长的非划分RNA Tug1通过MiR-141-3P / ROR2轴促进OX-LDL处理的HA-VSMC中的功能

抽象的

背景．动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是世界范围内常见的严重疾病。合并论文报道了长链非编码rna (lncrna)参与AS的多种病理过程，但其机制尚不清楚。本研究旨在揭示具有生物学功能的lncRNA taurine-上调基因1 (TUG1)的表达谱，以及在AS进展中的可能机制在体外．方法．氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）用于AS模型构建在体外．采用定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)检测AS组织或ox- ldl处理的血管平滑肌细胞(HA-VSMCs)中lncRNA TUG1、miR-141-3p和受体酪氨酸激酶样孤儿受体2 (ROR2)的水平。采用3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2- h -四唑溴化铵(MTT)和transwell法检测其生物功能效应。增殖相关蛋白(CyclinD1, Ki-67)和转移相关蛋白(β联蛋白，波形蛋白），并在ROR2细胞通过蛋白质印迹分析来确定。潜在的结合位点被母星软件在线预测，并通过双荧光素酶报告分析证实。结果．TUG1和ROR2在AS组织和ox- ldl处理的HA-VSMCs中表达增加。而miR-141-3p在AS组织中低表达与TUG1、ROR2呈负相关。TUG1的沉默抑制了ox- ldl治疗的HA-VSMCs的增殖、迁移、侵袭和转移。同时，通过starBase软件在线预测miR-141-3p与TUG1或ROR2的推测结合位点。此外，miR-141-3p的缺失逆转了TUG1下调对细胞的积极作用。此外，miR-141-3p的下调破坏了ROR2沉默的生物功能结果。结论．TUG1促进AS的进展在体外通过调控miR-141-3p/ROR2轴。

1.介绍

动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是一种常见的多因素慢性血管疾病，是心血管疾病(CVD)的主要类型[1那2］.CVD被称为严重的疾病，具有高度的死亡率和发病率，伴有各种风险因素，如内皮损伤，内皮细胞凋亡，巨噬细胞招生，血管平滑肌细胞（VSMC）的积累，以及促炎细胞因子一代 [3.］.VSMC的病理增殖和炎症反应的发展可以促进动脉粥样硬化和动脉恢复[4.］.氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）被认为是在AS的发展的一个重要因素通过促进内皮功能障碍和血管平滑肌细胞的加速的生长和迁移[5.］.

长非编码rna (Long noncoding RNAs, lncRNAs)是一类长度超过200个核苷酸(nts)的长rna，不具有翻译能力，在转录阶段影响基因表达[6.］.新的证据表明，lncrna在肿瘤发生中扮演功能性调节者的角色[7.]，神经病学〔8.]， 心血管系统 [9.]以及其他疾病的发展[10］.

近年来，越来越多的证据表明，靶向lncRNA taurine-上调基因1 (lncRNA TUG1)可以作为一种新的辅助治疗as的策略[11］.Li等人发现38例AS患者血清标本中TUG1表达增加，与24例健康受试者相比[12］.此外，TUG1的异常表达促进了牛低密度脂蛋白刺激的巨噬细胞和VSMCs的细胞生长和炎症因子分泌，抑制了细胞凋亡[11］.机械地，增加的增殖和迁移变化诱导的原代人的转染脐静脉内皮细胞（HUVEC）与TUG1过表达能通过抑制Wnt途径[颠倒13］.然而，关于TUG1在AS进展中的作用及其可能机制的研究甚少。

lncrna - mirna -基因调控网络在血管病理生理学领域备受关注[14］.据报道，MIR-141可能在牛-LDL诱导的VSMC的异常增殖中发挥重要作用。例如，Pappa的过度表达损害了VSMC中的miR-141诱导的增殖抑制[15］.同时，miRNA-141也被发现在食管癌中激活Wnt信号通路[16和间充质干细胞[17］.然而，在心血管领域的研究报道很少。特定的Wnt/受体/辅受体组合在决定最终的下游信号效应方面尤为重要。ROR2是Wnt5a激活信号通路的关键。Wnt5a和ROR2在动脉粥样硬化晚期病变和斑块内巨噬细胞/泡沫细胞中显著表达[18］.

在本研究中，我们探索了TUG1在AS组织或ox- ldl处理的HA-VSMCs中的表达模式，以及在ox- ldl处理的HA-VSMCs中对增殖、迁移、侵袭和转移的生物功能影响。进一步在ha - vsmc中研究了TUG1参与AS的分子机制。

2.材料和方法

2.1。临床样本

实验经江西省人民医院伦理委员会批准，按照《赫尔辛基宣言》原则执行。AS病人的组织样本( ）及健康志愿者( ）均来自江西省人民医院所有样品保存在-80°C保存。所有参与者均提供知情同意。

2.2。细胞培养，给药和转染

从美国型培养收集物(ATCC, Manassas, VA, USA)中获得人血管平滑肌细胞(HA-VSMC)，含1%青霉素/链霉素(Beyotime Biotechnology Company, Shanghai, China)，按上述方法培养[19］.用ox-LDL (Biosynthesis Biotechnology Company, Beijing, China)构建AS模型在体外．具体地说，细胞在有不同剂量ox-LDL (0μ.克/毫升，25 μ.克/毫升，50 μ.g / ml和75 μ.g / ml）24小时，并在含有Ox-LDL的培养基中以终浓度为50℃ μ.24小时g / ml [11］.靶向TUG1 (sh-TUG1)、靶向ROR2 (sh-ROR2)、TUG1过表达质粒(TUG1)、miR-141-3p inhibitor (anti-miR-141-3p)、miR-141-3p mimic (miR-141-3p)、对照(sh-NC、pcDNA、anti-miR-NC、miR-NC)均来自中国上海GenePharma公司。按照制造商说明使用Lipofectamine 3000 (Invitrogen公司，Carlsbad, CA, USA)试剂盒进行转染。序列如下:sh-TUG1, sequence, 5 -gactaccttcctgtgctatt-3. ;SH-ROR2，SEQUENCE，5 -GCCCGATTCCAACTCTGAAAG-3 ．

２.３.RNA分离与定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)

通过使用Trizol试剂（Thermo Fisher Scientific，Waltham，Ma，Ma，Ma，Ma，Ma，Ma，Ma，Ma，Ma，Ma，Ma，Ma，Ma，USA）提取来自组织和细胞的总RNA和使用All-in-One™MiRNA Primescript™RT试剂盒（Takara，Shiga，Japan）和Primescript来逆转录RT试剂盒（Takara）。用QRT-PCR检测试剂盒（Genecopoeia，Inc.，Rockville，MD，USA）和Sybr Mix（Takara）对7500快速实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific）进行QRT-PCR进行QRT-PCR。U6或甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）用作内部参考基因。Tug1，miR-141-3p和ROR2的相对表达水平由2计算^-ΔδCT.方法。MIR-141-3P和U6的引物序列是由Sangon Biotech（上海，中国）的设计和获得的，以及用于QRT-PCR反应的Tug1，MiR-141-3P，ROR2，U6和GAPDH的引物序列列出：Tug1 Forward（5 -gcuuggcuucuauucugauucuuu-3 ），反向(5 -AAAGGAUUCAGAAUAGAAGCCAAGC-3 ）;mir - 141 - 3 - p (5 -AAGACGTACTCAGGCCATGTCC-3 ），反向(5 -GACCCAAATGTCGCAGTCAG-3 ）;ROR2前（5 -CTTGATGGCATTGTCGCTAA-3 ），反向(5 -TCCAGTGGCTGTGCTAGATG-3 ）;U6向前（5 -GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 ），反向(5 -CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3 ）;和GAPDH向前（5 -GACTCATGACCACAGTCCATGC-3 ），反向(5 -AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3 )．

2.4。3-（4,5-二甲基-2-噻唑基）-2,5-二苯基-2- H-四唑溴（MTT）

每个96孔板中加入MTT试剂(Invitrogen)，细胞( 分别维持24、48、72 h，再孵育4 h。弃细胞上清，取200μ.的溶液中加入DMSO（Solarbio，北京，中国）的L的每个孔中，以溶解细胞内甲臜晶体[19］.Cell proliferation was determined at 490 nm using a microplate reader (Thermo Fisher Scientific).

2.5。Western Blot.

用RIPA buffer (Solarbio)从细胞中分离总蛋白，然后用NanoDrop 3000 (Thermo Fisher Scientific)对蛋白进行定量。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，然后将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。之后，在37°C脱脂牛奶中封闭膜2小时，然后在4°C中用一抗孵育过夜。用二抗培养2 h后:山羊抗兔IgG H&L (HRP) (1: 1000;ab205718, Abcam, Cambridge, UK)，使用ECL检测试剂盒(Beyotime，上海，中国)进行化学发光。一抗为抗ror2 (1: 1000;ab245456, Abcam)， anti-CyclinD1 (1: 1000;ab226977, Abcam)，抗ki -67 (1: 1000;ab92742 Abcam),反β-catenin (1 : 1000; ab2365, Abcam), anti-Vimentin (1 : 1000; ab137321, Abcam), and anti-GAPDH (1 : 5000; ab37168, Abcam).

2.6。Transwell小室法

采用无基质的transwell室(Corning Life Sciences, Corning, NY, USA)研究细胞迁移速率，采用预涂基质的transwell室(Corning)进行细胞侵袭实验。下腔室加入含10%胎牛血清的rmi -1640培养基，上腔室注入转染牛- ldl刺激的HA-VSMCs，含100μ.L根据制造商的说明进行无血清培养基和整个步骤。最后，使用多甲甲醛（PFA; Sigma，St.Louis，Mo，USA）用于附着位于上室的下表面上的细胞。在用晶体染色之前在显微镜下分析细胞。

2.7。Dual-Luciferase化验

通过starBase软件在线预测miR-141-3p与TUG1或ROR2的推定结合位点。TUG1和ROR2的野生型扩增片段及突变片段将UTR插入pMIR-REPORT荧光素酶载体(bioo Biology, Shanghai, China)，构建荧光素酶报告基因WT-TUG1、MUT-TUG1、WT-ROR2、MUT-ROR2。按照规定共转染荧光素酶报告基因与miR-141-3p或miR-NC [19］.使用双露西检测试剂盒(Promega, Madison, WI, USA)检测荧光素酶活性。

2.8。统计分析

所有数据表示为 并用SPSS 17.0软件进行分析。不同组之间的比较使用配对学生的分析 -检验和单因素方差分析(ANOVA)。一个值小于0.05被认为是统计上显著。

3.结果

3.1。Tug1和miR-141-3p在患者和氧化术患者组织中的表达及患有OX-LDL处理的HA-VSMCs的组织

首先，我们检查了患者组织中的Tug1水平（ ）和健康的人口（ )．TUG1在AS及正常组织中的表达如图所示1（a）;在患者的组织中观察了Tug1表达中的可见促进。同时，我们还探讨了MiR-141-3P水平作为组织。有趣的是，与Tug1相比，可以在组织中观察到逆转趋势（图1（b）)．此外，我们的数据提示，AS组织中TUG1 miR-141-3p之间存在负相关(图)1（c）)．随后，我们使用增加的OX-LDL剂量以诱导H​​A-VSMC作为模型结构在体外和50 μ.g/mL ox-LDL用于进一步实验[11］.如图所示1（d）和1 (e)增加的ox-LDL浓度用TUG1和miR-141-3p的表达相关联。具体而言，TUG1的水平执行的增强（图1（d）)，而miR-141-3p表达降低(图1 (e)）随着OX-LDL浓度扩大。

3.2。击倒TUG1抑制的增殖，迁移，侵袭和转移相关的蛋白质的氧化低密度脂蛋白刺激的HA-血管平滑肌细胞的表达体外

在氧化低密度脂蛋白刺激的HA-血管平滑肌，高细胞活力，加速迁移和侵袭能力，上调转移相关的蛋白质水平被认为与早期的研究被模仿[11］.为了进一步研究TUG1对ox- ldl处理的HA-VSMCs的生物功能影响，我们用合成的shRNA下调了TUG1的表达。随后，sh-TUG1转染细胞后，TUG1表达水平下调(图)2（a）)．在进行功能缺失实验时，MTT法检测细胞活性显著降低(图)2 (b))．然后，用于检测蛋白质印迹来检测相关蛋白质（Cyclind1和Ki-67）的表达，结果表明，Tug1的下调显着降低了这些蛋白质的水平（图2 (c))．通过transwell分析，TUG1敲低后细胞的迁移和侵袭能力明显受到限制(图)2 (d)和2（e）)．western blot结果显示表达下调β- 与用Ox-LDL + SH-NC处理的细胞相比，在OX-LDL + SH-Tug1处理细胞中的催化和Vimentin（图2（f）)．这些结果表明，TUG1敲低减少的增殖，迁移和侵袭的能力，以及抑制转移相关的蛋白质的表达，β-Catenin，和在OX-LDL处理的HA-VSMC中的Vimentin。

3.3。TUG1当时的直接目标的miR-141-3p

接下来，我们通过starBase预测TUG1与miR-141-3p之间的关系，结果显示miR-141-3p与TUG1含有互补序列(图3(一个))．然后，用COTRANSFETFETed MIR-141-3P或MIR-NC构建双荧光素酶报告载体（TUG1-WT或TUG1-MUT），进入OX-LDL处理的HA-VSMC。双荧光素酶报告结果显示，MiR-141-3P降低了Tug1-WT报道载体的荧光素酶活性，但不是Tug1-Mut报告量载体（图3（b）)．由于损失 - 和增益官能实验确认通过qRT-PCR，细胞目睹TUG1的TUG1过表达治疗或TUG1敲低施用后TUG1的有限表达后（改进的表达图3（c）)．此外，在氧化型低密度脂蛋白处理的HA-血管平滑肌细胞，的miR-141-3p的表达水平通过TUG1敲低显著上调，而的miR-141-3p的水平显着降低由于TUG的过表达（图3（d）)．此外，我们还评估了在Tug1和MiR-141-3P上的细胞沉默配置后MiR-141-3P的表达模式;与其相应的对照相比，该数据表示，组中的miR-141-3p水平降低，即Sh-Tug1 +抗miR-141-3p（图3（e）)．此外，我们观察到的转染OX-LDL处理HA-血管平滑肌细胞SH-TUG1和抗miR-141-3p的生物功能的变化。和数据显示出的miR-141-3p反转结果从敲低对细胞增殖能力的TUG1沉默（图3（f）），迁移（图3 (h))和入侵(图3(我))和蛋白表达水平(CyclinD1, Ki-67)(图3 (g)），β-catenin和Vimentin(图3 (j)）））。与此同时，的miR-141-3p的小调整也扭转TUG1下调的效果有限。总之，我们确定的miR-141-3p是目标TUG1的miRNA的。此外，的miR-141-3p的删除恢复出TUG1下调的结果。

3．4．ROR2是miR-141-3p的靶基因

starBase预测显示ROR2是miR-141-3p的潜在靶点(图)4（a）)．然后，进行与ROR2-WT或ROR2-MUT的COTRANSFECTING MIR-141-3P或MIR-NC进入OX-LDL处理的HA-VSMC。荧光素酶报告器测定显示MiR-141-3P的过表达与ROR2-WT的荧光素酶活性降低，但不与ROR2-MUT（图4（b）)．分别转染shRNA或靶向miR-141-3p过表达质粒，设计损益实验(图)4（c）)．miR-141-3p在anti-miR-141-3p组中表达较anti-miR-NC组被抑制近2倍，而miR-141-3p组中miR-141-3p的表达是miR-NC组的4倍以上。此外，anti-miR-141-3p处理后，ROR2的表达显著增加，而miR-141-3p过表达可能显著降低ROR2的表达(图)4 (d))．此外，我们还证实了不同剂量ox-LDL暴露在AS组织中的表达模式和细胞中ROR2的表达水平(图)4 (e)和4 (f)）;数据显示，AS组织中ROR2在mRNA上表达上调(图)4 (e))和蛋白质(图4 (f))水平，与AS组织中miR-141-3p水平呈负相关(图)4 (g))．相反，ROR2表达似乎增强，包括在mRNA(图4 (h))和蛋白质(图4(我))水平，且与ox-LDL给药剂量增加呈正相关。

3.5。MiR-141-3P倒闭术术对OX-LDL刺激的HA-VSMC中ROR2缺失的功能效应体外

为了更好地探讨miR-141-3p与ROR2的功能关系，将sh-ROR2和anti-miR-141-3p共转染到牛- ldl处理的HA-VSMCs中作为实验组。首先，通过qRT-PCR和western blot分析证实miR-141-3p在sh-ROR2组中低表达(图)5(一个)和5 (b))．此后，在细胞中删除miR-141-3p后，sh-ROR2+anti-miR-NC有限的细胞活力显著增加(图)5 (c))．然后，免疫印迹分析表明，细胞周期素D1和Ki-67的表达在与SH-ROR2和抗miR-NC共转染的细胞中显著调理（图5 (d))．同时，MiR-141-3P沉默还促进了ROR2删除对移民和入侵的能力（图5 (e)和5 (f))．更重要的是，的miR-141-3p敲低促进转移相关的蛋白质的低表达（β-catenin和Vimentin）从下调或沉默Tug1在牛-LDL处理的HA-VSMC中（图5（g）)．这些结果表明，降低的miR-141-3p的表达反转SH-ROR2生产的生物功能影响和促进了氧化型低密度脂蛋白处理的HA-VSMC培养转移相关蛋白的表达在体外．

3.6。TUG1通过海绵作用miR-141-3p调控ROR2的表达体外

单独将Sh-NC，Sh-Tug1，Sh-Tug1 +抗miR-NC和Sh-Tug1 +抗miR-141-3P转染到细胞中。我们通过QRT-PCR和Western印迹测定检查了ROR2在OX-LDL处理的HA-VSMC中的表达。数据表明，与SH-Tug1和抗miR-141-3P细胞转染后，ROR2水平显着增加，与用SH-Tug1和抗miR-NC转染的细胞（图6(一)和6 (b))．结果表明，TUG1通过调节ox- ldl处理的HA-VSMCs中miR-141-3p介导ROR2表达。

4。讨论

LncRNAs据报道，参与AS [进展20.那21］.近三年来，有几种具有异常表达的新型LNCRNA已经定义为[22-24］.姚等人。报道，lncRNA 00113表达AS的血清样品中上调显著，与健康对照[比较25］.Zhao等发现沉默lncRNA NONMMUT002434表达可以消除VSMCs中的迁移和增殖[26］.然而，lncrna在AS进展中的分子机制尚未完全阐明。

TUG1最初是在发育中的小鼠视网膜细胞中观察到的[27］.随后，TUG1被普遍地研究了在多种癌症，诸如骨肉瘤[28，膀胱癌[29]，非小细胞肺癌[30.]，结肠直肠癌[31和食管鳞状细胞癌[32］.多项研究表明，TUG1参与了心脏疾病的不良反应过程[33］.张等人。报道，TUG1的异位表达促进细胞生长，引发炎症因子表达，而在OX-LDL-给药RAW264.7和MOVAS细胞克制凋亡11］.先前的一项研究证明，TUG1的上调消除了丹shinol对ox- ldl诱导的内皮细胞凋亡的逆转作用[34］.此外，几条证据表明，Tug1过表达显着促进了Huvecs的增殖，迁移和细胞周期以及上调的蛋白质表达β-catenin和c-myc [13］.此外，之前的研究表明，miR-141-3p属于miR-200家族，该家族由5个mirna组成，在一条染色体上分为两个簇[35.］.有趣的是，之前的一项研究发现ox-LDL可以抑制miR-141的表达，而miR-141的下调促进了VSMCs的增殖[15］.

我们的数据也显示TUG1在AS组织和ox- ldl处理的HA-VSMCs中高表达，这与论文报道一致[12］.MTT实验表明，TUG1的下调显著抑制了细胞活力。transwell实验表明，与阴性对照相比，sh-TUG1抑制迁移和侵袭能力在体外．同时，同样的结果也可以在内皮细胞中看到[13］.另外，TUG1的减少表达限于增殖或转移相关蛋白水平。双荧光素酶报告基因检测也证实了的miR-141-3p作为TUG1的潜在目标。同时，功能实验表明，的miR-141-3p击倒逆转从细胞TUG1沉默的调节作用。这些结果上面显示TUG1可以发挥AS进展的增殖，迁移，侵袭的重要作用，并转移在体外通过针对的miR-141-3p。

ROR2是酪氨酸激酶受体家族的一员，作为Wnt5a的受体[36.］.Wnt5a/ROR2信号通路主要激活非规范的Wnt通路β联蛋白，因此调节细胞增殖和运动[37.那38.］.Cui等人的研究。据报道，通过激活ROR2 / RHOA信号通路，推动LNCRNA 430945的促进作为VSMC中的增殖和迁移的生物抵抗。

在我们的研究中，我们确定了ROR2在AS组织和OX-LDL处理HA-血管平滑肌细胞上调;在AS在ROR2类似的结果在先前的研究中证明[39.］.有趣的是，它也是双荧光素酶报告基因检测证实的miR-141-3p的潜在靶点。Western blot结果显示，转染miR-141-3p的ox- ldl处理的HA-VSMCs中ROR2表达降低，而miR-141-3p敲低后则相反。ROR2沉默所调节的生物学功能可被miR-141-3p下调所逆转。同时，可以恢复细胞增殖和转移时低表达的生物标志物蛋白。更重要的是，在ox- ldl处理下，TUG1和miR-141-3p同时沉默的HA-VSMCs中，与TUG1单独敲低相比，ROR2蛋白表达上调在体外．也就是说，Tug1可以用作miR-141-3p的海绵，以增加Ox-LDL处理的HA-VSMC中的ROR2表达。

这项研究有一些局限性;首先，MiR-141-3P和TuG1或ROR2之间的相互作用最初被双荧光素酶报告酶测定法检测，并且应该通过RNA免疫沉淀或RNA下拉来证实。此外，使用商业细胞系获得的结果和结论无法完全代表实际情况体内．因此，AS模型将用于进一步动物实验来进行。

结论

总之，我们的研究发现，癌基因TUG1通过靶向miR-141-3p促进AS进展中的细胞增殖、迁移、侵袭和转移在体外．此外，本文还发现了一个新的miR-141-3p/ROR2轴，为AS治疗提供了一种新的治疗方法。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求可从相应的作者获得。

额外观点

突出了．（1）TUG1在AS组织和OX-LDL处理的HA-平滑肌升高。（2）TUG1沉默禁止显示AS游行在体外．(3) TUG1通过海绵作用miR-141-3p调控ROR2的表达。(4) TUG1通过miR-141-3p/ROR2轴促进AS的发育在体外．

利益冲突

作者宣称，他们有利益无经济利益冲突。

作者的贡献

余唐进行了统计分析和稿件准备。景胡和志英忠负责数据收集。余唐和云霞王设计了这样的研究，还修订了发布的稿件。所有作者都阅读并批准了最终手稿。

致谢

这项工作得到了中国国家自然科学基金的批准：“MIR-497-5P的分子机制在骨髓间充质干细胞旁静脉中的作用 -β/ catenin信号通路，参与心肌梗死”（81760053）的修复。

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