范可尼贫血的诊断:多重连接依赖探针扩增和基于pcr的Sanger测序的突变分析

摘要

范可尼贫血(FA)是一种罕见的遗传性疾病，其特征是发育缺陷、矮小、骨髓衰竭和恶性肿瘤的高风险。FA是异质性的:到目前为止已经区分出15个遗传亚型。FA的临床诊断需要在染色体断裂试验中通过检测细胞对交联剂的敏感性来证实。作为第二步，DNA测试可以用来阐明患者的遗传亚型和确定家族突变。这些知识有助于胚胎植入前基因诊断(PGD)，并能在未来怀孕时进行产前DNA检测。尽管通过下一代测序同时检测所有FA基因在不久的将来是可能的，但这项技术还不能立即用于所有实验室。此外，在具有强创始突变的人群中，使用Sanger测序和MLPA的有限测试将是一种成本效益高的选择。我们描述了筛选的策略和优化条件fancb, fancc, fancf，和FANCG并公布自2008年以来在我们的诊断服务中获得的54名患者的队列结果。此外，还讨论了遗传咨询和携带者筛查方面的后续工作。

1.导言

范可尼贫血(FA)是一种罕见的遗传综合征，具有多种临床症状，包括发育缺陷、身材矮小、骨髓衰竭和恶性肿瘤的高风险。15个遗传亚型已被区分:FA-A， -B， -C， -D1， -D2， -E， -F， -G， -I， -J， -L， -M， -N， -O，和-P。［1- - - - - -4].大多数患者（~85%）属于A亚型（~60%）、C亚型（~10–15%）或G亚型（~10%），而少数患者（~15%）分布于其余12个亚型，相对患病率在<1%和5%之间。由于创始人效应，在某些种族群体中，这些百分比可能存在很大差异。所有亚型似乎都符合“经典”FA表型，但D1和N除外（在BRCA2 / FANCD1和PALB2 / FANCN)，这与一种明显的、更严重的综合征相关。除FA-B为X-linked外，所有亚型的遗传方式均为常染色体隐性遗传。这两种不同的继承模式对FA家庭的辅导有着重要的影响。未选择的FA患者中FA- b的相对患病率估计为1.6% [5］.对于所有的遗传亚型，疾病基因已被确定(见表)1）.在不同亚型中发现的许多突变是私有的，但复发突变是已知的，特别是在特定的种族背景中(见表)2）.


集团	基因符号(年代)^一个	细胞发生的位置	蛋白质(氨基酸)	域结构（参考）

一个	FANCA	16 q24.3	1455	重复(热8］
B	FANCB	Xp22.31	859	- - - - - -
C	FANCC	9 q22.3	558	重复(热8］
D1^b	BRCA2	13q12.3	3418	RAD51-和dna结合基序[9］
D2	FANCD2	3 p25.3	1451	- - - - - -
E	FANCE	6 . 3	536	- - - - - -
F	FANCF	11 p15	374	- - - - - -
G	FANCG	9p13	622	四三肽重复序列[10］
我	FANCI	15q26.1	1328	- - - - - -
J^b	BRIP1	17岁的时候	1249	DNA解旋酶(11，12］
l	芳珂	2 p16.1	375	环指基序(E3连接酶)[7，8］
米	FANCM	14 q21.3	2014	DNA解旋酶，核酸酶[13］
N^b	PALB2	16p12.1	1186	- - - - - -
O^b	RAD51C	17 q25.1	376	- - - - - -
P^b	SLX4	16 p13.3	1834	核酸内切酶支架[3.，4］

^一个基因命名见http://www.genenames.org/．
^bD1、J、N、O和P组中缺陷的蛋白质（粗体）作用于下游或独立于FANCD2的单泛素化；所有其他FA蛋白质作用于该过程的上游。


基因	突变*	地理和种族背景	评论	参考文献

FANCA	c.3788_3790del (p.Phe1263del)	欧洲、巴西	相对温和的	［14，15］
	c.1115_1118delTTGG (p.Val372fs)	欧洲	相对温和的	［16］
	外显子12-17del 外显子12-31del	南非	在阿非利卡人中相对普遍	［17］
	c.295C > T (p.Gln99X)	西班牙吉普赛人口	全世界最普遍的突变FANCA等位基因	［18］
FANCC	c.711+4A>T(最初报道为IVS4+4A>T)	80%的德系犹太人FA为纯合子;在日本相当普遍。	犹太人表现为严重表型，日本人表现为温和表型。	［19- - - - - -22］
FANCC	c.67delG(最初报告为322delG)	纯合子的约。50%的荷兰FA患者	与其他外显子1突变一样，表型相对温和。	［19，23- - - - - -25］
FANCD2	c.1948-16T > G	土耳其的	创始人突变	［26］
FANCG	c.313G > T (p.Glu105X)	欧洲	44%的突变FANCG在德国的等位基因。	［27］
	c.1077-2A > G	巴西葡萄牙语/	创始人突变	［27，28］
	c.1480 + 1 g > C	法裔加拿大人	创始人突变	［28］
	c.307 + 1 g > C	日本	创始人突变	［28，29］
	c.1794_1803del (p.Trp599fs)	欧洲		［28］
	c.637_643del (p.Tyr213fs)	撒哈拉以南非洲	82%的黑人FA患者	［30.］
FANCJ	c.2392C > T (p.Arg798X)		在不同血统的FA-J患者中发现约50%;古老的突变或热点。	［11，12］

基于核苷酸的编号一个TG = + 1。
已发表的FA基因序列变异，其描述符合当前的命名规则，列于http://www.rockefeller.edu/fanconi/．

大多数FA基因编码孤儿蛋白，没有已知的分子功能。至少有8个FA蛋白(FANCA， -B， -C， -E， -F， -G， -L和-M)组装成一个核多蛋白核心复合物，这是通过单倍基化激活FANCD2和FANCI所必需的[6］.FANCL携带一个RING finger结构域，被认为是本次激活中的泛素E3连接酶[7］.FANCM可能作为DNA损伤的传感器，将FA核心复合物招募到损伤部位，但FANCM也与包括Blm在内的其他蛋白质相互作用[6］.FANCD2和FANCI的单倍化作用将这些蛋白质导向受损染色质区域，在那里它们与其他蛋白质相互作用，导致损伤的修复[6］.其余的FA蛋白作用于FANCD2激活步骤的下游或平行[6］.当缺陷导致FA时，DNA损伤反应的确切性质仍有待确定。FANCJ/BRIP1和FANCM具有DNA解旋酶基元，这强烈提示FA途径通过与DNA的直接相互作用而起作用，推测是分解或重塑因DNA链间交联损伤而导致的被阻断的DNA复制叉[6］.最近通过SLX4(一种结构特异性内切酶的支架蛋白，参与脱钩DNA交联)的FA途径的扩展强化了这一观点[3.，4］.

2.FA实验室诊断学

根据定义，来自FA患者的细胞对丝裂霉素C (MMC)或二氧基丁烷(DEB)等DNA交联剂诱导的染色体断裂超敏感[31］.这种细胞表型是通过刺激血液T淋巴细胞来确定的。FA实验室测试的指标相当广泛[32］.因此，只有一小部分患者(约10%)的染色体断裂试验是阳性的，可以确定FA诊断。由于桑格测序和MLPA的突变检测相当费力、耗时，因此昂贵，阳性染色体断裂试验是开始突变筛查的先决条件。在DNA水平上确认FA诊断对于染色体断裂试验不确定的患者是重要的。此外，对FA亚型的了解与患者的治疗和预后有关。此外，基因突变的识别可以在家庭中进行携带者测试，并可以在未来怀孕时进行产前DNA测试和着床前基因诊断(PGD)。最后，这一信息可用于排除潜在骨髓移植供体中的FA。

尽管通过下一代测序同时检测所有FA基因在不久的将来是可能的，但这项技术还不能立即用于全世界所有的实验室。此外，在具有强创始突变的人群中，使用Sanger测序和MLPA的有限测试将是一种成本效益高的替代方法[33］.以下概述的策略是由我们的DNA诊断实验室开发的，用于提供FA的分子诊断。人们已经认识到FANCA占所有FA病例的60-70%，该基因中约15-20%的突变是大缺失[33，34］.因此，DNA测试通常从筛选缺失开始FANCA．然而，根据具体情况，策略可能会有所不同。

2．1.材料

基因组DNA(例如，来自先证者或父母的白细胞或成纤维细胞)足以用于大多数突变筛选试验。cDNA的筛选效率更高，但有几个缺点:对于高质量的cDNA，生长细胞(受刺激的白细胞、淋巴母细胞或成纤维细胞)是必要的。此外，常见的可变剪接变体将妨碍DNA序列的评估。因此，对gDNA进行筛选是突变筛选的首选方法。然而，在诊断过程中，从先证者身上培养细胞在一些情况下是有帮助的。生长中的细胞对于研究未分类变异对剪接的影响或通过表达疑似基因的野生型副本的细胞表型的功能互补来验证疾病基因是必不可少的[35- - - - - -37］.最后，如果不能检测到突变，生长中的细胞可以通过检测细胞生长或g2抑制试验中MMC的敏感性来再次确认诊断FA [38，39］.

２.２.突变筛查策略

2.2.1。来自种族背景或表型的提示

先证者的种族背景信息可能为最有可能导致该疾病的特定致病性突变提供线索，例如，c.711+4A>T（IVS4+4A>T）FANCC,在德系犹太人血统的所有FA病例中，有80%的FA病例存在纯合子状态的突变，c.295C > T在FANCA，这在迄今为止调查的所有40例西班牙吉普赛血统的FA病例中都是纯合的。表中显示了更多复发突变的例子3.．D1和N患者不同的临床表型(病情严重，常伴有5岁以下的白血病或实体瘤)可能提供了有利的线索BRCA2 / FANCD1和PALB2 / FANCN作为第一个被筛选的基因[40- - - - - -44］.与所有其他已知FA亚型的细胞相比，D1、N和O患者的细胞在暴露于X射线或MMC时无法形成RAD51病灶[43- - - - - -45］.


			等位基因1			等位基因2
	原产国¹	基因	DNA变化	效果	数据库条目数	DNA变化	效果	数据库条目数

1	西文	FANCA	ex16_17del	德尔	12 x	c.1115_1118del	p.Val372fs	62 x
2	PT	FANCA	c.718C > T	p.Gln240X	2 x	c.2870G >一	W957X	1 x
3.	问	FANCA	ex15del	德尔	3 x	ex15del	德尔	3 x
4	问	FANCA	c.3788_3790del	p.Phe1263del	215 x	c.3788_3790del	p.Phe1263del	215 x
5	CA	FANCA	c.718C > T	pGlnx240X	2 x	c.1085T > C	p.Leu362Pro	小说
6	PT	FANCA	c.3788_3790del	p.Phe1263del	215 x	c.4130C > G	p.Ser1377X	1 x
7	即	FANCA	c.2812_2830dup	p.Asp944fs	3 x	c.2812_2830dup	p.Asp944fs	3 x
8	非盟	FANCA	c.2303T > C	p.Leu768Pro	5倍	c.2303T > C	p.Leu768Pro	5倍
9	问	FANCA	c.862G > T	p.Glu288X	1 x	c.862G > T	p.Glu288X	1 x
10	问	FANCA	ex11_33del	德尔	1 x	c.2121delC	p.Asn707fs	小说
11	DK	FANCA	ex1_8del	德尔	1 x	c.3788_3790del	p.Phe1263del	215 x
12	英国	FANCA	c.337_338del	p、 Ala114fs	1 x	c.3349A > G	p.Arg1117Gly	2 x
13	英国	FANCA	c.3568C > T	p.Gln1190X	小说	c.3568C > T	p.Gln1190X	小说
14	问	FANCA	c.487delC	p.Arg163fs	1 x	c.2851C > T	p.Arg951Trp	11 x
15	SE	FANCA	c.88delG	p.Val30fs	小说	c.100A > T	p.Lys34X	2 x
16	问	FANCA	c.862G > T	p.Glu288X	9 x	c.1771C > T	p.Arg591X	9 x
17	PT	FANCA	c.1709_1715 + 4。	p.Glu570fs	小说	c.3430C > T	p.Arg1144Trp	小说
18	没有	FANCA	c.100A > T	p.Lys34X	2 x	c.1378C > T	p.Arg460X	小说
19	PT	FANCA	ex15_17del	德尔	2 x	ex15_17del	德尔	2 x
20.	问	FANCA	c.2982 G - 192 a >	拼接²	小说	ex7_31del	德尔
21	非盟	FANCA	c.427-8_427-5del	拼接	小说	c.1771C > T	p.Arg591X	9 x
22	非盟	FANCA	c.3491C > T	p.Pro1164Leu	小说	c.3491C > T	p.Pro1164Leu	小说
23	CA	FANCA	ex4_29del	德尔	小说	ex31del	德尔	6 x
24	问	FANCA	c.3391A > G	p.Thr1131Ala	15 x	c.3391A > G	p.Thr1131Ala	15 x
25	GR	FANCA	c.2T > C	p.Met1吗?	1 x	c.3788_3790del	p.Phe1263del	215 x
26	即	FANCA	c.851dup	p.Val285fs	小说	c.2534T > C	p.Leu845Pro	4 x
27	问	FANCA	c.2852G >一	p.Arg951Gln	6 x	c.3624C > T	p。=(拼接)	2 x
28	非盟	FANCA	c.331_334dup	p.Leu112fs	小说	ex22\u 29del	德尔	小说
29	问	FANCA	c.862G > T	p.Glu288X	9 x	c.3920delA	p.Gln1307fs	2 x
30.	红外	FANCA	ex21del	德尔	小说	ex21del	德尔	小说
31	SE	FANCA	ex1_12del	德尔	小说	ex22\u 29del	德尔	小说
32	问	FANCB	c.755_767del	p.Leu252fs	小说	- - - - - -	- - - - - -	- - - - - -
33	问	FANCC	c.67delG	p、 Asp23fs	50 x	c.553C > T	p.Arg185X	14 x
34	问	FANCC	c.67delG	p、 Asp23fs	50 x	c.67delG	p、 Asp23fs	50 x
35	CA	FANCC	c.67delG	p、 Asp23fs	50 x	c.553C > T	p.Arg185X	14 x
36	问	FANCC	c.67delG	p、 Asp23fs	50 x	c、 1155-1G>c	拼接	小说
37	问	FANCC	c.67delG	p、 Asp23fs	50 x	c.67delG	p、 Asp23fs	50 x
38	问	FANCC	c.67delG	p、 Asp23fs	50 x	c.467delC	p.Ser156fs	小说
39	PT	FANCE	c、 1111C>T	p.Arg371Trp	6 x	c、 1111C>T	p.Arg371Trp	6 x
40	英国	FANCF	c.496C > T	p.Gln166X	4 x	c.496C > T	p.Gln166X	4 x
41	英国	FANCG	c.307 + 2解决	拼接	小说	c.307 + 2解决	拼接	小说
42	英国	FANCG	c.1471_1473delinsG	p.Lys491fs	小说	c.1471_1473delinsG	p.Lys491fs	小说
43	问	FANCG	c、 65G>c	p.Arg22Pro	6 x	c.65G > C;	p.Arg22Pro	6 x
44	红外	FANCG	c.307 + 1 g > C	拼接	21 x	c.307 + 1 g > C	拼接	21 x
45	问	FANCG	c.85-1G >一	拼接	小说	c.85-1G >一	拼接	小说

¹原籍国:AU:澳大利亚;CA:加拿大;DK:丹麦;ES:西班牙;格:希腊;即:爱尔兰;红外光谱:伊朗;问:荷兰;PT:葡萄牙;SE:瑞典; UK: United Kingdom
数据库条目数指的是FA数据库:http://www.rockefeller.edu/fanconi/。
新错义突变的致病状态是基于在网上预测算法(SIFT, POLYPHEN2, Align GVGD)，同一基因中存在第二个明显致病突变和家族分离。
²c.2982-192A>G:通过研究cDNA，发现突变产生了一个新的剪接供体位点，导致mRNA异常。

2.2.2。没有可用的线索

（1）在没有任何疾病基因线索的情况下，突变筛选从寻找基因缺失开始FANCA，因为这种类型的突变占所有突变的40%FANCA等位基因。定量多重连接依赖探针扩增(MLPA)方法[46用于初始屏幕，用于标识FANCA通过检测a -通常是半合子缺失，在4名患者中有1人是最有可能的疾病基因。与此同时,FANCA基因是完全测序的。结合这两种方法，60-70%的FA患者为FA- a。（2）接下来,FANCC - e, f,- g通过DNA测序进行筛选。（3）只有先证者是男性，FANCB通过MLPA和DNA测序进行筛选，

在表4，为PCR扩增提供了优化条件FANCA -C -E -F -G -B．大多数pcr都可以在标准条件下进行。PCR引物有M13的延伸，可以用通用测序引物对所有片段进行测序。MLPA是根据供应商的指示执行的。有关MLPA探针序列的详细信息可从供应商网站(http://www.mlpa.com）.在一个设备齐全的实验室，有足够的敬业的个人，测试FANCA -C -E -F -G -B可在1-2周内完成。

(一)


FANCA
引物名称	序列（5′>3′）	产品长度(bp)

FANCA_ex1F	gtaaaacgacggccag GCGCCTCCCCCAGGACCAACA	362
FANCA_ex1R	caggaaacagctatga AGGCTCTGGCGGGAAGGGATCGG
FANCA_ex2F	gtaaaacgacggccag CTCTTCGGGAGGTGTCGCTGGT	328
FANCA_ex2R	caggaaacagctatga CTCTTCGGGAGGGTGTCGCTGGT
FANCA_ex3F	gtaaaacgacggccag GCCTGGCCTGGAGCTTGAAT	392
FANCA_ex3R	caggaaccagctagcggtgaatcagacgctgtt
FANCA_ex4F	gtaaaacgacggccag TAAGGCATTTTAAACAGCAAGTC	430
FANCA_ex4R	caggaaacagctatga TGCCAATAAATACTGAGCAAACT
FANCA_ex5F	gtaaaacgacggccag AGTATTGTTTCAGGTAATTTGTT	356
FANCA_ex5R	caggaaacagctatga TGAAGGTACTTCTTTCCAATCCA
FANCA_ex6F	gtaaaacgacggccag AGATGTGTTTCAGGCTCTAAGTT	402
FANCA_ex6R	caggaaacagctatga GCAATGCAATCTAGTCTAGTACA
FANCA_ex7F	gtaaaacgacggccag TGGGATTTAGTTGAGCCTTACGTCTGC	421
FANCA_ex7R	caggaaacagctatgaAAGGTGAATGGAAACACTTAAACTCATGTCA
FANCA_ex8F	gtaaaacgacggccag GTGGTCAGGTGAGCAGTAACTTC	401
FANCA_ex8R	caggaaacagctatga TAAATAGGTACAAACAGCACGTT
FANCA_ex9F	gtaaaacgacggccag TTCTCTTGTGTGATGCAGGTATC	332
FANCA_ex9R	caggaaacagctatga TGACCCACAGATTCATGAGGTAT
FANCA_ex10F	gtaaaacgacggccag TTTTGATTAAGGCCTACAGATTG	406
FANCA_ex10R	caggaaacagctatga CCTCCTCCTCACGCACGTTATCG
FANCA_ex11F	gtaaaacgacggccag TTTCAAGTCTGTGGTTATAGTGG	410
FANCA_ex11R	caggaaacagctatga AGACGTAAAAGAGGTCCTAGAAT
FANCA_ex12F	gtaaaacgacggccag CTGTGGGGCTGGTCCTTAACAAA	236
FANCA_ex12R	caggaaacagctatga AGGCAGCATGACAAGTACTAGGC
FANCA_ex13F	gtaaaacgacggccag ACATTGGTTTGCTTGGATATTGA	377
FANCA_ex13R	caggaaacagctatga CTGACAAAGAATGTTCCATCGAC
FANCA_ex14F	gtaaaacgacggccag TGCTGTAATTGCTGTGTAGTCTT	411
FANCA_ex14R	caggaaacagctatga ACTCACATGACAGAGAATCAGGT
FANCA_ex15F	gtaaaacgacggccag ACTACAGCAGCCGCCCGGACACT	430
FANCA_ex15R	CaggaacAgcTatGacAgatCgAgatCgAgatCgGagCgTcTgG
FANCA_ex16F	gtaaaacgacggccag TCCCAGGCAGTTCCCAGACTAAC	312
FANCA_ex16R	caggaaacagctatga AGCTGATGACAAATCCTCGTAGA
FANCA_ex17F	gtaaaacgacggccag ACCGCTCCCTCCTCACAGACTAC	334
FANCA_ex17R	caggaaacagctatga AAGGCTGAAAAACTCAACTCAAG
FANCA_ex18F	gtaaaacgacggccag GCGCACAGATGTGGGCCTTAC	397
FANCA_ex18R	caggaaacagctatga GCAGCTGCTAGAGGCCTTTTCGG
FANCA_ex19F	gtaaaacgacggccag GTGCACAAGAAGACTTCATAATG	284
FANCA_ex19R	caggaaacagctatga AGTCCTTGCTTTCTACACAACTG
FANCA_ex20F	gtaaaacgacggccag CTTCTCTGTGTTGCAGCATATTC	298
FANCA_ex20R	caggaaacagctatga AGAAGAAACCTGGAAGTAGTCAT
FANCA_ex21F	gtaaaacgacggccag ATAATAGATTTGGGGATTGTAAT	255
FANCA_ex21R	caggaaacagctatga CAACAGACACTCAAGGTTAGGAA
FANCA_ex22F	gtaaaacgacggccag TGCAGTGAAGAGTCCTGTTGAGT	305
FANCA_ex22R	caggaaacagctatga ACACACCAGCCTGATGTCACTAT
FANCA_ex23F	gtaaaacgacggccag CAGTCAGCAGGATCCGTGGAATC	416
FANCA_ex23R	caggaaacagctatga GGCCCTGGAACATCTGATACGAC
FANCA_ex24F	gtaaaacgacggccag CCTTCCTGCTGCTCCCGTCC	229
FANCA_ex24R	caggaaacagctatga CAGACTTGGCCCAGCAAGAG
FANCA_ex25F	gtaaaacgacggccag CCGCTGGTGGTTGGATTAGCTGT	296
FANCA_ex25R	caggaaacagctatga TTTCCAGGGCACTGAAGACGAAT
FANCA_ex26F	gtaaaacgacggccag AGCTTGGAAGAGGGCAGTCTGCT	347
FANCA_ex26R	caggaaacagctatga CTCTTCTAATTTTATCAAACGAG
FANCA_ex27F	gtaaaacgacggccag AGACTGTCTCACAACAAACGAAC	356
FANCA_ex27R	caggaaacagctatga CGGTCCGAAAGCTGCGTAAAC
FANCA_ex28F	gtaaaacgacggccag GTTGATGGTCTGTTTCCACCTGA	401
FANCA_ex28R	caggaaacagctatga GAAGGAACGGTCACCTACGTGCT
FANCA_ex29F	gtaaaacgacggccag GACATGGAGACTGCGTATGAGA	411
FANCA_ex29R	caggaaacagctatga GTGGCTGTGATGACTGGAACGTG
FANCA_ex30F	gtaaaacgacggccag CCCGAGCCGCCAGTCTCAACCCA	411
FANCA_ex30R	Caggaaccagctagaaggcacccactaagcta
FANCA_ex31F	gtaaaacgacggccag GATAAGCCTCCTTGGTCATGGTA	406
FANCA_ex31R	caggaaacagctatga TGGCAATAAATATCTTAATAGCA
FANCA_ex32F	gtaaaacgacggccag TTCCTGTGCCAGCATACTGCTCT	359
FANCA_ex32R	caggaaacagctatga GGGTGGGGACACACAGACAAGTA
FANCA_ex33F	gtaaaacgacggccag TGGGTTTCAGGGTGGTGGTTGCT	356
FANCA_ex33R	CAGGAACAGCTATGA GAACCCTTTCCTCAGTATTCAC
FANCA_ex34F	gtaaaacgacggccag CGCCCAGGGAAGCCGTTAAGTTT	333
FANCA_ex34R	caggaaacagctatga GCGTTCTGAGAAGGCCACGAGAG
FANCA_ex35F	gtaaaacgacggccag TTCCTTCACTCTACTAGTTGTGG	311
FANCA_ex35R	caggaaacagctatga TGAGATGGTAACACCCGTGATGG
FANCA_ex36F	gtaaaacgacggccag CCATCTCAGCCACCCTCATCTGT	350
FANCA_ex36R	caggaaacagctatga AGGCGCCCACCACCACGAGAACT
FANCA_ex37F	gtaaaacgacggccag GACTTGGTTTCTATGGCGTGGTT	310
FANCA_ex37R	卡加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加
FANCA_ex38F	gtaaaacgacggccag GTTTTCTAAGATCCACTTAAAGG	362
FANCA_ex38R	caggaaacagctatga CTCACTCACACTTCCGCAAACAC
FANCA_ex39F	gtaaaacgacggccag CTGTCCAGAGGCCCAGTATTACC	387
FANCA_ex39R	caggaaacagctatga AGGAGGGCTCGTTCTTAACCATT
FANCA_ex40F	gtaaaacgacggccag GGTGTCCCCAGCACTGATAATAG	353
FANCA_ex40R	卡加加加加加加加加加加加加加加加特加加加加加加加特加加加加加加加加加特加加加加加加加加加加加特加加加加加加加加加加特加加加加加加加加加
FANCA_ex41F	gtaaaacgacggccag CCCTTGGCATCACCTGCTACCTT	403
FANCA_ex41R	caggaaacagctatga AACAGGCAAACTCACAGGTTAGA
FANCA_ex42F	gtaaaacgacggccag ACCAGCCCTGTTTCTGTATGTCT	248
FANCA_ex42R	CAGGAGACAGCTATGA ACATGGCCAGGCCTGTCAAT
FANCA_ex43F	gtaaaacgacggccag TGTGGGGGACATGAGAATTGACA	378
FANCA_ex43R	caggaaacagctatga GTAATCCACTTTTTAGTGCAACA
FANCAIVS10F	gtaaaacgacggccag TTTACATGTGCATCAGTTAGCTT	184
FANCAIVS10R	caggaaacagctatga CATGAAGACACAGAAAAAGTAGGT

(b)


FANCC
引物名称	序列（5′>3′）	产品长度(bp)

FANCC_ex1F FANCC_ex1R	gtaaaacgacggccag ACCATTTCCTTCAGTGCTGGACA caggaaacagctatga CCATCGGCACTTCAGTCAATACC	378
FANCC_ex2F FANCC_ex2R	gtaaaacgacggccag CTAAACAAGAAGCATTCACGTTC caggaaacagctatga GGAGAAAGGTTCATAATGTAAGC	303
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FANCC_ex4F FANCC_ex4R	gtaaaacgacggccag TGTACATAAAAGGCACTTGCATT CAGGAACAGCTATGA TCCCATTCTCTCTCGTA	380
FANCC_ex5F FANCC_ex5R	gtaaaacgacggccag AGAACTGATGTAATCCTGTTTGC caggaaacagctatga TTACTGCTCTGTGAGAGTTGAGA	367
FANCC_ex6F FANCC_ex6R	gtaaaacgacggccag GTCTTTGACCTTTTTAGCATGAA CaggaacAgcTatGacAgcTatGacAgcCtCgTa	387
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(c)


FANCE
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FANCE_ex1F FANCE_ex1R	gtaaaacgacggccag CGCCTCCCTCCTTCCCTTTC caggaaacagctatga CCCGCCTCCCATACCTGCTAA	540
FANCE_ex2aF FANCE_ex2aR	gtaaaacgacggccag GCTCTGCCCAGTCTGCCTTGTGC caggaaacagctatga CTCTGAGTCCTTTCTGCGTTTCC	469
FANCE_ex2bF FANCE_ex2bR	gtaaaacgacggccag GCCAGAGACAGCTCCAAAGTCTA caggaaacagctatga CAGCCTTCCCCATGGATAAAGCC	479
FANCE_ex3F FANCE_ex3R	gtaaaacgacggccag GCCTCTTGACTTTCTTGAATCAT caggaaacagctatga ACTGTCCTCAGACCTTTACTCCA	352
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(d)


FANCF
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FANCF_ex1aF FANCF_ex1aR	gtaaaacgacggccag TTTCGCGGATGTTCCAATCAGTA caggaaacagctatga CTGCACCAGGTGGTAACGAGCTG	449
FANCF_ex1bF FANCF_ex1bR	gtaaaacgacggccag AGTGGAGGCAAGAGGGCGGCTTT caggaaacagctatga GCTATCACCTTCAGGAAGTTGTT	456
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(e)


FANCG
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FANCG_ex1F FANCG_ex1R	gtaaaacgacggccag AGCCTGGGCGGGTGGATTGGGAC caggaaacagctatga TCATTTCTGGCTCTTTGGTCAAG	389
范库ex2F 范库ex2R	gtaaaacgacggccag CAGGCCAG CAAGCCAAGGTAACAGGTTGCT CaggaacAgcTatga CCAGTCTCTCTGCCTTAAAC	460
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FANCG_ex14F FANCG_ex14R	gtaaaacgacggccag CCAAACTAAGGGGTCACATGAAG caggaaacagctatga GATGGTGAAGCAGAAAGCCCTCC	405

(f)


FANCB
引物名称	序列（5′>3′）	产品长度(bp)

FANCB_ex3AF FANCB_ex3AR	gtaaaacgacggccag GATATGGTTATTTGAATTCTTAGCAcaggaaacagctatga GCCATCCTTCATCTCATAGCCTAGT	721
FANCB_ex3BF FANCB_ex3BR	gtaaaacgacggccag ATTAACCTCCCTTACATTGTGATAGcaggaaacagctatga CAATAAGACTCCAGAATGAACTCTA	811
FANCB_ex4F FANCB_ex4R	gtaaaacgacggccag TTTACAAATGACAACTACATGAcaggaaacagctatga TTAAGTATAAAACCACCAATAT	391
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FANCB_ex10F FANCB_ex10R	gtaaaacgacggccag AATTGGTTCTGTTTATCATTATGGT caggaaacagctatga CTACTACAGTAAGCCTCGGTGTTTA	686

PCR条件:
采用96孔板在Applied Biosystems PE9700系统中进行PCR。PCR反应(终卷25l)包含0.5单位铂Taq聚合酶(Invitrogen)， 1.5 mM氯化镁₂， 0.2 mM NTPs (Invitrogen)， 10pmol引物。
对于绝大多数扩增子，采用标准PCR条件:预热95°C, 5分钟，变性95°C, 30秒，退火60°C, 30秒。，延伸72°C, 1分钟，循环次数:33次。
得到了不同退火温度下的碎片FANCA外显子5 7 13 21 26 31 38，FANCC外显子7,FANCF片段1 d和FANCE外显子1:55°C;FANCA外显子1:64°C。为FANCE外显子1中加入10% DMSO。
为FANCB采用不同的PCR条件:预热95°C, 5 min，变性95°C, 1 min，退火50°C, 1 min。，延伸率72°C, 1分钟。，循环次数30。为FANCB外显子7和9的退火温度为55℃。7外显子正向测序使用专用测序引物:5 ' -TTTTTAGAAGGAATGTCTTG-3 '。
引物中FA基因特异性部分用大写字母表示。引物延伸M13序列(用普通字母表示)，用于测序反应。

筛选后FANCA -C -E -F -G -B，约85%的患者获得了分子诊断[34］.在我们自2008年以来提供诊断服务的54名患者队列中，有45名患者(83%)检测到突变。FANCA31名患者(57%)出现了突变，FANCC6例患者(11%)发生突变FANCG5例患者发生突变(9%)。FANCB，FANCE,和FANCF突变见于单个家族(表3.）.在没有突变的小组患者中，未进行互补分析或FANCD2蛋白印迹。因此，我们不知道我们是否错过了FANCA -C -E -F -G -B或者这些患者在其他FA基因上有突变。表格3.不包括产前病例，因为产前检测只提供给已经有导致fa突变的夫妇。检测是作为一种需要付费的诊断服务提供的。

对于阴性的病人FANCA -C -E -F -G -B突变，下一代测序可以用来分析所有其他FA基因。如果这项技术不可行，进一步的分析将取决于先证者是否有生长细胞。在这种情况下，western blot应该能显示是否两种FANCD2亚型都处于正常水平。（1）如果两个FANCD2波段都不存在或非常弱，FANCD2已排序。因为存在FANCD2伪基因序列，这种检测必须使用专门设计的引物对cDNA或gDNA进行[26］.（2）如果只有FANCD2的短亚型存在，芳珂和FANCM测序。如果没有发现突变，患者可能在FANCI或者在另一个作用于FANCD2上游的不明FA基因中。（3）如果两种亚型均存在，且临床表型与FA-D1或FA-N相容，BRCA2 / FANCD1和PALB2 / FANCN通过MLPA和DNA测序进行筛选。（4）如果消极,BRIP1 / FANCJ，PALB2 / FANCN，RAD51C / FANCO,和SLX4/FANCP测序。(5）如果再次呈阴性，患者应进行基因突变筛查NBS1，ESCO2和DDX11分别检测奈梅亨断裂综合征、罗伯茨综合征和华沙断裂综合征[47，48］.通过分析姐妹染色单体凝聚力缺陷的中期扩散也可以排除后两种综合征。如果再次阴性，则患者可能在一种作用于FANCD2泛素化下游的新FA基因中发生突变。

3.笔记

３．１．花叶病患者的突变筛查

如果来自FA患者的淋巴母细胞系由于疾病位点的遗传逆转而表型正常，那么在逆转的细胞系中仍有可能进行突变筛选，因为至少会出现一个突变[49- - - - - -51］.第二个突变可以通过调查父母来确定。

３．２．非机密的变体

错义突变或在坐标系删除或插入应使用在网上预测算法(SIFT, POLYPHEN2, Align GVGD)。另外，也可以在细胞转染试验中检测它们的致病性，以检查变异基因产物在缺陷细胞系中弥补细胞FA缺陷的能力(见10，35，52])。一般来说，只有在诊断实验室配备了具有所有必要技术的研究实验室的情况下，这些检测才可行。

３．３．遗传亚型的功能分配

逆转录病毒结构已经被用来通过功能互补来识别FA亚型，作为进行突变筛选之前的中间步骤[36］.虽然知道疾病基因有助于突变筛查，但逆转录病毒转导与直接突变筛查相比有一些缺点:(i)生长，需要细胞系或新鲜血液样本中的mmc敏感细胞，但并不总是容易获得;(ii)某些FA蛋白(如FANCM和FANCP)的过表达可能对细胞有毒性;(iii)在排除所有已知组后出现的新遗传亚型，不能轻易与假阴性区分，即由于某种未知原因未能引起互补的转导;(四)该方法需要比较先进的实验室设施和技术。然而，具有这类分析能力的实验室可以迅速提供互补组的功能分配[37，这极大地促进了95%以上的FA患者的可靠基因分型，这些患者的病毒结构是可用的。

3．4．遗传咨询

所有经突变分析确诊为FA的患者应与他们的父母和兄弟姐妹一起进行遗传咨询。无论有无任何临床症状，都应对所有兄弟姐妹进行突变检测。应该准备一个完整的家谱，包括一个癌症史的回忆。突变携带者可能有更高的癌症风险(见章节)3．7)，其方面应包括在咨询中(见章节3．7）.

FA患者本身的生育能力通常也会下降。女性通常初潮晚，月经不调，绝经早。然而，已经有关于FA妇女怀孕的描述，因此妇女应该充分了解其后代的风险，这主要与怀孕相关并发症的增加有关[53］.

FA患者父母的兄弟姐妹经常要求进行携带者筛查，以评估他们生下FA孩子的风险。如果同胞兄弟是携带者，这种风险仍然是最小的，因为在人群中携带的频率非常低。在美国，载波频率估计约为1 / 181 [54]。因此，经证实的携带者感染FA的风险约为724分之一。然而，在小社区或近亲夫妇中，这种风险要高得多，可能需要对经证实携带者的配偶进行突变筛查。

3．5．产前诊断

在确定一个特定家族的致病突变后，FA的产前诊断相对简单。胎儿细胞可在妊娠10-12周通过绒毛膜绒毛取样(CVS)或羊膜穿刺术(14 - 16周进行)获得。然而，CVS可能是首选，因为诊断在早期就知道了。如果突变未知，可对胎儿进行染色体断裂试验[55，但这种检测可能被认为不如筛查胎儿物质的突变可靠。此外，流式细胞术检测羊膜细胞培养中MMC的敏感性也是一种选择;然而，这项技术只在有限的几个专门实验室可用[56］.有时，胎儿超声成像可能会怀疑FA，当家庭尚未知道有FA风险时，可通过父母载体检测证实[57］.

3.6。Genotype-Phenotype相关性

FA被认为是一种疾病，可能会提出一个问题，是否所有15个遗传亚型都同样符合临床FA表型。基因型-表型相关性研究比较了最常见的3组A、C和G，表明表型差异不大，这与突变的相对严重程度相当相关[23］.然而，由于研究人口的种族分布而产生的偏差是很有可能的。其他研究报道FA-A/G与FA-C之间存在显著差异[58］.FA-D1组(突变于BRCA2)和FA-N组(突变于BRCA2)PALB2)表现出明显的、相对严重的表型，其特征是在非常年轻的时候(中位数2.2岁)发生白血病和儿童癌症，如肾母细胞瘤(Wilms肿瘤)或成髓细胞瘤[40- - - - - -44］.观察到其中一种致病突变BRCA2在FA-D1患者中是畸形的，而双等位基因缺失的小鼠在Brca2这表明BRCA2蛋白具有生存所必需的功能。

同一基因的不同突变可能与不同的表型有关，如这两个例子所示FANCC突变，c.711+4A>T和c.67delG。前者(剪接位点)突变与德系犹太人相对严重的表型有关[19]尽管据报道，日本血统患者的相关表型不太严重[20.］.这种突变在德系犹太人中的携带频率相对较高(1 / 87)，这导致了建议通过检测携带者来预防疾病[59］.在荷兰，50%以上的FA病例是纯合子的FANCC移码突变c.67delG。与这种突变相关的表型，像其他外显子1突变一样，似乎相对温和，因为这些患者很少有骨骼异常，而且骨髓衰竭的发病年龄相对较晚[24］.认识到这种遗传决定的表型差异可能有助于临床决策，包括对患者和家庭的咨询。

3.7。杂合突变携带者的癌症风险

一个重要的问题是FA突变携带者是否会增加患癌症或其他类型疾病的风险。总的来说，FA杂合子的癌症风险没有增加[60，61］.然而，在一些不太流行的FA亚型中情况有所不同。FA-D1亚型是由BRCA2［62]这是一个众所周知的乳腺癌和卵巢癌易感基因[63］.在FA-D1中，一种突变将是半形的，因为双等位“严重”突变被认为是致命的[26］.因此，FA-D1患者的父母之一将是“严重”失活的杂合子携带者BRCA2突变，因此可能增加患乳腺癌和其他brca2相关癌症的风险。是否具有半形性突变的父母也具有较高的风险尚不清楚:在乳腺癌家族中，这些半形性突变被认为是临床意义未知的变异。另外两个与FA有关并与乳腺癌或卵巢癌易感性相关的基因是PALB2 / FANCN［64，65),RAD51C / FANCO［66］.虽然癌症患者已经被鉴定为这些基因的种系突变，但对突变携带者的相对癌症风险仍缺乏准确的估计。

另一个特例是女性FANCB突变携带者，由于野生型的沉默表达，他们应该由50%的fa样细胞组成FANCB发生在胚胎早期的X失活随机过程中。然而，在少数女性中FANCB迄今为止研究的突变携带者，失活似乎强烈倾向于突变等位基因[67］.这表明FA细胞在同一组织中与未受影响的细胞相邻生存的机会很低，因此这些FA细胞可能不会增加患癌症的风险。然而，目前的数据缺乏，因此无法得出关于女性患癌症风险的确切结论FANCB突变携带者(60］.

利益冲突

作者没有声明与本研究相关的任何利益冲突。

致谢

作者感谢范可尼贫血研究基金公司，尤金，OR，荷兰健康与发展组织和荷兰癌症协会的财政支持。

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贫血

范可尼贫血的分子、遗传和诊断聚焦