除其他变异或突变的存在,不包含在工具包,在自2003年以来的人中有8100人。因此,为了提供一个完整的雌性生殖道基因扫描,我们分析的全部编码区及外显子/内含子连接Sanger测序。此外,大规模并行测序(MPS)是一种新型的、高效的策略,可以替代其他当前低吞吐量和耗时的分子的方法。事实上,国会议员方法允许同时完成不同的基因的分子分析相同的运行,降低成本和周转时间。在这种背景下,我们实验室工作流程能够分析BRCA1/2,雌性生殖道,熟悉的高胆固醇血症基因在同一454初级运行。出于这个原因,我们决定引入其一个有效的替代方法雌性生殖道桑格基因测序。门店技术的进一步的优点是它的灵活性,因为它还可以耦合与自制的生物信息学工具,因此强烈减少商业软件的成本:因此,在我们的经验中,议员代表可靠和健壮的分子诊断方法的CF和CFTR-RD [6]。

通过门店,我们识别第一个意大利患者p.M348K纯合子雌性生殖道突变。这种酸性氨基酸替换M6雌性生殖道蛋白质非保守的领域:蛋氨酸是赖氨酸所取代。这种突变之前确定:(一)无害的多态性在囊性纤维化高危家庭(7];(b)在复合杂合现象与L346P塞浦路斯雄性个体(8];和(c)在纯合子男孩呼吸道症状和未能茁壮成长9]。据Hentschel et al。9],p的临床意义。M348K突变仍不清楚。在这方面,临床和功能翻译的雌性生殖道(CFTR2)项目代表了一种新方法为临床和功能注释的突变中确定致病基因(10]。事实上,CFTR2将帮助解释个人genotype-phenotype相关性的p。M348K,证实的假说不致病的这种变体的作用,虽然它仍然是归类为致病突变在人类基因组变异数据库。

此外,我们强调p。M348氨基酸性渣完全守恒在7种分析表明进化压力(数据没有显示)。自348年以来残留M6位于跨膜域,有一个重要的角色在毛孔功能,调节雌性生殖道的蛋白质的结构可能会被改变,可能确定病理效应由于更换蛋氨酸和赖氨酸。M6跨膜域由以来只有3极性和16个非极性氨基酸,氨基酸变化从蛋氨酸、赖氨酸(从polar-to-nonpolar)不能影响氯通道结构,因为其他15个氨基酸残基能保证疏水M6的功能结构域:我们推测,这种机制可以解释中性CFTR突变在检测蛋白质的影响。

总之,根据病人的临床特征,我们可以确定D 'Apice等人发表的数据和Hentschel等人认为p。M348K不致病的变体。事实上我们个人没有任何特征的CF或其他相关症状轻微CF形式和/或CF-related紊乱。

考虑到表型和我们先证者的临床特征,我们可以能回答问题解决Hentschel等人在他们的论文的标题反应,p。M348K不是致病突变但良性罕见的多态性。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

引用

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