文摘

有机锗(IV)抗肿瘤化合物- [2,6-difluoro -N-(羟基- <κ>O)benzamidato - <κ>O](DBDF2 6 t)是一个小说的专利有机锡化合物抗肿瘤活性高、毒性相对较低。在这项研究中,几种方法被用来研究DBDF2之间的交互,t和hPPAR 6γ蛋白质,包括荧光猝灭,三维(3 d)荧光,药物亲和反应目标稳定(飞镖)ultrafiltration-LC,分子对接。根据实验结果,hPPAR的淬火工艺γ蛋白质是由静态猝灭方式形成一个非辐射的极化子与DBDF2复杂,6 t自发,主要通过疏水的力量。DBDF2 6 t可以绑定到hPPARγ蛋白质直接给antienzymatic水解的能力。的绑定模式DBDF2 6 t hPPARγ蛋白质似乎有一个面向残留SER342 GLY284。总之,这些方法可以全面揭示DBDF2的交互细节,6 t和hPPARγ蛋白质和初步建立了一个可行的方法识别受体激动剂hPPAR化合物γ蛋白质。

1。介绍

有机锡化合物在我们的生活中有很多用途,可以作为稳定剂在塑料,杀真菌剂,工业催化剂,等等。(1]。我们的研究小组合成一系列有机锡化合物专利,拥有高抗癌活性较低的毒性和致力于澄清其作用机理(2]。从蛋白质组学数据的结果,这些化合物可能通过PPAR发挥生理作用(过氧物酶体proliferator-activated受体)信号通路,这是符合报告,有机锡化合物可以通过影响函数作为环境激素PPAR的蛋白质的功能γ(3]。因此,一个合理的假设是假定这些生物活性化合物可能通过PPAR函数信号通路作为蛋白质PPAR激动剂γ并进一步影响靶基因的表达。

PPARs蛋白质属于最重要的核受体超家族的成员和可以作为配体依赖性转录因子的4]。当PPARs蛋白质绑定到一个特定的配体,配体结合域PPARs会遇到的构象变化之后通过促进核受体coregulators如类固醇的招聘校长coactivator-1 (SRC-1)和最终影响下游靶基因的转录5]。PPARs蛋白有三个被确定为PPAR同形像α,PPARβ/δ,PPARγ。这三个子类型表现出不同的组织分布和具有独特的生物功能6,7]。特别是,PPARγ已收到多关注这些年来为其配体中发挥的重要生理功能。例如,thiazolidinediones噻唑烷二酮类),PPAR的类γ受体激动剂化合物,被用作治疗性化合物2型糖尿病和肥胖等代谢紊乱(8),它还报道,PPAR的受体激动剂γ蛋白质有可能作为一种新的治疗癌症的方法,免疫疾病,等等。(9,10]。因此,建立的实验发现配体可能与PPAR交互γ蛋白质是有前途的工作。

在这项研究中,一个专利有机锡化合物DBDF2, 6 t (bis - [2, 6-difluoro -N-(羟基- <κ>O)benzamidato - <κ>O]dibutylitin)(专利号:CN200910074795。X和ZL01135148.9 (P))显示高抗癌活性被认为是一个潜在的兴奋剂。采用几种不同的方法来验证DBDF2之间的交互,6 t和hPPARγ蛋白质。光谱研究中,使用最广泛的方法之一,分析小分子和蛋白质之间的相互作用,应用等提供参数绑定常量和类型的交互。飞镖和ultrafiltration-LC用于验证这些交互而分子对接被用来评估亲和力受体和配体之间的理论。这些方法满足低成本和高需求的可行性和完美的相互补充和验证,可用于发现新的hPPAR受体激动剂γ蛋白质初步和提供参考合成化合物和蛋白质之间的相互作用分析。的结构DBDF2 6 t和hPPARγ蛋白质在图所示1。

(一)
(一)
(b)
(b)
图1
t和hPPAR DBDF2结构6γ蛋白质:(a) 2 d DBDF2结构,6 t和(b) PPAR的3 d结构γ(4 a4w.pdb)。

2。材料和方法

2.1。试剂

DBDF2 6 t被山西医科大学与合成纯度超过99%。人类蛋白质的PPARγ(hPPARγ)从Flarebio购买公司(Flarebio生物科技有限责任公司,武汉,中国),储存在−20°C。链霉蛋白酶购买从罗氏诊断GmbH德国曼海姆和储存在4°C。Coomassie蓝色r - 250从σ公司(上海,中国),购买和PageRuler Prestained蛋白质梯子是由热费希尔科学(麻萨诸塞州,美国)。有机锡的溶剂(IV)配置了丙二醇(天津Fengchuan化学试剂科技有限公司、天津,中国),乙二胺,生理盐水(石家庄,石家庄制药,中国)(90:9:1,v / v / v)。磷酸氢二钠的氯化亚锡是购自天津Fengchuan(天津)化学试剂公司。磷酸氢钾是购自天津北辰方正公司(天津)。

本研究中使用的所有其他试剂均为分析纯,且取得了商业上的成功。

2.2。荧光猝灭光谱

氨基酸残基(如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸能使蛋白质产生内源性荧光的能力。这三个氨基酸的荧光峰位于348 nm、303 nm和282 nm,分别。实际上,95%的蛋白质荧光是导致色氨酸残基(11,12]。与其他方法相比,荧光光谱有许多优越的优势包括高灵敏度、选择性、和操作简单13]。因此,在本文中,荧光猝灭法分析DBDF2之间的交互,6 t和hPPARγ蛋白质。

实验进行了在293 K和310 K u - 3900 spectrofluorophotometer (BaHens仪器有限公司,中国)。蛋白质hPPARγ(10μg)溶解在一个2毫升PBS缓冲。数浓度DBDF2 6 t (0.5×10−6,1.0×10−6,1.5×10−6,2.5×10−6,3.0×10−6和3.5×10−6mol / L)分别与一定浓度的hPPAR孵化γ蛋白质。样品的蛋白质hPPARγ和hPPARγ-DBDF2 6 t复合物以1厘米2石英试管。激发和发射光谱狭缝宽度设置为10纳米。发射光谱被记录下来,光散射效应从300纳米到450纳米,而激动人心的波长被设置为280海里。

2.3。三维荧光光谱

坐标轴的三维(3 d)荧光光谱激发波长、发射波长和荧光强度。它已经证明了三维荧光光谱是一种有效的分析技术分析蛋白质的构象变化在其溶液状态(14]。和这种方法不仅可以测试分子结构变化多的选择性和灵敏度也显示荧光信息的示例解决方案全面15]。

实验在293 K的温度。蛋白质hPPARγ(10μg)溶解在一个2毫升PBS缓冲和孵化2.0×10−6mol / L DBDF2 6 t两分钟。样本测试在u - 3900 spectrofluorophotometer (BaHens仪器有限公司,中国)的参数设置如下:激发波长从200纳米到300纳米;发射波长从320纳米到450纳米;光谱狭缝宽度10海里;和增益值是2。

2.4。与纯hPPAR飞镖γ蛋白质

飞镖已经被证明是一种有效的方法来有效地验证药物相互作用蛋白质时可用在相对纯粹的形式(16]。飞镖是化合物的基本原理,提出了稳定结合蛋白质全球或本地通过减少蛋白酶敏感的靶蛋白。这种现象是由于特定的构象变化造成的这样一个绑定过程中,这将进一步促使蛋白质的蛋白酶识别位点被掩盖了17]。在这项研究中,蛋白质hPPARγ和纯hPPAR视为目标蛋白质γ蛋白质产生的重组质粒被用于实验。是否存在DBDF2 6 t可以减少蛋白质的蛋白水解作用来验证hPPAR蛋白质之间的相互作用γ和DBDF2 6 t应该观察孵化hPPAR之后γ蛋白质与DBDF2 6 t。

八个样本组设置分为空白组、阴性对照组,和测试组;每个样本包含0.5μg hPPARγ蛋白质。除空白组外,其他样本孵化与2μL DMSO溶液或2μL DBDF2 6 t浓度从1.0×10−21.0×10 mol / L−4摩尔在4°C / L 60分钟,然后用链霉蛋白酶消化(1:100)在室温下30分钟。消化了通过添加5×sds - page示例加载缓冲区和立即煮10分钟的100°C。然后再对样本8% sds - page电泳。经过电泳,凝胶与考马斯亮蓝染色后观察1 h和筛选了一夜。

2.5。Ultrafiltration-Liquid色谱实验

Ultrafiltration-liquid色谱法(ultrafiltration-LC)开发验证蛋白质hPPAR受体激动剂γ。ultrafiltration-LC的主要原则是,hPPAR的受体激动剂γ有能力结合蛋白质和不会通过超滤离心管的膜过滤掉,而在有机溶剂溶解的蛋白质变性后,这些化合物将被释放的蛋白质,可能被淘汰的膜超滤离心管。基于紫外吸收的化合物,DBDF2, 6 t hPPAR束缚γ可以发现通过分析液相色谱的清洗解决方案。这种方法最初是用于验证实验和它的简单性,通用性和适用性18]。

重组蛋白hPPARγ(20μg)与复合DBDF2孵化,6 t (2μL·10−3mol / L) 24小时在4°C。透过10000 Da分子量截止后超滤膜(微孔,UFC500396)离心在13000 r / min 8分钟4°C,样例与150洗了三次μL PBS缓冲(pH值7.4)和离心机在13000 r / min 12分钟4°C的黏结化合物。清洗解决方案被转移到一个新的10000 Da分子量截止超滤离心管,将其溶解于400年μL甲醇。离心执行在13000 r / min 12分钟洗出的化合物与蛋白质相结合,收集和清洗解决方案。100年调整后μL 50%甲醇水溶液,使用高效液相色谱法分析了复合(安捷伦科技)。变性蛋白作为消极的控制,在这个实验中,蛋白质在98°C加热15分钟,使其变性。

进行高效液相色谱分析用流动相甲醇/ 0.5%磷酸(28:72 v / v, pH值3.0)C18柱(安捷伦TC-C18, 4.6×250毫米身份证。,5μ米)0.8毫升/分钟的流量和25°C。检测波长被设定为264海里。

2.6。分子对接

Surflex-Dock,对接模块在软件SYBYL (UCSF),执行决定蛋白质hPPAR的绑定模型γ(4 a4w.pdb)和DBDF2 6 t。它使用原型分子(protomal)代表蛋白质绑定的口袋里,利用探针测试蛋白质口袋的品质如表面疏水性和能产生积极的反变换蛋白质的口袋里。这种方法对接精度高,可用于研究《生物高分子之间的相互作用和小分子配体(19]。

Sybly×2.0 DBDF2被用来绘制二维结构,6 t标准债券和角度。在优化的过程中复合结构,减少细节和参数修改的设置如下。减少细节:迭代被设置为10000,颜色的选择是设置为力量。修改的参数:力场是像Gasteiger-Marsili荣誉学位和指控。在对接过程中,A / YFB99被选为提取的配体结构和氢分子被添加到蛋白质,和修改细节如下:力场是AMBER7 FF99,电荷是琥珀。所有其他参数使用默认值的SYBYL蛋白质口袋里生成和分子对接。

3所示。结果和讨论

3.1。荧光光谱的蛋白质hPPARγ和hPPARγ-DBDF2 6 t复合物

荧光蛋白hPPAR的曲线γ和hPPARγ-DBDF2 6 t复合物在图所示2。实验进行了两个温度与其他实验条件不变。它可以看到从图2,在273 K和310 K的实验系统,hPPAR的荧光强度γ蛋白质的浓度降低,同时增加DBDF2, 6 t hPPAR孵育γ蛋白质。和最高的hPPAR荧光强度值γ记录理论计算的下一个步骤。

(一)
(一)
(b)
(b)
图2
蛋白质hPPAR荧光猝灭光谱γ系列浓度的DBDF2 6 t在不同的温度下:(a) 293 K和310 K (b)。DBDF2 6 t (→j): 0, 0.5×10−6,1.0×10−6,1.5×10−6,2.5×10−6,3.0×10−6和3.5×10−6mol / L;hPPARγ蛋白质:5μ克/毫升。
3.2。荧光猝灭机理

当pH值、温度和离子强度被保持为常数,荧光猝灭的类型可以分为两类:动态猝灭和静态猝灭(20.]。动态猝灭是由荧光发色团与激发态的饮料,而静态猝灭的原因有三种类型:第一个,荧光发色团与基态的冷却器和形成nonfluorescent化合物;第二个,荧光发色团有一个附近的介质极性变化,导致蛋白质的构象变化将结合冷却器;和第三个,非辐射的能量转移荧光发色团和冷却器之间的(21]。

动态猝灭听从Stern-Volmer方程,公式如下所示: 在哪里 是Stern-Volmer猝灭常数, 双分子的猝灭常数, 分子的平均寿命也一直被认为是1.0×10吗−8年代(22,23]。 是饮料的浓度。 和 相应地代表蛋白质的荧光强度增加的冷却器。

Stern-Volmer淬火曲线是根据获得的数据来自荧光猝灭光谱,和相应的线性回归方程和相关系数如表所示1。

表1
线性回归方程和Stern-Volmer淬火速率常数在不同的温度下。

当一个冷却器与生物大分子相互作用,碰撞扩散速率常数的最大价值被认为是2.0×1010L / mol / s。根据计算结果见表1动态猝灭常数( DBDF2之间),6 t和hPPARγ蛋白质的数量级为1012的最大值,这是比扩散碰撞速率常数。因此,荧光猝灭的hPPAR的类型γ蛋白质由DBDF2 6 t是初步定义为一种静态猝灭24]。在动态猝灭,与扩散有关,荧光材料的猝灭常数随着温度的增加。但从图3,Stern-Volmer线的斜率下降而增加实验系统的温度,这也进一步证实了淬火DBDF2机制,与hPPAR 6 tγ蛋白质是静态猝灭。


图3
Stern-Volmer块hPPARγ在不同温度与DBDF2 6 t。
3.3。结合常数和结合位点的数字

方程(2)是Lineweaver-Burk双重相反方程,(3)推导出了(2)[25]: 在哪里K一个结合常数和吗n是独立的结合位点的数量。当 策划反对 ,不能画出一条直线,如图4。相应的计算结果如表所示2。

(一)
(一)
(b)
(b)
图4
的一块 与 在不同的温度下:(a) 293 K和310 K (b)。
表2
hPPAR的结合常数和结合位点的数量γ蛋白质与DBDF2 6 t在不同的温度下。

在实验温度(273 K和310 K),计算结合位点的人数接近1,这意味着hPPARγ-DBDF2 6 t复合物是由蛋白质hPPARγ和DBDF2 6 t比例大约为1:1。和绑定常量的数量级为103,这意味着它们之间的结合能力非常强。

3.4。热力学参数和互动力量

小分子之间的交互部队和《属于共价力包括氢键、范德华力、静电吸引,等等。hPPAR之间的主要作用力γ蛋白质和DBDF2 6 t可以判断根据热力学参数计算基于范托夫方程(26]。从之前的研究交互能力,假设不同的蛋白质和化合物有不同的主要作用力(27]。热力学参数计算根据以下方程: 在哪里 气体常数, 吉布斯自由能变化, 熵的变化, 焓的变化, 是Stern-Volmer猝灭常数。 可以被视为一个常数在温度变化时在小范围之内。和罗斯法律表示,如果 > 0, > 0,小分子之间的主要作用力和《会疏水的力量;如果 < 0和 < 0,氢键和范德华力;如果 ≈0和 > 0,静电力(28]。

根据计算结果见表3, 19.03焦每摩尔, 3.90 3.92 J /摩尔·K和J /摩尔·K相应地在293 K和310 K,然后呢 −20.18焦每摩尔和−20.24焦每摩尔相应地在293 K和310 K。根据罗斯法律,hPPAR之间的主要作用力γ蛋白质和DBDF2 6 t是疏水的力量。此外,监管机构几种交互部队和相关的微环境的影响都是负责宏观结果(29日]。

表3
hPPAR反应体系的热力学参数γ蛋白质和DBDF2 6 t。
3.5。构象的改变hPPARγ蛋白质

三维荧光光谱图所示5在密集的等值线图的形式。相关数据如表所示4。

(一)
(一)
(b)
(b)
图5
两个荧光的等高线地图系统:(一)hPPARγ和(b) hPPARγ-DBDF2 6 t系统(T= 293 K)。
表4
几个特征参数的三维荧光实验。

它可以看到从图5这两个典型的荧光峰的蛋白质位于大约在λ新兴市场= 340海里。为了更清楚地观察荧光集团的山峰,激发波长范围是比发射波长范围小,所以瑞利散射的光谱没有可用的图片(19]。hPPAR后γ蛋白质与DBDF2孵化、6 t、两个荧光峰的位置没有显著变化,但每个峰的强度在不同程度降低。三维荧光光谱的hPPARγ蛋白质(图5(一个)),大峰的强度比小的一个是7.97:1,而蛋白质与DBDF2孵化后,t(图65 (b)),值更改为8.00:1,DBDF2, 6 t表现出强烈的淬火效果的大峰位于(290/340λ前女友/λ新兴市场)。三维荧光光谱表明hPPAR的构象改变的具体结构γ蛋白质,这可能会进一步验证hPPAR之间的交互γ蛋白质和DBDF2 6 t [30.]。

3.6。确认使用飞镖技术交互的能力

为小分子识别绑定目标,飞镖的关键优势没有样品预处理方法,如标记配体(17]。和方法是特别有用,当复合低亲和力与目标,甚至结合常数在微摩尔的范围(31日]。确认hPPAR飞镖应用的可行性γ蛋白质,初步实验研究被执行hPPAR蛋白酶的消化效果γ蛋白质。和链霉蛋白酶用于消化,因为它已经被证明是更有用的飞镖比任何其他蛋白酶(16]。在初步实验中,酶解时间的消化作用和链霉蛋白酶的浓度已被调查。

电泳和染色后,每个样品的蛋白带图所示6。与DMSO控制相比,在某些情况下,hPPAR antienzymatic水解能力γ蛋白质存在DBDF2的浓度密切相关,与蛋白质6 t孵化。在0.5×10−4mol / L DBDF2 6 t,最强的antienzymatic hPPAR的水解能力γ蛋白质会出现,这样才能与浓度的变化可能会被削弱。尽管DBDF2 6 t hPPAR水解能力显示γ蛋白浓度相对较高,DBDF2的保护功能,hPPAR 6 tγ蛋白质还可以观察到,在某种程度上存在浓度效应关系。因此,hPPAR之间的互动γ蛋白质和DBDF2 6 t可以间接验证(32]。


图6
飞镖通过sds - page检测。带1纯hPPARγ蛋白质与DBDF2没有孵化,6 t或蛋白水解作用;乐队hPPAR 2和3γ蛋白质与0.5×10孵化−2mol / L和1.0×10−2分别mol / L DBDF2 6 t和没有蛋白水解作用;乐队4到8 hPPARγ蛋白质孵化DMSO溶液和不同浓度的DBDF2 6 t (5→8: 0.5×10−2摩尔/升,0.5×10−3摩尔/升,0.5×10−4mol / L和0.5×10−5mol / L),分别和蛋白水解作用。
3.7。确认绑定使用Ultrafiltration-LC技术能力

ultrafiltration-LC实验结果如图所示7。从色谱图,它可以观察到样本和负控制有一个明显的峰值位置约8.75分钟,属于复合DBDF2 6 t。重要信号增强复合DBDF2的高峰,6 t样本和负控制DBDF2之间表示一个特定的绑定,t和重组蛋白hPPAR 6γ的信号,而DBDF2 6 t -控制是归因于非特异性结合33]。大的杂质峰位于约7分钟归因于hPPAR重组蛋白的解决方案γ。因此,复合DBDF2 ultrafiltration-LC的实验验证,纯蛋白质hPPAR 6 t可以绑定γ直接在生理环境34]。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图7
ultrafiltration-LC实验结果:(a)复合DBDF2, 6 t含水甲醇溶解在50%;(b)使用天然蛋白质的样品准备;(c)的负控制准备使用变性蛋白。1:从蛋白质的溶剂hPPAR杂质的峰;2:复合DBDF2的高峰,6 t。
3.8。利用分子对接的探索的理论绑定细节

为了进一步了解DBDF2之间的交互,t和hPPAR 6γ蛋白质、分子对接被用来探索的理论绑定细节他们(35]。12矫形器的对接DBDF2 6 t生成hPPAR的口袋里γ蛋白质,总分最高为7.14和相应的崩溃分数和极地分数−1.86和0.00,分别,这意味着DBDF2 6 t hPPAR有很强的亲和力γ蛋白质等分子对接过程是在一个相对舒适的水平(36]。生成的hPPAR口袋里γ如图8(一个),氢键图如图8 (b)。总之,DBDF2 6 t理论上可以绑定到hPPARγ蛋白质与很强的粘结强度,它可以直接与SER342 GLY284 hPPARγ蛋白质的氢键。之间的氢键长度DBDF2 6 t和SER342是2.50和2.42,t和GLY284 DBDF2之间,6是2.74。

(一)
(一)
(b)
(b)
图8
的对接结果DBDF2 6 t hPPARγ蛋白质:(a)生成的hPPAR口袋里γ蛋白质;(b)氢键DBDF2图6 t hPPAR残留的互动γ蛋白质。照片中的黄线代表了氢键。

4所示。结论

本研究分析了新型专利有机锡化合物之间的交互DBDF2, 6 t和hPPARγ生理条件下蛋白质荧光猝灭的方法,三维荧光,飞镖,ultrafiltration-LC和计算机分子对接。根据光谱实验数据DBDF2 6 t可能与hPPAR交互γ蛋白质和形成了一个非辐射的极化子hPPAR复杂γ-DBDF2 6 t,主要通过疏水的力量。这样的反应是自发的和可能导致hPPAR的构象变化γ蛋白质。和实验的飞镖ultrafiltration-LC初步证明DBDF2的可能性,hPPAR 6 t是一个受体激动剂化合物γ蛋白质。考虑的抗癌活性DBDF2 6 t和PPAR的各种生理功能由受体激动剂γ蛋白质,DBDF2的结论可以得出,6 t有可能与hPPAR交互γ蛋白质作为一种兴奋剂,最后诱导抗癌活性等生理效应。这项工作成功地揭示了DBDF2的交互,与hPPAR 6 tγ蛋白质和建立一个可行的方法来验证hPPAR受体激动剂化合物γ蛋白质。

缩写

DBDF2 6 t: 双(2,6-difluoro -N-(羟基- <κ>O)benzamidato - <κ>O]dibutylitin
hPPARγ: 人类过氧物酶体proliferator-activated受体γ
三维荧光: 三维荧光
飞镖: 药物的亲和力响应目标稳定
LC: 液相色谱法。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

金融支持由山西省重点实验室创新药物治疗严重疾病的慢性炎症的基础上山西中医药大学、山西省自然科学基金(项目没有。2014011027 - 1),山西省重点学科建设基金(2016),山西省科技计划(没有。20130313021 - 9),科技创新团队山西省的高等学习机构,项目前中青年创新人才的高等学习机构的山西省(2015),年轻的基础学术领袖山西,山西工程重点实验室创新药物Inflammation-Based重大疾病(2018),和项目的综合开发中心,利用和山西医学创新(2017 - jyxt - 18)。