净化、特征和作用方式的Pentocin JL-1,小说细菌素分离乳酸菌pentosus对耐药金黄色葡萄球菌

文摘

金黄色葡萄球菌及其耐药菌株,威胁公众健康和食品安全,需要通过biopreservatives有效控制。一个新颖的细菌素,pentocin JL-1,所产生的乳酸菌pentosus这是孤立的肠道Chiloscyllium punctatum被四步色谱纯化过程。质谱分析基于MALDI-TOF表明pentocin JL-1 2987.23 Da的分子质量。只有六的25个氨基酸可能被埃德曼降解。这种细菌素是耐热性的和容忍pH值范围的5 - 7。对蛋白酶K,这也被认为是敏感,胰蛋白酶、胃蛋白酶和碱性蛋白酶。这种细菌素具有广泛抑制频谱对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株,特别是对耐多药是有效的金黄色葡萄球菌。此外,我们表明,细胞膜的目标是pentocin JL-1对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),导致质子动力的丧失。此外,pentocin JL-1有激烈的对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细胞的结构和完整性的影响。这些结果表明,pentocin JL-1有潜力作为biopreservative食品行业。

1。介绍

金黄色葡萄球菌属于革兰氏阳性微球菌科家族,是全球最严重的细菌性病原体之一(1]。它可以产生一些毒素包括葡萄球菌肠毒素,这几种疾病的一个主要原因,尤其是食源性疾病造成的消费各种各样的受污染的食物,如肉类、乳制品、烘焙食品,和沙拉1- - - - - -3]。1961年,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中首次发现金黄色葡萄球菌临床分离株4),发病率和死亡率的风险增加。此外,首选处理剂对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,万古霉素,据报道,降低疗效[5]。此外,许多其他类型的耐多药金黄色葡萄球菌已发现在过去的几年中6- - - - - -8]。耐药金黄色葡萄球菌菌株是人类潜在风险可以转移抵抗其他致病菌的人类通过食物链,细菌的基因池,噬菌体或DNA片段(9,10]。因此迫切需要发现新颖有效的biopreservatives和抗菌药物来抑制金黄色葡萄球菌及其耐药菌株食物保藏或细菌性传染病预防和控制(10]。

细菌素原核的蛋白质或多肽,具有活性抑制对其他原核生物10,11]。特别是乳酸菌产生的细菌素(实验室)许多研究的焦点,因为实验室及其代谢产品通常被认为是安全的(肝)12)和潜在的应用程序作为天然防腐剂在食品行业13]。目前,革兰氏阳性菌株产生的细菌素分为五组(14]:课上我,小(< 5 kDa)和线性肽氨基酸包含转译后的修改,包括那些与硫醇硫醚桥之间形成组和半胱氨酸残基β其他氨基酸残基的碳;II级,小(< 10 kDa),线性肽氨基酸没有转译后的修改;第三类、蛋白质(> 10 kDa);第四类,小(< 10 kDa),圆形肽没有转译后的修改后的氨基酸和酰胺键之间的N - c终端;类V,小(< 5 kDa),线性或圆形肽包含广泛的转译后的修改与硫醚桥之间形成氨基酸α其他氨基酸残基碳和硫醇的半胱氨酸残基。然而,没有国际标准的分类,和其他计划提出了随着信息关于他们的特点15,16]。

近年来,许多有用的实验室细菌素的识别和研究,比如lactococcin [17),pentocin TV35b [18),amyovorin L471 [19),lacticin问[20.),plantaricin ZJ008 [11],lactocin XN8-A [21]。到目前为止,产生的乳酸链球菌肽Lactococcus lactis,pediocin由片球菌属acidilactici和三个细菌素的结合(carnocyclin a carnobacteriocin BM1和piscicolin 126),所有产生的Carnobacterium maltaromaticumUAL307,一直在美国和加拿大,商业化的名字Micocin®,用作食品防腐剂商业(22,23]。其他有效的实验室细菌素的过程中获得的商业地位用作食品防腐剂(22]。

治疗实验室抑制细菌素是一种有效和安全的方法金黄色葡萄球菌食物的增长。许多研究人员已经表明,实验室细菌素anti-MRSA能力(11,24,25]。然而,只有少数研究已经进行调查实验室对其他耐药细菌素金黄色葡萄球菌如anticiprofloxacin anticefoxitin, antigentamicin [21]。在我们的研究中,我们旨在净化和描述pentocin JL-1,所产生的乳酸菌pentosus孤立的肠道Chiloscyllium punctatum,表现出一种更加广泛的抑制频谱。这种细菌素可以抑制其他耐多药不仅耐甲氧西林金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌菌株。此外,该模式所依赖的行动pentocin JL-1导致细胞膜损伤耐甲氧西林金黄色葡萄球菌为特征。

2。材料和方法

2.1。抗菌药物菌株的分离和鉴定

肠道的c . punctatum(灰色地毯鲨鱼)解剖和均质20毫升无菌条件下生理盐水,然后被镀在deMan系列稀释,Rogosa,夏普(夫人)媒介。板块在30°C耗氧孵化24 h。随机选出的几个殖民地和在汤夫人再次孵化。筛查bacteriocin-producing菌株,agar-well扩散试验用来检测抗菌活性在上层清液游离(0.22过滤μ微孔过滤器)通过离心(10000 ,后30分钟,4°C) 18岁,36岁,60岁,72 h孵化(10]。革兰氏阳性菌株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌GIM 1.771和革兰氏阴性菌株大肠杆菌O157: H7 GIM 1.707菌株作为指标。在实验之前,指标压力增加到10⁶CFU /毫升。然后,1毫升的文化是混合了100毫升软琼脂培养基和倒到单独的培养皿。随后,8毫米直径的井被打到盘子,并且每个充满了100年μ在无菌条件下L的浮在表面的游离。板块是孵化一夜之间在各自的最佳温度,和明确的抑制区直径测量,表明抗菌活性的存在。在我们的研究中,所有的细菌培养基和化学试剂由Sigma-Aldrich(美国)。

最高的菌株对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌活性和GIM 1.771大肠杆菌O157: H7 GIM 1.707被选中,JL-1命名。它是储存在−80°C与25%(汤夫人v / v)甘油。应变JL-1当时被16 s rRNA基因测序与正向引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和反向引物5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。随后,序列同源性分析通过比较序列与NCBI数据库和系统发育分析进行了使用大型5.0。

2.2。细菌素的纯化

应变JL-1生长在培养基夫人在30°C 72 h。发酵是离心机(10000 ,30分钟,4°C),浮在表面的游离与大孔树脂吸收D4020(平均孔隙直径100 - 105,540 - 580的比表面积²/ g,南开大学化学工厂,中国)。列筛选了20% (v / w收集分数)乙醇和活跃。每个分数的抗菌活性是由测量抑菌圈的直径在井相比乳酸链球菌肽和表达为国际单位(IU)每毫升(11]。活跃的分数是冻干使用冷冻干燥器中脱(美国Labconco)。冻干粉溶解在20毫米磷酸盐缓冲剂(pH值7.0)在接下来的纯化步骤。阳离子交换色谱法和凝胶过滤进行了使用AKTA纯25(通用电气,乌普萨拉,瑞典)色谱系统配备一个完整的波长紫外检测器和一个自动收集器。样品纯化使用SP-Sepharose快流列(XK 16/40, GE)和洗脱0 - 1 M氯化钠在柠檬过磷酸钙缓冲区(pH值7.0)1.0 mL / min。收集并净化了活跃的分数Ultrahydrogel TM 250凝胶过滤柱(水域,美国),与纯水洗脱后为1.0毫升/分钟。然后,活动部分纯化在C₁₈列(10×250毫米,5μ米)使用LC-6AD半制备高效液相色谱法(HPLC)系统(日本岛津公司、日本)2.5毫升/分钟的梯度洗脱缓冲100%(95%的水、5%的乙腈,0.1%三氟乙酸)缓冲100% B(100%乙腈和0.1%三氟乙酸)。活跃的分数是收集和repurified使用分析C₁₈列(150×4.6毫米,5μ米)与40%乙腈洗脱。活跃的分数被收集和冻干质谱(MS)检测。纯化pentocin JL-1冻干使用一个冷冻干燥器中脱(美国Labconco)。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌GIM 1.77作为活动的指标压力测试。

2.3。质谱分析和氨基酸序列

纯化的分子质量pentocin JL-1被MALDI-TOF-MS检测(日本岛津公司Axima保证,日本),由GL分析生物化学(上海,中国)。纯化的n端氨基酸序列pentocin JL-1被PPSQ33A自动测序系统检测到(日本岛津公司、日本),由上海Sangon生物科技公司,分析了中国。

2.4。细菌素活性测定

先前描述的agar-well扩散试验用于检测抗菌活性的纯化pentocin JL-1 (15μg / mL, pH值5.5)(10]。菌株在表中列出的指标1和2。实验室菌株生长在汤夫人在30°C 16 h。其他菌株革兰氏阳性指标大豆胰蛋白胨培养基中生长(TSB)介质在37°C和革兰氏阴性菌株指标是生长在Luria-Bertani肉汤培养基在37°C。

此外,最低抑制浓度(MIC)的pentocin JL-1对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌GIM 1.771进行了测试。一夜之间文化的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌GIM 1.771的浓度在2×10⁶CFU /收集和50毫升μL的生长96年well-microtiter板块(美国Bio-Rad)与不同浓度的pentocin JL-1,从50 ng / mL到15μ在37°C g / mL, 24 h。每个浓度做了一式三份。麦克风代表100%的增长被抑制的细菌素浓度的吸光度在540纳米22]。

2.5。稳定性对pH值、温度和酶

pH值来确定稳定、冻干纯化pentocin JL-1溶解在0.05% (w / v15)醋酸μg / mL,调整为1.0 M盐酸或氢氧化钠1.0不同的pH值为2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0和10.0。然后在37°C以上样本孵化1 h和调整pH值5.5和1.0 M盐酸或1.0 M氢氧化钠。

确定热灵敏度,冻干纯化pentocin JL-1溶解在0.05% (w / v15)醋酸μg / mL是评估在不同的温度下(−20°C, 4°C, 30°C, 60°C,和100°C)的1 h和热压处理过的条件(121°C在15 psi 15分钟)。

确定酶的敏感性,冻干纯化pentocin JL-1溶解在0.05% (w / v15)醋酸μ克/毫升于75年以下酶治疗μg / mL下各自的最佳pH值和温度:蛋白酶K (pH值7.5,37°C),胰蛋白酶(pH值8.0,37°C),胃蛋白酶(pH值2.0,37°C)和碱性蛋白酶(pH值8.6,50°C)(美国从Sigma-Aldrich)。孵化后1 h, bacteriocin-enzyme混合物煮沸5分钟灭活酶。

上面的残留抗菌活性的样本计算使用agar-well扩散试验和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌GIM应变1.771作为指标。抑制的面积计算从抑制区域的直径,减少比率显示为一个百分比。冻干pentocin JL-1溶解在0.05% (w / v15)醋酸μ与pH值5.5 g / mL被用作控制在所有化验。

2.6。作用方式

2.6.1。生长曲线和消磨时间的动力学

的抑菌或杀菌作用方式pentocin JL-1测试如前所述通过与一些修改(朱等人11]。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌GIM 1.771培养100毫升的对数生长期TSB培养基。冻干纯净pentocin JL-1溶解在0.05% (w / v)醋酸添加到文化的最终浓度1 x麦克风,同样体积的0.05% (w / v)醋酸添加到上述媒体作为一个控制。样本孵化在37°C和细菌悬浮液被每小时24 h,在OD和吸光度测定_600年。此外,TSB琼脂培养基上的活细胞计数增加1 x麦克风后,2 x麦克风,3 x麦克风pentocin JL-1也量化每10分钟1 h。

2.6.2。质子动力(及)

测试的效果pentocin JL-1膜完整性、细胞及化验。及包括跨膜电势pH值和跨膜梯度(ΔpH) [26]。由荧光探针监测3 3′-diethylthiadicarbocyanine碘盘吗₂(5)(σ,美国)。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌GIM 1.771细胞生长的对数期50毫升TSB培养基,收获,洗两次50毫升缓冲MgSO(250毫米葡萄糖,5毫米₄10毫米K₃阿宝₄100毫米氯化钾,pH值7.0)在4°C, resuspended 5毫升的相同的缓冲和存储在冰的荧光测量。然后,细胞被添加到荧光试管一起0.5μ米盘₂(5),在室温下的荧光发射监测使用f - 4600荧光谱仪(日立、日本)的激发波长647 nm(特异)和发射波长(Em) 400年代的680海里。减少荧光稳定时,最终的浓度1 x, 2 x,和3 x麦克风pentocin JL-1被添加到试管,分别和0.05% (w / v)醋酸添加作为一个消极的控制。膜电位的全部耗散表示了特里同x - 100年增加1%。控制,3 x的体积相同的麦克风pentocin JL-1是补充道。

ΔpH被荧光pH监测探针2′,7′双- (2-carboxyethyl) 5 (6) -carboxyfluorescein acetoxymethyl酯(BCECF点)(Beyotime,中国)。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌GIM 1.771细胞生长的对数期50毫升TSB培养基,收获,洗两次用50毫升5毫米消息灵通的缓冲区在4°C,并在5毫升resuspended相同的缓冲对孵化冰1 h。随后,1μM BCECF是pH值探测器补充说,解决方案是在37°C孵化1 h在黑暗中。1毫升的孵化的解决方案是添加到荧光试管一起最终浓度1 x 2 x,和3 x麦克风pentocin JL-1,分别。醋酸(0.05%,w / v)被用作消极控制和1% (w / v)特里同x - 100作为一个积极的控制。控制,3 x的体积相同的麦克风pentocin JL-1是补充道。荧光强度监测在50年代间隔为400年代后立即混合前488 nm和Em 535海里使用f - 4600荧光谱仪(日立、日本)。

2.6.3。扫描电子显微镜(SEM)

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌GIM 1.771在对数生长期细胞补充1 x的麦克风pentocin JL-1和孵化37°C 10分钟。细胞没有pentocin JL-1被用作控制。离心收集的细胞在4°C, 6000与500年5分钟,轻轻洗μL磷酸缓冲盐(PBS, 0.1米,pH值7.4)两次。随后,这些细胞被固定在2.5%戊二醛在4°C与500年16 h和轻轻洗μL PBS两次。然后细胞与梯度乙醇脱水的解决方案(30%,50%,70%,80%,90%,和100%)在4°C和离心机,享年6000岁15分钟。然后细胞冷冻干燥使用冷冻干燥器中脱(美国Labconco),涂上一层黄金机会,使用SU8010成像扫描电子显微镜(日立、日本)。

2.7。统计分析

所有相关的实验都是一式三份和结果表示为平均值±标准偏差。数据分析与SPSS 19.0和8.0的起源。比较数据的稳定性pentocin JL-1对pH值、温度、和酶进行使用独立的样本以及和 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果与讨论

3.1。Bacteriocin-Producing应变JL-1的识别

选择压力JL-1 72 h孵化,因为其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌活性最高GIM 1.771和大肠杆菌O157: H7 GIM 1.707直径的抑制区 毫米, 分别为毫米。这是一种革兰氏阳性和catalase-negative芽孢杆菌。16 s rRNA基因序列被PCR放大,和一个1485个基点基因片段克隆后测序,使用NCBI数据库一致。我们发现16 s rRNA的应变JL-1序列有99%相似的l . pentosusKC422317.1。此外,系统发育树构建使用大型5.0(图1)。16 s rRNA基因的序列从应变JL-1提交到基因库数据库下加入KY777710数量。

据报道,l . pentosus,一个乳酸菌物种通常独立于发酵和腌制的食物和动物内脏,可以产生许多功能代谢产物,如胞外(27),β牛乳糖(28),和一些细菌素(29日- - - - - -31日]。l . pentosus是实验室,因此其代谢产品肝和有潜力作为天然防腐剂12,32]。

3.2。细菌素的纯化

细菌素,pentocin JL-1,次生代谢产物之一l . pentosusJL-1 72 h后孵化。为了净化这个细菌素、大孔树脂、阳离子交换、凝胶过滤,和半制备高效液相色谱法。在净化过程中,对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌活性GIM 1.771评估。原油的细菌素是使用大孔树脂收集D4020然后被SP-Sepharose快流净化。三个分数F1, F2, F3收集,一部分F3有抗菌活性对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌GIM(参见图1.771 S1在网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/7657190),与一个特定的活动达到432 IU /毫克(表3)。活跃的分数F3随后纯化Ultrahydrogel TM 250凝胶过滤色谱法(图S2)。在这一步中,三个分数F3A F3B,收集F3C世锦赛和他们的抗菌活性进行了测试。的抗菌活性最高分数F3A收集通过半制备高效液相色谱法进一步纯化,如图2。F3Aa比例明显高于对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌活性比F3Ab GIM 1.771 ( )。F3Aa repurified了分析高效液相色谱法(数据未显示),和活跃的分数是收集和冻干女士检测。表列出了净化过程和抗菌活性3。“四段式”净化后,pentocin JL-1纯化70.7倍的收益率为4.7%。在以前的研究中,pentocin sj - 65产生的l . pentosusSJ65纯化52-fold在收益率为8% (33),细菌素KU24所产生的l . lactisKU24是纯净的24.58倍(25],plantaricin ZJ5所产生的l .杆菌ZJ5纯化是139.5倍的收益率1.7%13]。

的收益率pentocin JL-1可以增强通过优化生产条件。除了孵化温度、初始pH值,接种体密度、装载体积,和培养基优化,与其他菌株和autoinduction coculture应变产生的信号肽本身提高细菌素产量的有效方法。例如,在低细胞密度,gassericin E是由l . gasseriEV146加法后上层清液从先前bacteriocin-producing EV1461文化(autoinduction)或通过与其他共培养革兰氏阳性菌株(诱导细菌)34]。此外,基因工程策略提高细菌素的生产。近年来,l .杆菌,l . lactis,l . sakei酸奶,和各种其他实验室用作不同的表达式(主机32,35,36]。

此外,从净化过程中,我们观察到pentocin JL-1阳离子和疏水肽,由阳离子交换显示,hydrophobic-interactions和C₁₈反相高效液相色谱法(C₁₈rp)。许多细菌素如细菌素KU24 [25),细菌素VJ13 [37),plantaricin ZJ5 [13),和其他实验室细菌素相似的属性。因此,净化策略可以比较和参考。

3.3。质谱分析和氨基酸序列

Pentocin JL-1通过MALDI-TOF-MS被发现。结果表明,纯化pentocin JL-1的分子质量为2987.23 Da(图3),这是不同于产生的细菌素l . pentosus此前报道,包括细菌素l . pentosus大约20 kDa RL2e [29日),细菌素B231所产生的l . pentosus大约5 kDa的30.),pentocin C50-6of约2.5 kDa [31日5592年,pentocin还有.225 Da (38]。此外,各种新的细菌素产生的实验室已成功纯化,在过去的几年里。大多数的分子质量plantaricins > 3.0 kDa,虽然有些小plantaricins也被报道,如plantaricin DL3 (2.1 kDa) (39)和ZJ008 (1334.77 Da) (11]。然而,我们所知,目前的研究是第一个报道的pentocin 2987.23 Da的分子质量。此外,25个氨基酸的六pentocin JL-1可能被VAKVAR埃德曼降解和序列。进一步测序失败可能由于修改后的残留物的存在或一些稀有氨基酸的肽预防埃德曼试剂的乳沟。与其他已知的细菌素无同源序列对基因库数据库(使用蛋白质爆炸https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。因此,pentocin JL-1实验室细菌素可能是一个小说。获得更详细的信息,进一步化学和质谱技术需要被执行。此外,我们的完整的基因组测序l . pentosus将获得的见解进行遗传元素参与细菌素产量在未来。

3.4。稳定性对pH值、温度和酶

pH值的影响,温度,和酶在细菌素的抗菌活性测定(表4)。没有明显的抗菌活性的差异被发现从酸碱5到7 ( )。然而,抗菌活性显著降低,当pH值从4减少到2和从8到10(增加 )。其他一些细菌素也被报道有类似的pH值稳定(21,40]。也许,在极端的pH值,强烈的分子内的静电相互作用导致部分或全部损失的活动(41]。然而,即使在酸碱2和图10,pentocin JL-1仍保留65.69%和52.30%的抗菌活性,分别,这表明该细菌素可用于大多数的食物。

在不同的温度下,pentocin JL-1稳定,未发现显著差异从−20°C到100°C ( )。84.10%的抗菌活性保持即使autoclavation (121°C, 15分钟)。这种耐热性的特点使得pentocin JL-1适用于灭菌过程。

当纯化pentocin JL-1对待不同水解酶,其抑制作用显著降低了治疗与蛋白酶K和胰蛋白酶( )。然而,抑制性行为完全被治疗胃蛋白酶和碱性蛋白酶。因此,pentocin JL-1有蛋白质的性质与其他大多数细菌素(11,13,19,21]。

3.5。抑制频谱

的抑制频谱pentocin JL-1表所示1和2。如表所示1,pentocin JL-1是抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。在指示物种,对革兰氏阳性细菌的细菌素显示最高的活动l .干酪乳杆菌写明ATCC 393和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌GIM 1.771和革兰氏阴性细菌痢疾CGMCC 1.1869和大肠杆菌O157: H7 GIM 1.707,抑制区20 - 25毫米直径。此外,它抑制枯草芽孢杆菌CGMCC 1.1627,粪肠球菌写明ATCC 51575,单核细胞增多性李斯特氏菌写明ATCC 19112,微球菌危害CGMCC 1.2299,铜绿假单胞菌CGMCC 1.1785。然而,pentocin JL-1没有抑制活性l .嗜酸的写明ATCC 314和弧菌parahaemolyticusGIM 1.306。许多pentocins产生l . pentosus研究了对各种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌和真菌吗白色念珠菌(18,29日- - - - - -31日]。然而,没有一个已报告有一个anti-MRSA活动,除了pentocin JL-1在我们的研究中。

特别是,除了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌GIM 1.771, pentocin JL-1也可以抑制6耐多药菌株金黄色葡萄球菌孤立的猪肉在我们实验室(表2)。不仅可以耐多药金黄色葡萄球菌产生毒素,而且人类抵抗其他致病菌的转移是一个潜在的威胁(42]。此外,麦克风pentocin JL-1株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对指标GIM 1.771是7.5μ克/毫升。据报道,plantaricin Pln-1抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的麦克风 μ克/毫升(43]。的麦克风lactocin XN8-A反对金黄色葡萄球菌写明ATCC 29213是6.85μ克/毫升,但这不是一个耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株(21]。Lactocin XN8-A也对pork-derived耐多药抗菌活性金黄色葡萄球菌,但是这个研究没有显示数据(麦克风21]。在我们的研究中,pentocin JL-1表现出广泛的抑制,低麦克风对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌与耐多药和高抗菌活性金黄色葡萄球菌在食品行业,代表一个潜在biopreservative。因此,需要进一步的研究来确定其作用方式。

3.6。模式的作用Pentocin JL-1

3.6.1。生长曲线和消磨时间的动力学

图4(一)表明,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长曲线GIM 1.771 24 h是典型的。然而,一旦1 x的麦克风pentocin JL-1补充道,后6 h(对数生长期),OD_600年值几乎是稳定的。这意味着pentocin JL-1抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长GIM 1.771没有明确的细胞溶菌作用的证据。然而,消磨时间的曲线表明,当1 x麦克风,2 x麦克风,和3 x麦克风pentocin JL-1补充道,分别显著下行趋势观察活细胞数,并在一定程度上存在剂量依赖的相关性(图4 (b))。此外,瞬间杀死行动发生在0 h 1 x的麦克风,2 x麦克风,和3 x麦克风pentocin JL-1为1.05,2.14和2.21日志₁₀分别减少。这些结果表明,pentocin JL-1杀菌对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌GIM 1.771活动。Lactocin XN8-A [21),enterocin SN11 [44],plantaricin ZJ008 [11)也有报告称,有类似的杀菌性能。

操作。及

尽可能多的细菌素被认为杀死目标微生物通过细胞膜的透化作用[45)的影响pentocin JL-1膜完整性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌GIM 1.771完整细胞是由膜电位敏感染料盘₂(5)(图5pH值)和跨膜梯度荧光探针BCECF(图6)。如图5减少荧光稳定,激发细胞的膜内部的积累染料就熄了。观察一个稳定的信号后,添加pentocin JL-1(第一个箭头在图5)导致荧光快速增长由于离子梯度的崩溃,生成膜电位(46]。荧光稳定后,特里同x - 100 1%(第二个箭头在图所示5)随后补充道,结果显示100%的膜电位的耗散。如图5,添加1% Triton x - 100只引起了一场小进一步增加荧光曲线(b)和(c)和曲线(a)几乎持平,表明pentocin JL-1导致细胞膜透化作用。此外,的能力pentocin JL-1扰乱细胞膜屏障摄入量有关。然而,控制样品的荧光,0.05% (w / v)醋酸补充说,并没有发现任何增加或减少在400年代的实验。

一旦吸收细胞膜BCECF点,它是由酯酶裂解成BCECF,是一个表明跨膜的荧光探针pH梯度。如图6,当样本1 x麦克风,2 x麦克风,和3 x麦克风pentocin JL-1, BCECF荧光的增加在100年代增加了些许在稍后的时间点,表明ΔpH 1.771耐甲氧西林金黄色葡萄球菌GIM迅速消散了pentocin JL-1。ΔpH稳定在400年代后控制样本孵化。然而,最后1 x荧光的麦克风和2 x麦克风对样本低于样品暴露于1% Triton x - 100。这些结果表明,ΔpH由1 x麦克风不完全消散,2 x的麦克风pentocin JL-1。

一般来说,阳离子细菌素最初与阴离子细胞膜通过静电吸引47]。然后,细菌素permeabilize细胞膜消散ΔΨΔpH,构成及细胞(48]。最后,细菌素抑菌或杀菌作用。在我们的研究中,pentocin JL-1消散ΔΨ和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ΔpH GIM 1.771。这个结果表明,添加pentocin JL-1导致的损耗及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌GIM 1.771由于失去至关重要的离子梯度和表明,膜的目标是pentocin JL-1。此外,耗散及巧克力摄入量有关。类似细胞膜电位耗散的结果也被证明存在剂量依赖的相关性等其他细菌素aureocin A53 [49]和Pln EF [26]。

ΔΨ和ΔpH量值在100年代几乎是完整的,这表明,膜透化作用引起的pentocin JL-1是一个相对快速的过程。这是根据著名的抗生素肽clavanin [46),这是一个membrane-targeted和肽存在剂量依赖的相关性。然而其他一些membrane-targeted细菌素一个循序渐进的过程的膜电位耗散(26,50]。

3.6.3。扫描电镜

SEM是用来进一步说明膜损伤引起的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌GIM 1.771 pentocin JL-1。形态变化的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌GIM 1.771 10分钟后暴露于1 x麦克风pentocin JL-1呈现在图7。相比之下,集成和控制细胞的表面光滑丰满细胞结构(图7(一)),细胞膜破坏和变形萎缩和蛀牙观察细胞在细胞表面处理pentocin JL-1(数字7 (b)和7 (c))。此外,气泡(箭头表示在图7 (b))伸入细胞表面,这也表明pentocin JL-1作用于细胞表面。疱疹是一种囊泡,由外部刺激和诱导可能扮演重要的角色在细胞间的沟通26]。细胞膜损害很明显在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌GIM 1.771处理pentocin JL-1和是一个典型的特征引起的细菌素(26]。乳酸链球菌肽也报告了类似的膜损伤,pediocin, Pln EF-treated细胞(26,51,52]。

4所示。结论

在目前的研究中,细菌素pentocin JL-1,所产生的l . pentosus孤立的肠道c . punctatum纯化,发现2987.23 Da的分子质量。是敏感的蛋白酶K,胰蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶,表明它有一个蛋白质的性质。这种细菌素具有广泛抑制频谱,是耐热性的,稳定的5 - 7在pH值范围内。因此,pentocin JL-1似乎有前途的潜在biopreservative在食品行业,尤其是对控制耐多药金黄色葡萄球菌。此外,我们的研究结果表明,细胞膜的目标pentocin JL-1对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌GIM 1.771,造成的损失及只有几分钟,和它有一个激烈的影响的结构和完整性MRSA GIM 1.771细胞,最终导致细胞死亡,这是消磨时间和生长曲线动力学所示。在进一步的研究中,更多详细信息行动的模式,精确的氨基酸序列和结构pentocin JL-1将得到解决。

信息披露

这篇文章不包含任何与人类参与者或动物研究由作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这个项目是由浙江省自然科学基金支持的项目中国没有。LQ18C200004也没有。LQ17C200002),浙江省公益性技术应用研究计划,中国(没有。2016 c37083也没有。2016 c32064),中国国家自然科学基金(没有。31601464)。

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