日本自闭症谱系障碍患者中神经素3和神经素4X x -连锁基因中四种新的同义替换的鉴定

摘要

x连锁基因的突变neuroligin 3 (NLGN3)和neuroligin 4 x (NLGN4X)在瑞典家庭中首次发现与x染色体相关的自闭症发病机制有关。然而，关于不同种族背景的自闭症谱系障碍(ASD)患者中这些基因突变的报道，在ASD的病因学方面呈现出相互矛盾的结果，可能是因为遗传异质性和/或种族背景的差异。对其他种族背景的突变筛查研究有助于澄清这些基因与ASD的相关性。我们扫描了整个编码区域NLGN3和NLGN4X对62例日本ASD患者进行聚合酶链反应-高分辨率熔化曲线和直接测序分析。四个同义替换，一个在NLGN3和三个NLGN4X在62名患者中，有4人被确诊。这些替换在278个不相关的日本个体的对照x染色体中不存在，也没有在132个单核苷酸多态性数据库或日本单核苷酸多态性数据库中注册，表明它们是新的和特异性的ASD。虽然需要进一步分析以确定这种替代的生理和临床重要性，但同义和非同义替代与ASD病因相关性的可能性仍需考虑。

介绍

Neuroligin 3（NLGN3),Neuroligin 4 x（NLGN4X)是突触后神经元中表达的神经蛋白的成员，并通过其配体neurexins的相互作用介导跨突触信号[1］．x连锁基因的突变NLGN3和NLGN4X(GenBank登录号分别为NM_181303.1和NM_020742.2)首次被报告与x连锁自闭症谱系障碍(ASD;MIM#300425和MIM#300495)在瑞典家庭[2］．一些报告也指出NLGN3和NLGN4X负责ASD。这些基因的突变包括5个错义突变[2- - - - - -5]，两个小的in-del突变，导致转录本中提前终止密码子[2，6，外显子跳过突变[7]，以及大量删除[8，在ASD患者中被发现(表1)．体外实验使用NLGN3和NLGN4X在ASD患者中发现的携带氨基酸变化的蛋白质表明，基因突变可能通过功能丧失机制引起ASD [5，9］．Neuroligin 3p.R451C敲入小鼠和neuroligin 4 x-缺陷小鼠表现出与自闭症相关的行为[10，11］．此外，最近的突变筛选研究表明，pk378r替代在NLGN4X基因在不同种族的个体中普遍存在，如葡萄牙人和希腊人[3.，4］．最近的一项关于罕见变异的研究NLGN3和NLGN4X还支持了特定之间的关系NLGN3中国汉族男性ASD的单倍型与病因[12］．此外，在ASD患者中特别发现了两种同义变异[13，14］．


基因	NT¹改变	很²改变	突变类型	种族背景	Ref。^3.	NCBI

NLGN3	c.222C > T	p.Y74Y	同义的	芬兰	［13］	NM_181303.1
NLGN3	c.1351C > T	p.R451C	错义	瑞典	［2］	NM_018977.3

NLGN4X	c.259C > T	p.R87W	错义	爱尔兰和苏格兰	［5］	NM_020742.2
	c.759G >一	p.G99S	错义	葡萄牙语	［3.］	NM_020742.2
	c.1186本月	p.D396X	移码的	瑞典	［2］	NM_020742.2
	c.1253delAG	p.D429X	移码的	法国	［6］	NM_020742.2
	c.1597A > G	p.K378R	错义	葡萄牙和希腊	［3.，4］	NM_020742.2
	没有描述⁴	p.A558A	同义的	德国	［14］	NM_020742.2
	c.2574C > T	p.R704C	错义	葡萄牙语	［3.］	NM_020742.2
	德尔外显子4	在坐标系⁵	跳过	阿格雷⁶	［7］	NM_020742.2
	德尔外显子4 - 6	截断⁷	大的删除	爱尔兰和英国	［8］	NM_020742.2

¹NT:核苷酸。
²一:氨基酸。
^3.裁判:参考号码。
⁴取代核苷酸的数目在文献中没有提及。
⁵预测外显子4跳跃性突变会导致62个氨基酸的框内排除。
⁶孤独症遗传资源交换。
⁷翻译后的蛋白在外显子3和外显子6之间被完全截断。

相反，一些数据表明，这两个基因对ASD的发展没有显著影响。ASD患者编码区突变频率不高(<2%)[2- - - - - -6］．据报道，在英国、加拿大、自闭症遗传资源交换(AGRE)和国际自闭症分子遗传研究联盟(IMGSAC)的ASD患者中没有观察到这些基因的突变[15- - - - - -17］．

这种矛盾的结果可能是由于ASD患者的遗传异质性、地区特征或种族背景的差异。因此，重要的是研究NLGN3和NLGN4X不同种族背景的ASD患者的基因序列。

的分子筛查NLGN3和NLGN4X在日本的ASD患者中尚未报道。因此，我们利用聚合酶链反应(PCR)高分辨率熔解(HRM)和直接测序分析，对62例不相关的日本ASD患者和278例对照x染色体进行了突变筛选研究。

材料和方法

2．1．病人

本研究分析的日本ASD患者之前有描述[18］．所有患者均根据《精神障碍诊断与统计手册(第四版标准)》、《自闭症诊断访谈-修订版》和至少由两名经过培训的精神病医生编制的《儿童自闭症评定量表》诊断为ASD。所有患者均未发现染色体畸变。本研究经琉球大学伦理委员会批准，并获得所有受试者的书面知情同意。

2．2.基因组DNA来源

采用蛋白酶K消化的标准方案，从Epstein-Barr病毒成功转化的B细胞中分离出患者(51名男性，11名女性)和日本对照个体(30名男性，30名女性)的基因组DNA。此外，使用QIA amp柱(德国Hiden Qiagen)从198名健康日本人(118名男性，80名女性)的血液中分离出对照基因组DNA。

2．3.基因突变筛查

首先，通过PCR-HRM分析对62例ASD患者进行突变筛选。人力资源管理分析用于扫描PCR扩增子中的基因变异，例如突变和单核苷酸多态性(SNPs)，然后通过检测双链DNA热变性的差异进行测序[19，20.］．我们建立了对整个编码区域进行PCR-HRM分析的最佳条件NLGN3和NLGN4X．考虑到神经蛋白之间的高序列同源性，所有外显子的引物均在基因的侧边内含子中精心设计2)．外显子2,7,8NLGN3外显子2,5,6NLGN4X被放大到两个或三个片段，以获得人力资源管理曲线的精细分辨率。仅为外显子2的上游部分(表中2.1外显子)2)NLGN4X在所有ASD患者中进行了测序，因为我们未能区分位于该区域的复杂SNPs。


基因	外显子	向前	反向

NLGN3	2．1	GCTCAGTTTTGAGGTTCAAGTC	TCACTGGGCAGTGGTACTCG
	2．2	CACAGTCAACACTCACTTTGG	GATGGTTAGAAGCATTTTCACAG
	3.	GGCAGAGGCCTCCTGTTATT	CAAATCCTCCCTGCAAGGCA
	4	TGGCTTGCTGGGCCACACTG	GCCAAAGACAGATGAACAGCC
	5	AGGTTGAGCAACCCCATGAGT	GGGCCAGAGGATAACACCATT
	6	CATCCCTCTGCCTTCATTGTC	TAGAAGAGAGCTGGCCGATTC
	7．1	CAGCCTCAGTGACAAAGGAAT	CAGGGTGTCCTTACCCTCAG
	7．2	GTAAGGACACCCTGCGAGAG	TGGGGTCTCAAAGAGGAAAA
	8．1	GTGACCCCAGATTTCCATGT	GGCCAGAACGTTAAGGAACA
	8．2	ATCACCCGCAGGCCCAATGG	CCTCACACTCGTGGTGGGTG
	8．3	GGAGGAGCTGGCAGCATTAC	CTGGAGATTGGCTGTGCTCT

NLGN4X	2．1	AAAGCCCTATCTCTCTGCAGG	TGAGTAGTATTTCGGATGCCAG
	2．2	AAGAACACCGTTACCCAATGAG	GAGACATTATAAAACCCTCCTAG
	3.	TTAGCATTGGTGAGTCAGTGTG	CCGTCAAAACGAGAAGTGGACT
	4	CTTTTTCTATTTGGCCACCA	TTCTTGGTTCAGGGTATTTGC
	5．1	AGCTGCATTTCTGTCCTGTG	TCTCCCGCAAAGTGTCTTTC
	5．2	CCAACTTCGTGGACAACCTT	ACCCCAACACGAAGATGAAC
	6．1	CACGTCACATGTGGAAGAGT	GACGGCAATGGTGACACTTA
	6．2	TCCTCATTGAAACCAAACGA	AACATTCCTGGTCTGGAGAC

2．4．PCR-HRM分析条件

采用Ex-Taq DNA聚合酶(TAKARA Bio Inc.， Japan)在优化的条件下进行PCR: 20μL反应混合物中含有Mg^２＋free 1 × PCR buffer (TAKARA Bio Inc.， Japan)， 0.25 mM dNTPs (TAKARA Bio Inc.， Japan)， 0.25 units Ex-Taq DNA聚合酶，1μM，以及MgCl的最佳浓度₂96孔PCR板(罗氏，巴塞尔，瑞士)。每次反应的基因组DNA用量雄性为40 ng，雌性为20 ng。荧光DNA染料，SYTO 9 (0.5μM;Life Technologies, Carlsbad, CA)，在放大之前添加。每一份样品进行基因型分析。采用LightCycler 480基因扫描软件(Roche, Basel, Switzerland)对融化曲线进行序列分析，以检测序列变异。人力资源管理曲线的评价依次通过直接测序(Life Technologies, Carlsbad, CA)得到确认。

2．5．筛选在控制

然后通过单核苷酸多态性数据库(dbSNP) build 132和日本单核苷酸多态性数据库(JSNP)对ASD患者中发现的变异进行调查，以发现常见的变异。所有在ASD患者中发现的变异在从EBV转化细胞或对照日本人的血细胞中分离的基因组dna中进行扫描。

2．6．替换的评估

使用Mutation Taster软件评估替换的效果(http://www.mutationtaster.org/)．

结果

我们发现了四个变体，一个同义替换和三个内含子替换NLGN3在62例ASD患者中。在1例男性ASD患者中观察到同义替换(c.1698G>A, p.K566K)。我们还发现了四种变体，包括三个同义替换和一个在5 ' UTR区域的替换NLGN4X．在一名女性患者中观察到一个同义替换c.297C>T (p.G99G)，在两名不同的男性患者中观察到两个替换c.516C>T (p.I172I)和c.1590C>T (p.F530F)。本研究中发现的变异见表3.．PCR-HRM分析未在日本患者中发现非同义替换，包括之前报道的7种替换(见表)1和3.)．在没有任何神经精神疾病的不相关健康日本人的对照x染色体中没有发现这四个同义和一个内含子替换(见表)3.)．


基因	外显子	SNP ID¹	位置	翻译	自闭症谱系障碍²		控制^3.
基因	外显子	SNP ID¹	位置	翻译	男性	女	EBV细胞系	血

NLGN3	4	- - - - - -	c.567 + 22 c > T	Intronic	0/51	1／11	0/90	3/278
		- - - - - -	c.567 + 52 c > T	Intronic	10/51	2/11	12/90	32/278
	5	- - - - - -	c.727 + 47 g > C	Intronic	1/51	0/11	0/90	0/278
	7	- - - - - -	c.1698G >一	p.K566K	1/51	0/11	0/90	0/278

NLGN4X		rs6639602	c - 305 - 86 - t > G	5^”UTR	0/51	1／11	1/90	4/278
	2	- - - - - -	c.297C > T	p.G99G	0/51	1／11	0/90	0/278
	3.	- - - - - -	c.516C > T	p.I172I	1/51	0/11	0/90	0/278
	5	- - - - - -	c.1590C > T	p.F530F	1/51	0/11	0/90	0/278

¹dbSNP构建132或JSNP中记录的变体的引用号。(-)表示该变体没有引用号。
²有变异的ASD患者数量(男性50例，女性11例)。
^3.EBV转化细胞系(男性30例，女性30例)和血液(男性118例，女性80例)中变异的对照染色体数目。

讨论

通过PCR-HRM分析，我们仅在62例日本ASD患者中发现了一个内含子和四个外显子替换，其中2例(3.2%)为ASD患者NLGN362名患者中有3人(4.8%)患有癌症NLGN4X．外显子取代包括一个同义取代NLGN3和三个同义替换NLGN4X(表3.)．PCR-HRM分析可以检测90%的序列变异，准确率为100% [19，20.];因此;我们能辨认出几乎所有的变化NLGN3和NLGN4X在这些病人。

在这项研究中，我们分析了ASD患者ebv转化细胞的基因组dna。基因组DNA的来源，特别是从ebv转化的细胞中提取的，在每次实验中都应该是相当多的，因为在转化过程中有可能发生意想不到的替代[21，22］．对对照基因组DNA的分析表明，该基因的外显子序列无变化或代换偏倚NLGN3和NLGN4X本研究从血液和ebv转化细胞中分离的基因组DNA之间的关系(表3.)．

我们对日本ASD患者的突变筛查研究未能检测到新的非同义突变和在之前的研究中发现的7个已知的非同义突变[2- - - - - -5以及一项针对中国汉族人口的研究[12］．考虑到在以前的报道中，这些基因中非同义替换的频率较低[15- - - - - -17]，则需要大量的ASD患者样本。然而，我们的研究结果表明，非同义替换NLGN3和NLGN4X可能只占日本ASD患者的一小部分。除了ASD，也有一些报道表明NLGN3和NLGN4X也与阿斯伯格综合症有关[2， x相关的智力迟钝[6和图雷特综合症[8］．考虑的函数NLGN3和NLGN4X［1]，在不久的将来还需要对这类神经行为障碍进行更多的突变筛查研究。

越来越多的实验证据表明，同义替换可能通过转录或翻译障碍影响蛋白质功能[23- - - - - -25］．虽然目前尚不清楚四种同义替换和一种内含子替换的临床和生理重要性，但Mutation Taster软件(http://www.mutationtaster.org/) [26分析了这些取代可能通过改变剪接位点而影响蛋白质结构。根据以往关于突变筛选的报道NLGN3和NLGN4X，两个同义突变，p.Y74Y inNLGN3和p.A558ANLGN4X(表1)，但在健康对照组中没有发现[13，14］．最近对中国汉族人群的一项研究表明，一个常见的内含子变异NLGN3可能会影响男性对泛自闭症障碍的易感性[12］．虽然需要进一步的分析来证明同义替换和内含子替换对ASD的生物学效应，但这些替换以及非同义替换都应该被考虑在内。

结论

我们确定了四个替换，一个在NLGN3和三个NLGN4X这是日本ASD患者特有的。它们是同义的，但同义和非同义替换与ASD病因关联的可能性应予以考虑。

利益冲突

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

致谢

作者感谢所有参与这项研究的人。他们还感谢盛田宏(Konomi Morita)和花柳章宏(Akihiro Hanafusa)提供的专家技术援助。这项工作得到了日本科学促进会科学研究补助金(C)(项目21590362)的资助。

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自闭症研究与治疗

x -连锁基因中四种新的同义替换的鉴定Neuroligin 3和Neuroligin 4 x在日本自闭症谱系障碍患者中

摘要

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