总酚含量和巧克力的不同类型的抗氧化活性，牛奶，半甜，黑暗，和大豆，在大脑皮质，海马，和Wistar大鼠小脑

摘要

巧克力是全世界消费的产品，它脱颖而出呈现酚类化合物的重要量。在这项研究中，在大脑皮质，海马和雄性Wistar大鼠的小脑消耗不同种类的巧克力，包括牛奶，半甜，黑暗，大豆当总酚含量和抗氧化活性，进行了评价。总多酚浓度和抗氧化活性在体外通过DPPH自由基清除测试的方法巧克力样品中进行了评价。脂质过氧化（TBARS），蛋白质氧化（羰基），巯基，和在大脑皮质，海马SOD酶活性，和治疗的大鼠的小脑或不与过氧化氢和/或巧克力也进行了评价。黑巧克力表现出较高的酚类物质含量和抗氧化活性，其次是半甜，大豆，巧克力和牛奶巧克力。的巧克力在大鼠的饮食中添加降低由过氧化氢过氧化脂质和蛋白质氧化。在巯基测定中，我们观察到非酶促防御的水平仅与巧克力治疗的SOD酶活性是与巧克力处理的组织调制增加。我们的巧克力显著多酚含量与一个重要的抗氧化活性的样品中观察到;然而，具有不同的巧克力和其他组织中的额外的研究是必要进一步这样的调查结果。

1.简介

巧克力的特征是可可浆、糖、添加剂、可可脂、卵磷脂和类黄酮的固体分散体;不同类型之间可能会有差异;例如，在牛奶巧克力中，脂肪、蛋白质牛奶和乳糖被添加到配方中[1]。在所有巧克力的配方中，可可的含量都应该至少达到25%。众所周知，可可富含至少三种类黄酮:原花青素、儿茶素和表儿茶素，尽管巧克力的制造和处理可能会导致从可可豆中流失高达80%的类黄酮[2,3.]。在巧克力生产中使用的可可液的数量直接与可可中所含的多酚的最终数量有关。另一个与配方中酒的量有关的特征是它的苦味;因此，含有较高可可液含量的巧克力被称为苦巧克力。4,5]。

考虑到消费者越来越关注健康的生活方式，具有抗氧化特性的食物已被广泛研究，因为它们在对抗氧化应激中发挥了重要作用[6]。当包括活性氧(ROS)在内的氧化分子与抗氧化剂之间不平衡时，机体就会发生氧化应激，从而造成细胞损伤[7]。在日常饮食中最常食用的抗氧化化合物中，我们特别强调多酚，包括类黄酮，它存在于许多水果中，如葡萄和柑橘类水果，蔬菜如菠菜和花椰菜，可可豆和巧克力中也大量存在。8,9]。

临床研究表明，可可中的黄酮类化合物可通过降低血压、改善内皮功能、增加一氧化氮、减少血小板聚集和血脂、降低胰岛素抵抗等作用，有效预防心血管疾病[9,10]。抗诱变和抗肿瘤细胞增殖作用也与巧克力中类黄酮的抗氧化活性有关[11- - - - - -13]。此外，巧克力通常是在情绪紧张的情况下食用的，因为它能对情绪产生积极的影响。14]。

目前在巴西市场上，巧克力有好几种，按照可可酒的数量来划分，黑巧克力是数量最多的[1]。大豆巧克力的成分和味道都类似半甜巧克力，而不是牛奶。在这种情况下，可可液的量可以有所不同[1]。然而，在这项研究之前，没有研究比较市场上不同类型巧克力的体外抗氧化活性:牛奶巧克力、黑巧克力、半甜巧克力和大豆巧克力。在此背景下，本研究旨在建立比较传统在巴西市场销售的一些领先品牌巧克力，并评估这些巧克力对Wistar大鼠大脑皮层、海马和小脑氧化应激的一些参数的保护作用。

2.材料和方法

2.1。获得样品

在本研究中，我们获得四种不同的巧克力样品，分别为MC(牛奶巧克力)、DC(黑巧克力)、SMC(半甜巧克力)和SC(大豆巧克力)。黑巧克力和半甜巧克力在包装上分别标注了67%和43%的可可含量。

2.2。样品制备

样品按照Vinson等人描述的技术制备[15，并经Pimentel等人修改[16]。100 mg chocolate aliquots were defatted through multiple extractions with hexane. The samples were incubated at 35°C overnight and then 50 mg of them were mixed with a solution composed of 50 mL of hydrochloric acid (HCl) 1.2 M with the addition of 50% aqueous methanol. The final solution is then heated in a water bath at 90°C for 2 hours with stirring at every 30 minutes and the extract obtained is filtrated.

2.3。总多酚的测定

其提取物采用Vinson等[15]被用于使用1000总多酚的分析 μL of Folin-Ciocalteu reagent, diluted with distilled water (1 : 9), which was added to 100 mL of chocolate extract or distilled water that was used for control. The samples were left at room temperature for 20 minutes for color development. As standard, a solution of catechin (0.2 mg/mL of methanol) was utilized and read by UV-visible spectrophotometer, 750 nm.

2.4。1,1-二苯基-2苦基肼(DPPH)自由基的清除活性

采用DPPH自由基清除试验测定巧克力的抗氧化活性，DPPH自由基清除试验为200μL个样本与800混合 μL Tris-HCl 100mm溶液pH 7.0。1000年μ在混合液中加入L DPPH 250mm的乙醇溶液，避光保存20分钟;然后用紫外可见分光光度计测量吸光度，517 nm。阳性对照为Trolox。用水作为阴性对照。DPPH抑制率按以下公式计算:清除能力(%)= 100−[(样品吸光度-样品空白吸光度)×100/(对照吸光度)−(对照空白吸光度)]。的集成电路₅₀从图中计算出的值是浓度的抑制率。IC 50%，即DPPH自由基的50%，为需要扫描的样本量。

2.5。组织准备

10只Wistar大鼠，10天，在此研究中使用。动物距离Centro宇宙报Metodista IPA（巴西南部）的动物设施得到。如由Leipnitz等人描述的方法进行测定。(17]。在不麻醉的情况下对动物实施斩首安乐死，并迅速将其大脑取出。解剖大脑皮层、海马和小脑，立即用1.5%的氯化钾(KCl)匀浆，以保持细胞的完整性。该研究获得了Centro Universitario Metodista IPA动物使用伦理委员会(CEUA)的批准，协议编号为004/2011。

2.6。体外试验:抗氧化活性的治疗和评价

用于进一步分析，720 μ用从巧克力中获得的提取物处理匀浆(90)μL). 37℃孵育30分钟后，H₂O₂(90μL)加入混合物，然后再次在37℃水浴中孵育30分钟。培养后测定脂质过氧化(tbar)、蛋白氧化(羰基)、总巯基(SH)和超氧化物歧化酶(SOD)活性。通过酸加热反应中硫代巴比妥酸反应物质(tbar)的形成监测脂质过氧化[18]。二硝基联氨反应测定羰基对蛋白质的氧化损伤[19]。

用总巯基含量和抗氧化酶SOD测定其抗氧化活性。总巯基是在还原5,5-二硫代苄氧基(2-硝基苯甲酸)(DTNB)的方法中测定的，DTNB产生一种黄色衍生物，其吸光度在412 nm处用分光光度计测量[20.]。用分光光度计测定480nm下腺苷酸自催化的抑制作用，测定SOD的抗氧化能力(分光光度计模型UV-1700，日本京都岛津)[21]。

2.7。统计分析

对数据进行方差分析(ANOVA)，然后进行Tukey’s post检验，显著性水平为0.05。变量之间的关系通过皮尔逊相关关系来确定。所有分析均使用社会科学统计程序统计软件包(SPSS) 17.0版(国际商业机器公司，纽约，纽约，美国)进行。

3.结果

由于酚类化合物具有潜在的抗氧化活性，在饮食中发现新的酚类化合物来源对公众健康具有极大的兴趣。众所周知，巧克力是这些化合物的主要来源;然而，并不是所有种类的巧克力都含有相同的多酚。在我们的研究中，不同种类的巧克力在数据上显示出显著的差异():在此参数中，黑巧克力(60%可可)含量最高，其次是半甜巧克力(43%可可)(表格)1)。

DPPH IC显示了巧克力的抗氧化活性₅₀(表1)，黑巧克力具有最高的抗氧化活性，其次是大豆巧克力和半甜巧克力。黑巧克力显示出与阳性对照(Trolox)相同的抗氧化活性。我们观察到DPPH与IC呈负相关₅₀及多酚含量(0914年=−)，在巧克力中分析。

大豆和黑巧克力的脑皮层脂质过氧化水平(TBARS)升高，但低于H₂O₂,(图1(一))。海马组织中tbar水平也随着H的增加而增加₂O₂这种增加在所有巧克力治疗中都被阻止了()。然而，在海马体中，当tbar被评估时，巧克力、牛奶和大豆都能增加与H₂O₂添加(图1 (b))。最后，在小脑，该参数无统计学差异(图)1 (c))。

对于蛋白质氧化水平，我们观察到H₂O₂在大脑皮质中是不能够诱导氧化损伤（图2(一个))。然而，在海马体中，H₂O₂但是牛奶、大豆和黑巧克力可以防止这种损伤2 (b))。在小脑,H₂O₂与对照组相比，能够引起羰基含量的增加。牛奶、大豆和黑巧克力本身并没有增加这个参数水平。然而，含H₂O₂不能防止组织中蛋白质的氧化损伤(图2 (c))。

在巯基测定(SH组)中，在大脑皮层中，我们观察到只有在黑巧克力加入H₂O₂()，其他治疗无明显变化(图)3(一个))。在海马体中，只添加黑巧克力的组织中巯基的含量增加了。当H₂O₂随着巧克力加入到组织中，这些水平下降了(图3 (b))。然而，在小脑中，只吃大豆和半甜巧克力的小组能够增加巯基的含量3 (c))。

SOD酶活性如图所示4。我们观察到了H的加法₂O₂大脑皮层的SOD活性降低了这种降低在所有巧克力中都保持了除了大豆巧克力我们证明了这种酶的上升，与对照组相当。在添加不同巧克力的组织处理中也观察到SOD的减少(图)4(一))。海马组织中，大豆巧克力沿组织放置时，SOD活性增加;在暴露于H的组织中，深色和半甜巧克力的存在也观察到这种增加₂O₂(图4 (b))。观察小脑，大豆和半甜巧克力处理组SOD活性增加;在吃半甜巧克力、黑巧克力和H₂O₂(图4 (c))。

4。讨论

巧克力是一种富含大量酚类化合物的产品，其价值高于红酒中的多酚。8]。作为巧克力中多酚含量的主要影响因素，可引用其在可可液中的含量[16在我们研究中分析的样本中黑巧克力含有67%的可可液成分，半甜巧克力的可可液含量比牛奶和大豆巧克力高出43%。这些数据证实了Miller等人的研究[5不同的巧克力样品在美国商业化，那里的黑巧克力多酚含量也较高。地理来源、植物品种、气候、土壤类型、种植区域等因素影响可可多酚含量[22]。将可可转化为巧克力的各种加工步骤也会改变最终产品的酚含量[22]。

酚类化合物由于其公认的抗氧化能力而获得关注，通过抑制ROS和金属络合等机制延缓氧化速率[23]。某种化合物的抗氧化活性通过电子供体的氢的反应性和能力来测量位移或稳定的未成对电子[24]。在我们的研究中，巧克力的抗氧化活性是通过DPPH IC表达的₅₀其中，黑巧克力具有最高的抗氧化活性，其次是半甜巧克力、大豆巧克力和牛奶巧克力。Hermann等人的研究证实了黑巧克力的高抗氧化活性。25在年轻吸烟者中，黑巧克力的摄入增加了血浆抗氧化能力，同时改善了血管舒张，这证实了巧克力类黄酮在减少ROS方面的作用。

此外，我们的研究表明，与半甜巧克力相比，大豆巧克力的总多酚含量更低;然而，两者获得了相同的抗氧化活性。大豆制品中含有重要的异黄酮(染料木素和大豆苷元);它们具有很高的抗氧化能力，只需少量就能产生良好的抗氧化潜能[26]。

此外，文献研究将不同产品的抗氧化活性归因于其酚成分[27,28]。这一事实在我们的研究中也被观察到，总多酚的数量和DPPH IC之间呈负相关₅₀观察到，由于酚含量越高，DPPH IC₅₀也就是说，抗氧化活性越高。黑巧克力的总多酚含量最高，DPPH IC最低₅₀(表1)，意味着需要更小的样本量来扫描50%的比其他类型巧克力的含量要高。在测试的巧克力种类中，牛奶巧克力的抗氧化活性较低，这是可以解释的，因为这种巧克力在制作过程中含有更多的糖。Franke等人的研究证实了糖对抗氧化活性的负面影响[29高糖橙汁清除超氧阴离子的能力降低，脂质过氧化也降低。

在我们研究的几乎所有分析中，H的加入₂O₂对组织诱导的氧化损伤，如TBARS和羰基所示。这是因为尽管H₂O₂它不是自由基，而是氧的代谢物具有极强的毒性寿命长，能穿过脂质层它能与膜和蛋白质发生反应，主要是与铁⁺⁺，引致重大损害[30.]。由于对巧克力的不同处理可以逆转这种损害，我们研究中显示的保护证实了Fraga等人的发现。31结果证明，连续14天摄入105克牛奶巧克力的年轻足球运动员氧化应激标志物有所降低。

本研究证实了巧克力对SOD酶活性的调节作用。结果发现，随着H的加入，活性降低₂O₂，这是因为这种化合物增加了氧化应激;SOD的减少是由于其产物H的不可逆失活₂O₂(32]。然而，巧克力并不能逆转H的减少₂O₂在大脑皮层。关于在处理大豆巧克力和H在SOD酶活性的提高₂O₂在同一组织中，这可能是由于异黄酮在这种类型的巧克力中显著存在。这种酶活性的增加可能是由这些化合物的存在引起的，这在Leng等人的一项研究中得到了验证[。33，异黄酮增加了患有非酒精性脂肪性肝炎的大鼠肝脏的抗氧化活性。SOD活性也随着H的加入而降低₂O₂在海马体和小脑，我们观察到主要是深色和半甜巧克力能够防止损伤诱导剂造成的减少。

5.结论

在这项研究中获得的数据显示，在分析的巧克力中，总多酚的显著浓度和重要的抗氧化活性。这些结果是相关的，因为巧克力是世界人口日常饮食中常见的食物，因为它的美味。然而，我们还需要更多关于不同巧克力的研究，以及对不同组织的评估来证实我们的发现。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者感谢来自中央Metodista大学、国际摄影学会和上级Nivel de Aperfeicoamento de Pessoal (CAPES)的支持。

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