抗硝基9抗体的研制与鉴定gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

新型免疫型受体(NITRs)在许多多骨鱼类中都有描述，它由抑制受体和激活受体的多基因家族编码，并被预测与哺乳动物自然杀伤细胞受体(NKRs)具有功能同源性。在斑马鱼的NITR家族中，gydF4y2Banitr9gydF4y2Ba是唯一能编码激活受体的基因。然而，可选择的RNA剪接产生三个不同的gydF4y2Banitr9gydF4y2Ba每个转录本都编码不同的亚型。虽然gydF4y2Banitr9gydF4y2Ba斑马鱼淋巴细胞中已经检测到转录本，表达Nitr9的特异性造血谱系仍有待确定。为了更好地理解nitr在斑马鱼免疫中的作用，我们产生了抗Nitr9单克隆抗体，并评估了其识别三种Nitr9亚型的能力。这些抗体在流式细胞术中的应用将证明对识别表达Nitr9的特定淋巴细胞谱系是有用的，并可能允许分离出表达Nitr9的细胞，从而可以直接评估细胞毒性(如NK)功能。gydF4y2Ba

1.介绍gydF4y2Ba

哺乳动物自然杀伤(NK)细胞是天然免疫系统中的大颗粒淋巴细胞，表达多种细胞表面受体，通过复杂的信号通路网络调节细胞毒性功能。NK细胞受体包括激活型和抑制性两种类型，它们能熟练地将肿瘤或病毒感染的细胞与正常宿主细胞区分开来[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．NK细胞细胞毒性的调节依赖于激活和抑制受体信号的整合[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]．虽然假设NK细胞受体在脊椎动物系统发育的早期就出现了，但功能数据主要基于哺乳动物NK细胞受体的研究[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

为了了解NK细胞受体的起源和进化及其功能，确定在非哺乳动物物种中的等效受体形式至关重要。硬骨鱼是最早的脊椎动物谱系之一，具有与人类和其他哺乳动物相似的先天性和适应性免疫反应功能[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]．最近，在多个鱼类中发现了一个大型的多基因家族，该家族具有与哺乳动物NK细胞受体相同的结构和功能特征，具有快速进化的抑制性和激活性的新型免疫型受体(NITRs) [gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]．在序列水平上对NITR基因簇的完整分析只在斑马鱼和青鳉基因组上进行过[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]．虽然已经在NK-like、T、B和巨噬细胞中检测到各种鲶鱼nitr的转录本[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]，所有斑马鱼nitr的转录本在淋巴系中均可检测到，但在髓系中检测不到[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]．在斑马鱼基因组中发现的39个NITR基因中，gydF4y2Banitr9gydF4y2Ba是唯一一种预计能编码激活受体的NITR基因[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]．三个交替剪接的转录本gydF4y2Banitr9gydF4y2Banitr9 -长(Nitr9L)、nitr9 -短(Nitr9S)和nitr9 -超短(Nitr9SS)，它们的胞外结构域不同[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]．Nitr9L与其他nitr最相似，它具有两个胞外Ig域:一个是可变(V)型，一个是中间(I)型[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]．Nitr9S是通过编码V域的外显子内的隐剪接供体和受体位点产生的。Nitr9SS缺乏整个V域外显子。所有Nitr9亚型的跨膜结构域都有一个带正电的残基:这一特征允许Nitr9L与适配器蛋白Dap12结合并发出信号[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]．基于蛋白质结构，Nitr9S和Nitr9SS也有望通过Dap12发出信号;然而，这还没有得到实验的证实。gydF4y2Ba

虽然gydF4y2Banitr9gydF4y2Ba斑马鱼淋巴细胞中已经检测到转录本，但无法识别和恢复表达nitr9的细胞。本文中，我们描述了两种抗Nitr9单克隆抗体的来源，通过间接免疫荧光、流式细胞术和Western blot分析证明了它们在识别重组Nitr9方面的实用价值，并随后通过Western blot分析鉴定了斑马鱼组织中所有三种Nitr9亚型。这些抗体应该被证明是有用的:(1) Western blot检测组织内Nitr9蛋白水平，(2)间接免疫荧光检测组织内Nitr9表达细胞分布，(3)流式细胞术检测特异性表达Nitr9的造血系。(4)通过荧光激活细胞分选(FACS)纯化表达Nitr9的细胞进行功能表征。gydF4y2Ba

2.材料和方法gydF4y2Ba

2．1．斑马鱼gydF4y2Ba

所有实验均涉及活斑马鱼(gydF4y2Ba鲐鱼类gydF4y2Ba)按照相关机构和国家指南和法规进行，并经北卡罗莱纳州立大学机构动物护理和使用委员会批准。成年斑马鱼(EkkWill Waterlife Resources, Ruskin, FL)被维持和牺牲，如所述[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

2．2．反向Transcriptase-PCRgydF4y2Ba

斑马鱼解剖组织总RNA (2gydF4y2BaμgydF4y2Bag)进行逆转录(SuperScript III reverse Transcriptase, Life Technologies, Carlsbad, CA)，利用基因特异性引物对cdna进行热循环(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)和钛gydF4y2BaTaqgydF4y2BaDNA聚合酶(Clontech，山景城，CA)。检测硝基9和硝基9的PCR循环次数gydF4y2BaβgydF4y2Ba-actin(均在65°C退火)分别为40和25。gydF4y2Ba

从多种斑马鱼的肾脏中纯化淋巴细胞和骨髓细胞群，并按所述汇集[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]．细胞总RNA (1gydF4y2BaμgydF4y2Bag)逆转录(SuperScript III reverse Transcriptase)。采用TaqMan引物和探针对组织和分离细胞的cdna进行定量PCR (Q-PCR) (Life Technologies, Carlsbad, CA)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．Q-PCR在单色MyiQ real-time PCR检测系统(Bio-Rad, Hercules, CA)上进行，方法为:50°C 2 min, 95°C 10 min，然后在95°C 15 s和60°C 1 min下进行55个循环。阈值周期(CgydF4y2Ba_TgydF4y2Ba)值由iQ5光学系统软件(Bio-Rad)计算。硝酸9的相对转录水平归一化为gydF4y2BaβgydF4y2Ba-actin进行计算gydF4y2Ba方法(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]．所有反应都作为技术上的三次重复进行。gydF4y2Ba

2．3.抗体开发与纯化gydF4y2Ba

采用PCR扩增GenBank NM_001005576.1的Nitr9 I域(298-623核苷酸)编码序列(见表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)和克隆pETBlue-1 (EMD Millipore, Billerica, MA)gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba采用标准程序转化调谐器细胞(EMD Millipore)。诱导细胞，并从包涵体中恢复Nitr9 I域。gydF4y2Ba

用表达于大肠杆菌中的Nitr9 I结构域免疫小鼠gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba脾细胞与P3X63Ag8.653细胞(CRL-1580, ATCC, Manassas, VA)融合。通过针对Nitr9 I结构域的酶联免疫吸附试验(ELISA)，筛选了大约3000个杂交瘤上清(Immunology Core Facility, University of North Carolina, Chapel Hill)。通过平行免疫印迹分析和间接免疫荧光筛选反应最强烈的100份上清。两个单克隆，19.1.1(这里称为anti-Nitr9)gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba)和90.10.5(这里称为anti-Nitr9gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba)，根据它们对重组Nitr9的识别能力选择进行额外的表征。检测抗体同型(isostrip: Roche;印第安纳波利斯)是IgG2b，gydF4y2Ba轻链(90.10.5)和IgG2a，gydF4y2Ba轻链(19.1.1)。抗体通过蛋白A琼脂糖柱纯化(Upstate Cell Signaling Solutions;普莱西德湖,纽约)。gydF4y2Ba

２.４.质粒与细胞培养gydF4y2Ba

构建Nitr9表达盒(无表位标签)gydF4y2BapcDNA3gydF4y2Ba(技术)。构建表位(FLAG)标记的Nitr9 (FLAG-Nitr9)表达盒gydF4y2BapLFgydF4y2Ba含有氨基末端前导序列和FLAG表位的质粒[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]．斑马鱼的编码序列gydF4y2Banitr9L nitr9S,gydF4y2Ba和gydF4y2Banitr9SSgydF4y2Ba通过PCR扩增并克隆到gydF4y2BapcDNA3gydF4y2Ba或gydF4y2BapLF。gydF4y2Ba然后将Nitr9和FLAG-Nitr9磁带放入gydF4y2BapIRES2-EGFPgydF4y2Ba(Clontech)生成:gydF4y2BapNitr9L / EGFPgydF4y2Ba，gydF4y2BapNitr9S / EGFP pNitr9SS / EGFP pFLAG-Nitr9L / EGFPgydF4y2Ba，gydF4y2BapFLAG-Nitr9S / EGFP,gydF4y2Ba和gydF4y2BapFLAG-Nitr9SS / EGFPgydF4y2Ba质粒(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．表中列出了克隆步骤中用到的引物序列gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．根据生产商说明书，使用Fugene 6 (Roche)将质粒转染到人HEK293T细胞中，转染48小时后收获。gydF4y2Ba

2．5．间接免疫荧光法gydF4y2Ba

HEK293T细胞转染于四个孔腔载玻片(Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY)。转染后的细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，3%多聚甲醛固定20分钟，50 mM nhh处理gydF4y2Ba_4gydF4y2BaCl, PBS静置5分钟。然后用1.0% Triton-X-100在PBS中渗透细胞5分钟，用1% BSA在PBS中阻断细胞5分钟。渗透后的细胞与抗硝基9孵育gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba, anti-Nitr9gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba，或抗flag抗体1小时，用PBS冲洗，与藻红蛋白(PE)抗小鼠IgG抗体和DAPI(1:10 00)孵育1小时，用PBS冲洗。从载玻片上移除腔体，使用免疫座(Thermo Shandon, Pittsburgh, PA)安装盖片。用徕卡DM5000显微镜在40倍放大下拍摄细胞。gydF4y2Ba

2．6．流式细胞术gydF4y2Ba

转染的HEK293T细胞与抗nitr9孵育gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba, anti-Nitr9gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba，或抗flag单克隆抗体1小时，PBS洗涤，与allophycocyanin- (APC-)偶联抗小鼠IgG二抗孵育30分钟。标记的细胞被洗涤，然后用3%多聚甲醛固定，并进行流式细胞分析(BD FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA)。gydF4y2Ba

2.7。西方的分析gydF4y2Ba

转染后的HEK293T细胞用PBS洗涤，用哺乳动物蛋白提取试剂(M-PER, Pierce, Rockford, IL)裂解。取成体斑马鱼的肾、脾、肠和鳃，直接收集到添加了蛋白酶抑制剂(Pierce)的组织蛋白提取试剂(T-PER, Pierce)中并均质。将裂解液离心去除细胞核，测定细胞碎片和蛋白浓度(BCA protein Assay, Pierce)。蛋白质在12% sds -聚丙烯酰胺凝胶上分离，转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上进行西方分析。膜在0.1% Tween 20 (TBST)的tris缓冲盐水中洗涤，并在阻断缓冲液(100mm硼酸、25mm硼酸钠、75mm NaCl、5%山羊血清和5%奶粉)中孵育1小时。膜与一抗在4°C阻断缓冲液中孵育过夜。一抗包括抗硝化甘油gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba、抗flag (M2)小鼠单克隆抗体(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、抗gfp小鼠单克隆抗体(Roche)、抗gapdh兔多克隆抗体(AnaSpec, Fremont, CA)。用TBST洗涤膜，然后用阻断缓冲液和辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG二抗(Roche)或辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgG二抗(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)孵育。用TBST洗涤后，Lumi-gydF4y2Ba采用western blotting底物和检测系统(Roche)观察反应性。gydF4y2Ba

2.8。Endoglycosidase治疗gydF4y2Ba

清除溶解产物(20gydF4y2BaμgydF4y2Bag)转染细胞用n -糖苷酶F (PNGase F, New England Biolabs, Ipswich, MA)在37°C下孵育1小时。清除溶解产物(25gydF4y2BaμgydF4y2Bag)取自斑马鱼组织，用OrgoSOL缓冲液(g - biosciences, Maryland Heights, MO)沉淀，再悬浮在PNGase缓冲液中，用PNGase F处理。gydF4y2Ba

3.结果与讨论gydF4y2Ba

3．1.Nitr9亚型gydF4y2Ba

Nitr9L、Nitr9S和Nitr9SS的基因组结构和预测蛋白结构如图所示gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba．所有三种异构体预测编码I型跨膜细胞表面受体，在跨膜结构域内具有带正电荷的残基。的gydF4y2Banitr9SgydF4y2Ba异构体在斑马鱼脾脏、肾脏和肠道中的表达水平高于gydF4y2Banitr9LgydF4y2Ba和gydF4y2Banitr9SSgydF4y2Ba亚型,而gydF4y2Banitr9LgydF4y2Ba转录本是在鳃中表达最多的亚型。成绩单的gydF4y2Banitr9SSgydF4y2Ba相对于其他亚型，在所有四种组织中均检测到较低水平(图gydF4y2Ba1 (c)gydF4y2Ba)．Q-PCR(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)的组合相对水平测定gydF4y2Banitr9LgydF4y2Ba和gydF4y2Banitr9SgydF4y2Ba这些组织以及纯化的淋巴细胞和骨髓细胞中的转录本(本文中使用的TaqMan引物/探针不检测gydF4y2Banitr9SSgydF4y2Ba成绩单)。的组合相对表达水平gydF4y2Banitr9LgydF4y2Ba和gydF4y2Banitr9SgydF4y2Ba肠道中的转录本始终高于肾脏和鳃(图)gydF4y2Ba1 (d)gydF4y2Ba)．而相对表达水平gydF4y2Banitr9LgydF4y2Ba和gydF4y2Banitr9SgydF4y2Ba在脾脏中不同的生物复制，从与肠中相同的水平到在肾脏和鳃中观察到的较低水平。先前报道,gydF4y2Banitr9gydF4y2Ba与髓系细胞相比，斑马鱼淋巴细胞中的转录本含量高得多[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]．为了产生能够检测所有三种Nitr9亚型的单克隆抗体，用细菌表达的Nitr9 I结构域免疫小鼠(见图)gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba)，通过ELISA、Western blot和间接免疫荧光技术筛选杂交瘤产生识别重组Nitr9的抗体。两个克隆，19.1.1(这里称为anti-Nitr9gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba)和90.10.5(这里称为anti-Nitr9gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba)，以作进一步评估。gydF4y2Ba

3．2．间接免疫荧光法检测转染细胞中的Nitr9亚型gydF4y2Ba

以确定抗硝基9gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba和anti-Nitr9gydF4y2Ba^90gydF4y2BaHEK293T细胞转染共表达EGFP的质粒和flag标记的或内源性的Nitr9亚型;这样，任何表达Nitr9的细胞也会表达EGFP(图gydF4y2Ba1 (e)gydF4y2Ba)．为了确保重组Nitr9蛋白能被免疫荧光检测到，我们使用了一种抗flag抗体来检测转染细胞中所有三种flag标记的Nitr9亚型(图)gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba)．结果显示，两种抗硝基9gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba和anti-Nitr9gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba通过免疫荧光识别FLAG-Nitr9L和FLAG-Nitr9S，但两者都不能结合(anti-Nitr9gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba)或结合效果较差(抗硝基9gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba)到FLAG-Nitr9SS(图gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2 (c)gydF4y2Ba)．相反，两者都是反硝化的gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba和anti-Nitr9gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba有效识别内源性Nitr9在转染细胞中表达的所有三种亚型，尽管抗Nitr9细胞的背景标记明显更高gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．可能是FLAG-tag干扰了Nitr9SS的折叠，或者空间干扰了抗体对FLAG-Nitr9SS I结构域的识别;西方的分析也观察到了这一点(下文将讨论)。gydF4y2Ba

3．3.用流式细胞术检测转染细胞中的Nitr9亚型gydF4y2Ba

以确定抗硝基9gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba和anti-Nitr9gydF4y2Ba^90gydF4y2BaHEK293T细胞转染质粒编码内源性或flag标记的Nitr9和EGFP亚型(图gydF4y2Ba1 (e)gydF4y2Ba)．流式细胞术检测抗flag、抗nitr9gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba, anti-Nitr9gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba抗体检测表达Nitr9的细胞。双阳性FLAG-Nitr9L表达细胞(即EGFP)的百分比gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和Nitr9gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)相似(55-63%的EGFPgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba当使用anti-FLAG或anti-Nitr9抗体时(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba(a))。两种抗nitr9抗体对表达内源性Nitr9L亚型的转染细胞的识别效率相似(EGFP的61-73%)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞)(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba(b))。gydF4y2Ba

anti-FLAG单克隆抗体不能结合FLAG-Nitr9S和anti-Nitr9gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba抗体未能检测到表达Nitr9S或flag -Nitr9S的细胞(2-9%的EGFP)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞)(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba(c)和gydF4y2Ba4gydF4y2Ba(d))。虽然anti-Nitr9gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba抗体可检测FLAG-Nitr9S(占EGFP的31%)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba它不识别内源性的Nitr9S(约占EGFP的5%)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞)。虽然Nitr9S和FLAG-Nitr9S蛋白是通过转染细胞产生的(见图)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba和Western blot结果如下)，它们可能不能在细胞表面有效表达。为了确定细胞表面的Nitr9S表达是否需要信号转接蛋白Dap12的共表达，我们将编码Nitr9S和斑马鱼Dap12的质粒共转染细胞。抗nitr9抗体的细胞表面标记未见增加(数据未显示)。gydF4y2Ba

反flag和反nitr9gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba抗体能有效结合FLAG-Nitr9SS(57%和31%的EGFP)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞,职责)。的anti-Nitr9gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba抗体不能结合FLAG- nitr9ss，可能是由于FLAG标签的空间位阻(图)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba(e))因为两种抗nitr9抗体都能有效识别Nitr9SS(65%-75%的EGFP)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞;数字gydF4y2Ba4gydF4y2Ba(f))。gydF4y2Ba

3．4．Anti-Nitr9gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba在西方分析中结合Nitr9的所有三种亚型gydF4y2Ba

以评估抗硝基9的能力gydF4y2Ba^90gydF4y2BaHEK293T细胞转染内源性和flag标记的Nitr9亚型的质粒(图)gydF4y2Ba1 (e)gydF4y2Ba)．细胞裂解液使用抗nitr9进行Western blot分析gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba抗体内源性Nitr9的三种亚型以及flag标记的Nitr9L和Nitr9S蛋白均被检测到。与anti-FLAG单克隆抗体阳性对照的结合模式相当(图)gydF4y2Ba5(一个)gydF4y2Ba)．然而,anti-Nitr9gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba日志含义绑定FLAG-tagged Nitr9SS失败。如上所述，这可能是由于FLAG-tag阻断了该抗体识别的特定表位的访问。gydF4y2Ba

抗硝基9检测到两条蛋白条带gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba在内源性和flag标记的Nitr9L和Nitr9S转染中，也被抗flag抗体结合。两种观察到的Nitr9L蛋白的分子量均高于预测的Nitr9L大小(34 kD)，其中一种观察到的Nitr9S蛋白的分子量大于预测的Nitr9S大小(30 kD)。这些差异与糖基化差异是一致的(见下文)。基于化学发光暴露时间需要检测不同亚型的Nitr9，抗Nitr9gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba与Nitr9S和Nitr9SS相比，对Nitr9L表现出更高的亲和力。在平行实验中，反硝化9gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba抗体没有结合内源性的Nitr9S和Nitr9SS蛋白(数据未显示)，在Western blot分析中没有进一步的特征。gydF4y2Ba

3．5．硝酸根糖基化在转染细胞中的作用gydF4y2Ba

Nitr9L、Nitr9S和Nitr9SS分别拥有3个(NMSC、NDSR和NGSK)、2个(NMSC和NGSK)和1个(NGSK)候选n -连接糖基化位点。用内糖苷酶(PNGase F)处理Nitr9转染细胞的裂解液，结果只检测到预期大小的Nitr9L和Nitr9S蛋白(图)gydF4y2Ba5 (b)gydF4y2Ba)．两组结果都是一致的gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba糖基化。在转染细胞中观察到的Nitr9SS的大小似乎没有被内糖苷酶处理改变，检测的局限性表明，它可能不是糖基化的。gydF4y2Ba

3.6。Nitr9蛋白在斑马鱼不同组织中的表达差异gydF4y2Ba

以确定反硝化剂是否gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba抗体可以识别内源性的Nitr9，用内糖苷酶处理成年斑马鱼组织的裂解物并进行Western blot分析(图)gydF4y2Ba5 (c)gydF4y2Ba)．在脾脏、肾脏、鳃和肠道中检测到不同水平的Nitr9L和Nitr9S。Nitr9SS仅在脾脏检测到，尽管在肠中也观察到微弱的条带(数据未显示)。当抗硝基9在斑马鱼组织和HEK293T细胞中检测到约28kd的非特异性条带gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba抗体用于总蛋白载量大的情况下(例如，25gydF4y2BaμgydF4y2Bag溶解产物;数字gydF4y2Ba5 (c)gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

4.结论gydF4y2Ba

三种不同的转录变体gydF4y2Banitr9,gydF4y2Ba斑马鱼中单个推测的激活NITR基因及其相应的蛋白异构体已经被鉴定和表征。抗硝基9的效用gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba和anti-Nitr9gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba通过间接免疫荧光、流式细胞术和Western blot检测重组Nitr9的单克隆抗体。这些抗体在识别三种不同的Nitr9亚型方面表现出巨大的差异。当用于间接免疫荧光时，两种抗Nitr9抗体都能有效且特异性地与细胞结合，从而表达所有三种Nitr9亚型。两种抗nitr9抗体均可通过流式细胞术检测细胞表面Nitr9L和Nitr9SS的表达。的anti-Nitr9gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba该抗体通过Western blot分析识别了所有三种Nitr9亚型，但也注意到对Nitr9L有更高的亲和力。当使用anti-Nitr9gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba在高水平蛋白的Western blot分析中，发现了一条非特异性条带。虽然这种蛋白的身份尚不清楚，但它可能代表了Ig超级家族中一个保守的成员。gydF4y2Ba

Nitr9转录本和蛋白质异构体的相对水平明显不同。虽然PCR分析(图gydF4y2Ba1 (c)gydF4y2Ba)表明,gydF4y2Banitr9SgydF4y2Ba可能是脾、肾和肠中主要的mRNA亚型，Western分析表明Nitr9L是肾中主要的蛋白亚型。这种差异可能反映了不同组织中转录本和蛋白质稳定性的不同，或者是抗体与Nitr9L的首选反应性(图)gydF4y2Ba5(一个)gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

本文描述的单克隆抗体将有助于通过Western blot分析进一步评估斑马鱼组织中Nitr9蛋白水平，并通过间接免疫荧光鉴定组织切片中Nitr9表达细胞。目前正在努力使用流式细胞术纯化表达nitr9的斑马鱼细胞，以描述它们的形态和细胞毒性特性。这些抗体也可能被证明在激活(交联)或阻断Nitr9功能的细胞培养和gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba功能分析以及解剖nitr的异构体特异性功能。gydF4y2Ba

致谢gydF4y2Ba

作者感谢Bradley Bone和Karen Marcus协助产生杂交瘤并进行elisa, Janet Dow协助流式细胞术，Barb Pryor协助编辑。本文得到了美国国家科学基金会(MCB-0505585给J. A. Yoder)和美国国家卫生研究院(R01 AI057559给G. W. Litman和J. A. Yoder)的资助。gydF4y2Ba

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