啊 血液学的进步 1687 - 9112 1687 - 9104 Hindawi出版公司 596925年 10.1155 / 2012/596925 596925年 研究文章 发展和特征Anti-Nitr9抗体 沙阿 库马拉斯N。 1、2 Rodriguez-Nunez 伊凡 1 伊森 唐娜D。 3、4 Haire 罗伯特·N。 3 贝特朗 朱利安Y。 5 Wittamer Valērie 6 特拉弗 大卫 6 Nordone Shila K。 1、2 Litman 加里·W。 3、4、7 约 杰弗里·A。 1、2 大厅 克里斯多夫 1 分子生物医学科学系的和比较医学和转化研究中心 兽医学院 北卡州立大学 1060年威廉·摩尔,罗利数控27607 美国 ncsu.edu 2 免疫程序 兽医学院 北卡州立大学 1060年威廉·摩尔开车 罗利 数控27607 美国 ncsu.edu 3 儿童研究所 儿科 南佛罗里达大学医学院 第七大道南140号,圣彼得堡,33701 美国 usf.edu 4 免疫学项目,李·h·莫菲特癌症中心和研究所 木兰大道12902号 坦帕市,33612 美国 moffitt.org 5 病理学和免疫学 瑞士日内瓦大学医学院 日内瓦Michel-Servet街1211 4 瑞士 unige.ch 6 细胞和分子医学和节细胞和发育生物学 加州大学圣地亚哥 9500吉尔曼开车,拉霍亚 CA 92093 - 0380 美国 ucsd.edu 7 部分子遗传学 所有的儿童医院 第六大道南501号,圣彼得堡,33701 美国 allkids.org 2012年 24 9 2012年 2012年 23 03 2012年 13 06 2012年 27 06 2012年 2012年 版权©2012年完婚n .沙等。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

小说免疫型号受体(NITRs),已被描述在许多硬骨鱼类,是由多基因家族编码的抑制和激活受体和预测功能直接同源到哺乳动物的自然杀伤细胞受体(NKRs)。在斑马鱼NITR家庭, nitr9是唯一的基因预测编码一个激活受体。然而,替代RNA拼接生成三种截然不同 nitr9成绩单,每个编码不同的同种型。虽然 nitr9成绩单已发现在斑马鱼淋巴细胞,表达的特定造血血统(s) Nitr9仍有待确定。为了更好地理解NITRs在斑马鱼免疫的作用,anti-Nitr9单克隆抗体识别能力的生成和评估三个Nitr9亚型。这些抗体流式细胞术的应用程序应该被证明是用于识别特定的淋巴细胞谱系,表达Nitr9和可能允许隔离Nitr9-expressing细胞可以直接评估细胞毒性(如NK)函数。

 1。介绍

哺乳动物自然杀伤(NK)细胞是大颗粒淋巴细胞的先天免疫系统表达几个细胞表面受体信号通路的调节细胞毒性功能通过一个复杂的网络。NK细胞受体包括激活和抑制形式精通区分肿瘤从正常的宿主细胞或病毒感染细胞 1, 2]。调节NK细胞的细胞毒性取决于信号的集成激活和抑制受体( 3]。尽管它是假定NK细胞受体出现在脊椎动物早期发展史,功能数据主要依据的是哺乳动物的NK细胞受体的研究( 4]。

为了欣赏NK细胞受体的起源和演化及其功能,关键是定义等价的受体形式相同的物种。硬骨鱼代表最早的脊椎动物血统的功能先天和适应性免疫反应密切的相似之处,人类和其他哺乳动物( 5]。多基因家族的一个大型小说最近和快速发展的抑制和激活免疫型号受体(NITRs)结构和功能特征与哺乳动物分享NK细胞受体已被确定在多种鱼类 6, 7]。完成分析NITR基因簇的序列水平只有执行斑马鱼和青鳉基因组( 8- - - - - - 11]。尽管记录各种鲶鱼NITRs NK-like已发现,T, B,巨噬细胞细胞系( 12),成绩单的斑马鱼NITRs检测淋巴,但不是骨髓,血统 13]。的39 NITR斑马鱼的基因组中的基因已确定, nitr9是唯一NITR基因预测编码是一个激活受体( 10, 11, 14]。三个或者拼接的成绩单 nitr9特点:Nitr9-long (Nitr9L) Nitr9-short (Nitr9S)和Nitr9-supershort (Nitr9SS),它有不同的细胞外域( 13, 14]。Nitr9L是最类似于其他NITRs,它拥有两个细胞外Ig域:一个变量(V)的类型和一个中间(I)类型( 6]。Nitr9S出现通过神秘的拼接的施主和受主网站内的外显子编码V域。整个V Nitr9SS缺乏领域外显子。的跨膜域Nitr9亚型具有带正电荷的残留物:这个特性允许Nitr9L交往和信号通过适配器蛋白质Dap12 [ 14]。基于蛋白质结构,Nitr9S Nitr9SS也有望通过Dap12信号;然而,这还没有验证实验。

虽然 nitr9成绩单已发现在斑马鱼淋巴细胞,Nitr9-expressing细胞的识别和恢复是不可能的。这里我们描述的推导两个anti-Nitr9单克隆抗体,展示他们的工具来识别重组Nitr9间接免疫荧光法、流式细胞术、免疫印迹分析,随后确定所有三个Nitr9亚型在斑马鱼组织免疫印迹分析。这些抗体应该被用来证明:(1)评估Nitr9组织内蛋白质含量通过免疫印迹,(2)评估Nitr9表达细胞内组织的分布,间接免疫荧光法(3)定义特定造血血统(s)表达Nitr9通过流式细胞术,和(4)净化Nitr9 fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)表达细胞的功能特性。

 2。材料和方法 2.1。斑马鱼

所有实验涉及生活斑马鱼( 鲐鱼类)进行按照制度和有关国家指导方针和法规和北卡罗莱纳州立大学机构批准的动物保健和使用委员会。成年斑马鱼(EkkWill Waterlife资源,罗斯金,FL)是维护和牺牲所描述( 15]。

 2.2。反向Transcriptase-PCR

从解剖斑马鱼组织总RNA (2 μg)是反向转录(上标三世逆转录酶,生活技术,卡尔斯巴德,CA),和互补dna受到热循环与gene-specific引物(表 1)和钛 TaqDNA聚合酶(Clontech山景,CA)。数量的PCR用于检测nitr9和周期 β肌动蛋白在65°C(退火)是40 - 25,分别。

寡核苷酸引物序列。

目的 引物序列
反向transcriptase-PCR: nitr9 GGATTTTTGGACTTTTCTGTC
TCCACATGCGGTAACTGTAC
反向transcriptase-PCR: β- - - - - - 肌动蛋白 GGTATGGAATCTTGCGGTATCCAC
ATGGGCCAGACTCATCGTACTCCT
TaqMan Q-PCR: nitr9(探针= CAAGGTTTGGAAAAGCAC) GTCAAAGGGACAAGGCTGATAGTT
GTTCAAAACAGTGCATGTAAGACTCA
TaqMan Q-PCR: β- - - - - - 肌动蛋白(探针= CCCATGCCATCCTGC) CCATCTATGAGGGTTACGCTCTTC
AGGATCTTCATCAGGTAGTCTGTCA
放大 nitr9我为细菌域表达式构造 一个 TGGAAAAGCACACTGTAGTA一个
TTATTTAGAGCCATTCCTGTCCb
放大 nitr9LFLAG-tagged表达盒 CACCCAAATGCACCACCTGTGTTTGTTAAACc
gactgcggccgcTTACTGCTGGTTAGAAACd
放大 nitr9SFLAG-tagged表达盒 CACCCAAATGCACCACCTGTGc
gactgcggccgcTTACTGCTGGTTAGAAACd
放大 nitr9SSFLAG-tagged表达盒 CATGATTTAATTCCATCCCAc
gactgcggccgcTTACTGCTGGTTAGAAACd
放大野生型 nitr9L, nitr9S和 nitr9SS为表达磁带 gatcggatccgacATGATCAACTTTTGGATTTe
gatcgaattcTTACTGCTGGTTAGAAACCGAGf

一个 一个人工启动密码子是强调。

b 人为的终止密码子是大胆的。

c 这些引物设计的PCR克隆到 生态pLF房车的地点。

d 过剩(5′)序列是小写文本和包括 不我对克隆到pLF网站。

e 过剩(5′)序列是小写文本和包括 Bam你好,网站pcDNA3克隆。

f 过剩(3′)序列是小写文本和包括一个 生态国际扶轮网站克隆pcDNA3。

淋巴和骨髓细胞群净化从所述多个斑马鱼和汇集的肾脏( 16]。从孤立的细胞总RNA (1 μg)是反向转录(上标三世逆转录酶)。互补的组织和孤立的细胞受到定量PCR (Q-PCR) TaqMan引物和探针(生活技术,卡尔斯巴德,CA)(表 1)。Q-PCR进行单色MyiQ实时PCR检测系统(Bio-Rad大力神,CA)使用协议:50°C 2分钟,10分钟95°C,紧随其后的是55周期在95°C为15秒和60°C 1分钟。阈值周期(CTiQ5)值计算的光学系统软件(Bio-Rad)。相关记录的nitr9被规范化水平 β肌动蛋白和计算使用 2 - - - - - - Δ Δ C T 方法( 17]。所有的反应进行了技术一式三份。

 2.3。抗体发展和净化

Nitr9我领域的编码序列(核苷酸298 - 623的基因库NM_001005576.1)放大了PCR(表 1)和克隆到pETBlue-1 (EMD微孔、Billerica MA) 大肠杆菌调谐器细胞(EMD微孔)是使用一个标准的程序。细胞诱导,Nitr9我域从包涵体中恢复过来。

瑞士韦伯斯特小鼠免疫Nitr9我域表达 大肠杆菌细胞和脾细胞融合P3X63Ag8.653 (crl - 1580,写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州)。大约3000个人杂交瘤细胞上清液筛选的酶联免疫吸附试验(ELISA)对变性重组Nitr9我域(免疫学核心设施,北卡罗莱纳大学教堂山分校)。最强烈的反应~ 100上层清液依次被平行筛选免疫印迹分析和间接免疫荧光法。两个单一的克隆,19.1.1(此处称为anti-Nitr919)和90.10.5(文中称为anti-Nitr990年),选择附加特征识别重组Nitr9基于他们的能力。确定抗体同形像(IsoStrips:罗氏公司;IgG2b印第安纳波利斯,), κ 轻链(90.10.5),IgG2a κ 轻链(19.1.1)。抗体纯化通过蛋白琼脂糖列(北部细胞信号解决方案;普莱西德湖,纽约)。

 2.4。质粒和细胞培养

Nitr9表达式采用磁带(没有表位标记) pcDNA3(技术)。抗原决定基(国旗)标记Nitr9磁带被采用(FLAG-Nitr9)表达式 pLF质粒包含一个伴领袖序列和标记抗原决定基( 14]。斑马鱼的编码序列 nitr9L nitr9S,和 nitr9SS放大了PCR和克隆吗 pcDNA3或 pLF。Nitr9 FLAG-Nitr9磁带然后穿梭 pIRES2-EGFP(Clontech)生成: pNitr9L / EGFP, pNitr9S / EGFP pNitr9SS / EGFP pFLAG-Nitr9L / EGFP, pFLAG-Nitr9S / EGFP,和 pFLAG-Nitr9SS / EGFP质粒(图 1)。所使用的引物序列克隆步骤包括在表中 1。质粒转染到人类HEK293T细胞使用Fugene 6(罗氏)根据制造商的指示,收获转染后48小时。

转录变异和Nitr9的表情。(一)外显子组织 nitr9描述三个转录变异基因。下面表示为PCR引物的位置。(b)预测Nitr9蛋白亚型由三个编码 nitr9记录。跨膜域(TM)和免疫球蛋白(的变量(V)和中间(I)类型)Nitr9表示。我域Nitr9作为抗原的抗体生产。Nitr9 TM中的正电荷域是由一个加号。(c) rt - pcr引物的位置(a)检测记录中描述的所有三个 nitr9亚型。(d)定量rt - pcr nitr9引物(表 1),在(a)的职位描述,TaqMan调查横跨一个exon-exon边界揭示的相对水平 nitr9L /秒记录在不同的组织。(e)的示意图表示重组Nitr9表达式构造用于本文。结构包括一个内部核糖体进入序列(IRES2)允许从一个记录两种蛋白质的表达。

 2.5。间接免疫荧光法

HEK293T细胞转染在四室幻灯片(热费希尔科学,罗彻斯特,纽约)。转染细胞被洗在磷酸缓冲盐(PBS)和3%多聚甲醛固定20分钟和50 mM NH和治疗4Cl, PBS 5分钟。细胞然后用1.0% permeabilized triton - x - 100在PBS 5分钟,冲洗和屏蔽1% BSA在PBS为5分钟。与anti-Nitr9 Permeabilized细胞被孵化19,anti-Nitr990年为1小时,或anti-FLAG抗体,与PBS冲洗,孵化和藻红蛋白(PE) anti-mouse IgG抗体和DAPI为1小时(1:1000),并与PBS洗。钱伯斯被移除的幻灯片,和盖玻片安装使用immunomount(热Shandon、匹兹堡、PA)。细胞被拍到在40 x使用徕卡DM5000显微镜放大。

 2.6。流式细胞术

转染HEK293T细胞与anti-Nitr9孵化19,anti-Nitr990年为1小时,或anti-FLAG单克隆抗体,在PBS洗,孵化与allophycocyanin - 30分钟(APC)共轭anti-mouse免疫球蛋白二级抗体。标记细胞被洗然后用3%多聚甲醛固定,进行流量仪分析(BD FACSCalibur BD生物科学,圣何塞,CA)。

 2.7。西方的分析

转染HEK293T细胞洗了PBS和哺乳动物细胞溶解蛋白质提取试剂(m /,皮尔斯,罗克福德,IL)。肾、脾、小肠和鳃从牺牲成年斑马鱼和直接收集到组织蛋白质提取试剂(T-PER,皮尔斯)和蛋白酶抑制剂(皮尔斯)和均相补充。溶菌产物离心去除核,细胞碎片和蛋白质浓度测定(BCA蛋白质化验,皮尔斯)。蛋白质决定12% SDS-polyacrylamide凝胶和转移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜对西方分析。与0.1%渐变膜在Tris-buffered盐水洗20 (TBST)和孵化阻断缓冲区(100毫米硼酸,25毫米Na-Borate, 75毫米氯化钠,山羊血清,5%和5%干奶粉)1小时。一夜之间,膜被孵化主要抗体阻断缓冲区在4°C。主要包括anti-Nitr9抗体90年anti-FLAG (M2)小鼠单克隆抗体(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)anti-GFP鼠单克隆抗体(罗氏)和anti-GAPDH兔多克隆抗体(AnaSpec, Fremont, CA)。膜在TBST洗,其次是孵化与阻断缓冲区和辣根peroxidase-conjugated anti-mouse免疫球蛋白二次抗体(罗氏)或辣根peroxidase-conjugated anti-rabbit免疫球蛋白二次抗体(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)。与TBST洗后,光民- 光 + 免疫印迹基质和检测系统(罗氏)被用来可视化反应。

 2.8。Endoglycosidase治疗

清除溶解产物(20 μg)从转染细胞孵化N-Glycosidase F (F PNGase,新英格兰生物学实验室,伊普斯维奇,MA)为1小时37°C。清除溶解产物(25 μg)沉淀与斑马鱼组织OrgoSOL缓冲区(马里兰州G-Biosciences山庄,密苏里州)和resuspended PNGase治疗的缓冲区PNGase F。

 3所示。结果与讨论 3.1。Nitr9亚型

Nitr9L基因组组织和预测蛋白质结构,Nitr9S, Nitr9SS数据所示 1(一)和 1 (b)。所有三个亚型预计编码I型跨膜细胞表面受体,具有跨膜域内的带正电的残渣。的 nitr9S同种型表达上级在斑马鱼脾、肾、肠比 nitr9L和 nitr9SS亚型,而 nitr9L成绩单在鳃表达最丰富的同种型。成绩单的 nitr9SS在所有四个组织发现在减少水平相对于其他亚型(图 1 (c))。Q-PCR(表 1)是用来确定的相对水平 nitr9L和 nitr9S记录在这些组织以及纯化髓细胞和淋巴(TaqMan底漆/探针组采用本文不检测 nitr9SS成绩单)。合并后的相对表达水平 nitr9L和 nitr9S成绩单是肾脏和肠道的持续高于吉尔(图 1 (d))。然而,的相对表达水平 nitr9L和 nitr9S在脾脏不同生物之间的复制,从水平匹配的肠低水平观察到肾和吉尔。先前报道, nitr9记录存在在更高的水平在斑马鱼淋巴细胞与骨髓细胞( 13]。为了产生单克隆抗体可以检测所有三个Nitr9亚型,小鼠接种细菌表达Nitr9我域(见图 1 (b)),杂种细胞筛选抗体识别的生产重组Nitr9 ELISA、免疫印迹和间接免疫荧光法。两个克隆,19.1.1(文中称为anti-Nitr919)和90.10.5(文中称为anti-Nitr990年),被选作进一步的评估。

 3.2。通过间接免疫荧光法检测Nitr9亚型在转染细胞

为了确定anti-Nitr919和anti-Nitr990年可以通过间接免疫荧光法检测三个亚型Nitr9, HEK293T细胞转染质粒,coexpress EGFP和Nitr9 FLAG-tagged或内源性同种型;通过这种方式,任何细胞表达Nitr9也表达EGFP(图 1 (e))。确保Nitr9重组蛋白可以通过免疫荧光检测,一个anti-FLAG抗体被用来检测所有三个FLAG-tagged亚型的Nitr9转染细胞(图 2(一个))。当时anti-Nitr9显示19和anti-Nitr990年通过免疫荧光识别FLAG-Nitr9L和FLAG-Nitr9S,但是无法绑定(anti-Nitr990年)或绑定有效(anti-Nitr9少19)到FLAG-Nitr9SS(数字 2 (b)和 2 (c))。相比之下,anti-Nitr919和anti-Nitr990年有效地识别所有三个亚型的内生Nitr9当表达转染细胞虽然明显高与anti-Nitr9背景标记的细胞19(图 3)。可能Nitr9SS FLAG-tag扰乱折叠或sterically干扰抗体识别的我FLAG-Nitr9SS领域;这也与西方分析观察(下面讨论)。

检测FLAG-tagged亚型的Nitr9转染细胞间接免疫荧光法。与质粒编码HEK293T细胞转染FLAG-tagged Nitr9亚型和EGFP显示面板的顶部。FLAG-tagged Nitr9蛋白质检测与anti-FLAG抗体(a), (b) anti-Nitr990年或(c) anti-Nitr919和PE共轭二次抗体(红色)。转染细胞可以被EGFP表达(绿色)。DAPI标签所有的细胞核(蓝色)。pIRES2-EGFP父母的质粒是包括作为一个消极的控制。

检测内源性亚型的Nitr9转染细胞间接免疫荧光法。HEK293T细胞转染质粒编码内生亚型Nitr9和EGFP显示面板的顶部。(一)anti-Nitr9 Nitr9蛋白质检测90年或(b) anti-Nitr919和PE共轭二次抗体(红色)。转染细胞可以被EGFP表达(绿色)。DAPI标签所有的细胞核(蓝色)。

 3.3。通过流式细胞仪检测Nitr9亚型在转染细胞

为了确定anti-Nitr919和anti-Nitr990年可以通过流式细胞仪检测Nitr9的所有三个亚型,HEK293T细胞转染质粒编码一个内生或FLAG-tagged Nitr9同种型和EGFP(图 1 (e))。流式细胞仪进行使用anti-FLAG anti-Nitr919,anti-Nitr990年抗体检测Nitr9表达细胞。双正FLAG-Nitr9L表达细胞的百分比(即。,EGFP+和Nitr9+(55 - 63%的EGFP)相似+细胞)当anti-FLAG或anti-Nitr9抗体(图 4(a))。anti-Nitr9抗体识别转染细胞表达的内源性同种型Nitr9L类似EGFP的效率(61 - 73%+细胞)(图 4(b))。

通过流式细胞仪检测Nitr9亚型。HEK293T细胞转染质粒编码FLAG-tagged (a、c和e)或内源性(b、d和f)亚型Nitr9和EGFP如上所示的面板。细胞被贴上一个anti-FLAG抗体(上面一行),anti-Nitr990年(中间行)或anti-Nitr919(底下一行),和一个APC共轭二次抗体。流仪分析是用来检测EGFP积极( X轴)和APC积极( Y轴)细胞。Isotype-matched抗体进行评估作为anti-Nitr9控制转染细胞的抗体,显示没有标签(数据没有显示)。

anti-FLAG单克隆抗体没有绑定FLAG-Nitr9S anti-Nitr919未能检测到抗体Nitr9S或FLAG-Nitr9S-expressing细胞(EGFP的2 - 9%+细胞)(图 4(c)和 4(d))。虽然anti-Nitr990年抗体检测FLAG-Nitr9S (EGFP的31%+细胞),它不能识别内源性Nitr9S (~ 5% EGFP+细胞)。虽然Nitr9S和FLAG-Nitr9S蛋白质是由转染细胞(见图 2和 3和免疫印迹结果低于)他们可能不会有效地表达在细胞表面。来确定细胞表面表达Nitr9S需要coexpression Dap12信号适配器蛋白质,细胞与质粒编码Nitr9S和斑马鱼Dap12 cotransfected。没有增加anti-Nitr9观察到细胞表面标记的抗体(数据未显示)。

anti-FLAG和anti-Nitr919抗体有效绑定FLAG-Nitr9SS (EGFP的57%和31%+细胞,职责)。的anti-Nitr990年抗体绑定FLAG-Nitr9SS失败,可能由于位阻的国旗标签(图 4(e)自anti-Nitr9抗体都有效地识别Nitr9SS (EGFP的65% - -75%+细胞;图 4(f))。

 3.4。Anti-Nitr9 <一口> 90 < /一口>结合Nitr9在西方的所有三个亚型分析

为了评估anti-Nitr9的能力90年抗体检测的三个亚型Nitr9分析西部HEK293T细胞转染质粒编码内生和FLAG-tagged亚型的Nitr9(图 1 (e))。细胞溶解产物受到使用anti-Nitr9免疫印迹分析90年抗体。所有三个亚型的内生Nitr9以及FLAG-tagged Nitr9L和Nitr9S蛋白被发现。绑定模式相当于看到anti-FLAG单克隆抗体阳性控制是明显的(图 5(一个))。然而,anti-Nitr990年没有绑定FLAG-tagged Nitr9SS。正如上面提到的,这可能是由于FLAG-tag阻止访问特定的抗原决定基认可这种抗体。

检测Nitr9蛋白质由西方分析。(一)从HEK293T细胞总蛋白溶菌产物的免疫印迹分析瞬变与质粒转染表达Nitr9同种型和EGFP。质粒编码Nitr9的内生同种型或FLAG-tagged Nitr9如上表示每个车道。主要利用抗体显示在左边,和分子量确定乐队右边所示。Nitr9 anti-FLAG抗体作为一个积极的控制检测、和anti-GFP抗体表明每个质粒的转染效率。注意的总蛋白(底部)加载Nitr9L同种型是不到10倍,Nitr9S和Nitr9SS质粒。曝光时间为化学发光检测每个面板所示。(b) Nitr9L和Nitr9S糖化。免疫印迹分析endoglycosidase-treated总蛋白质的溶解产物从HEK293T细胞,转染质粒编码内生Nitr9亚型。的anti-Nitr990年抗体能识别所有三个Nitr9亚型在预测大小(右)。(c)检测Nitr9从斑马鱼组织蛋白质。免疫印迹分析25 μ克endoglycosidase-treated从斑马鱼组织和HEK293T细胞总蛋白。注意,非特异性带(~ 28 kD)检测在斑马鱼HEK293T细胞以及肾脏和脾脏,蛋白质高的负载。底部面板显示加载控制使用一个anti-GAPDH多克隆抗体。

两种蛋白质乐队被anti-Nitr9检测90年在内源性和FLAG-tagged Nitr9L Nitr9S转染,也受anti-FLAG抗体。两个观察Nitr9L蛋白质迁移的分子量高于预测大小Nitr9L (34 kD),其中一个观察Nitr9S蛋白质是大于预测大小Nitr9S (30 kD)。符合微分糖基化的差异(见下文)。基于化学发光检测所需曝光时间的不同亚型Nitr9, anti-Nitr990年似乎表现出更高的亲和力Nitr9L相比Nitr9S Nitr9SS。在平行实验中,anti-Nitr919抗体没有绑定内生Nitr9S和Nitr9SS蛋白质(数据未显示),没有特点进一步的免疫印迹分析。

 3.5。在转染细胞Nitr9糖基化

Nitr9L Nitr9S Nitr9SS拥有三(NMSC、NDSR NGSK),两个(NMSC和NGSK),和一个(NGSK)候选人N-linked糖基化网站,分别。治疗的溶解产物Nitr9转染细胞与endoglycosidase (PNGase F)的检测结果只有一个预期大小的蛋白质Nitr9L和Nitr9S(图 5 (b))。两组的结果是一致的 在活的有机体内糖基化。Nitr9SS在转染细胞的观察大小似乎没有改变endoglycosidase治疗,检测的局限性,这表明它可能不是糖化。

 3.6。Nitr9蛋白质差异表达在不同组织的斑马鱼

为了确定anti-Nitr990年抗体可以识别内源性Nitr9,溶解产物从成年斑马鱼组织接受endoglycosidase和接受免疫印迹分析(图 5 (c))。Nitr9L和Nitr9S被发现在脾脏的不同层次,肾、鳃、肠。Nitr9SS只发现在脾脏,虽然微弱的乐队也曾被观察到在肠(数据没有显示)。大约28 kD的特异性的乐队在斑马鱼中发现组织以及当anti-Nitr9 HEK293T细胞90年抗体是使用大型总蛋白负载(例如,25岁 μg溶解产物;图 5 (c))。

 4所示。结论

从三个不同的转录变异 nitr9,一个假定的激活NITR基因在斑马鱼,及其相应的蛋白亚型识别和特征。anti-Nitr9的效用19和anti-Nitr990年单克隆抗体间接免疫荧光法检测重组Nitr9被证明了,流式细胞术和免疫印迹分析。抗体具有深刻的认识到三个不同的差异Nitr9亚型。当采用间接免疫荧光法,anti-Nitr9抗体绑定有效和明确表示出来的所有三个Nitr9亚型。anti-Nitr9抗体都是有效的检测细胞表面表达的Nitr9L和Nitr9SS流式细胞术。的anti-Nitr990年抗体识别所有三个Nitr9亚型的免疫印迹分析,虽然高亲和力Nitr9L而著称。当使用anti-Nitr990年与高水平的蛋白质免疫印迹分析,识别特异性的乐队。尽管这种蛋白质的身份仍然是未知的,它可能代表一种守恒的搞笑总科的成员。

显著差异的相对水平Nitr9成绩单和蛋白亚型是显而易见的。虽然PCR分析(图 1 (c))表明, nitr9S可能是主要的mRNA同种型在脾、肾、肠、西方分析证明Nitr9L同种型是主要的蛋白质表达的肾脏。这种差异可能反映了不同的转录和蛋白质稳定性在不同的组织或首选反应的抗体Nitr9L(图 5(一个))。

这里描述的单克隆抗体应该用于进一步评估Nitr9蛋白质含量在斑马鱼组织免疫印迹分析和识别Nitr9表达细胞间接免疫荧光组织部分。工作正在进行中,以净化Nitr9-expressing斑马鱼细胞采用流式细胞仪,以描述其形态和细胞毒性的属性。这些抗体可能也被证明是有用的激活(交联)或阻塞Nitr9在细胞培养和函数 体外功能分析以及解剖isoform-specific NITRs的函数。

 确认

作者感谢布拉德利骨头和凯伦马库斯援助产生杂种细胞,elisa,珍妮特陶氏援助与流式细胞术,Barb普赖尔社论援助。本文是由美国国家科学基金会授予赠款支持(mcb - 0505585 j . a . Yoder)和美国国立卫生研究院(R01 AI057559 g . w . Litman和j . a . Yoder)。

 Biassoni R。 人类自然杀伤细胞受体、共受体及其配体 当前免疫学的协议 2009年 第14章,单位14.10 拉尼尔 L . L。 在钢丝:自然杀手细胞的激活和抑制 自然免疫学 2008年 9 5 495年 502年 2 - s2.0 - 42449102990 10.1038 / ni1581 拉尼尔 L . L。 NK细胞识别 年度回顾的免疫学 2005年 23 225年 274年 约 j . A。 Litman g·W。 自然杀伤细胞受体和认可的系统发育起源:人际关系、可能性和现实 免疫遗传学 2011年 63年 3 123年 141年 2 - s2.0 - 79952480722 10.1007 / s00251 - 010 - 0506 - 4 Litman g·W。 大炮 j . P。 Dishaw l . J。 重建免疫系统:新观点 自然评论免疫学 2005年 5 11 866年 879年 2 - s2.0 - 27744492083 10.1038 / nri1712 约 j . A。 形式、功能和系统发生学NITRs的硬骨鱼 发展和比较免疫学 2009年 33 2 135年 144年 2 - s2.0 - 54849436611 10.1016 / j.dci.2008.09.004 Ferraresso 年代。 库尔 H。 米兰 M。 里奇 d . W。 Secombes c·J。 莱因哈特 R。 Bargelloni l 识别和描述的一种新型免疫型号受体(NITR)基因簇在欧洲鲈鱼Dicentrarchus labrax,揭示了复发性基因,积极扩张和多元化选择 免疫遗传学 2009年 61年 11 - 12 773年 788年 2 - s2.0 - 73949147871 10.1007 / s00251 - 009 - 0398 - 3 德赛 年代。 Heffelfinger 答:K。 奥克特 t M。 Litman g·W。 约 j . A。 青鳉小说免疫型号受体(NITR)基因集群揭示一个非同寻常的变量域的差异程度 BMC进化生物学 2008年 8 1,第177条 2 - s2.0 - 46249107696 10.1186 / 1471-2148-8-177 约 j . A。 穆勒 m·G。 魏 年代。 威廉姆森 b . C。 普莱瑟 d . M。 威利斯 T。 Litman r·T。 Djeu j . Y。 Litman g·W。 免疫型号受体基因在斑马鱼分享遗传和功能性质与哺乳动物的白细胞受体基因编码的集群 美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国 2001年 98年 12 6771年 6776年 2 - s2.0 - 0035811055 10.1073 / pnas.121101598 约 j . A。 Litman r·T。 穆勒 m·G。 德赛 年代。 Dobrinski k P。 蒙哥马利 j·S。 Buzzeo m P。 在线旅行社 T。 Amemiya c . T。 Trede n S。 魏 年代。 Djeu j . Y。 Humphray 年代。 Jekosch K。 埃尔南德斯普拉达 j . A。 Ostrov d . A。 Litman g·W。 解决小说在斑马鱼免疫型号受体基因簇 美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国 2004年 101年 44 15706年 15711年 2 - s2.0 - 8144229687 10.1073 / pnas.0405242101 约 j . A。 大炮 j . P。 Litman r·T。 墨菲 C。 弗里曼 j·L。 Litman g·W。 证据在第二个NITR换位事件在斑马鱼基因簇 免疫遗传学 2008年 60 5 257年 265年 2 - s2.0 - 43049097795 10.1007 / s00251 - 008 - 0285 - 3 Evenhuis J。 Bengten E。 斯奈尔 C。 Quiniou s M。 米勒 n W。 威尔逊 M。 小说描述的附加免疫类型受体通道鲶鱼,Ictalurus毛虫 免疫遗传学 2007年 59 8 661年 671年 2 - s2.0 - 34547485291 10.1007 / s00251 - 007 - 0230 - x 约 j . A。 特纳 p . M。 莱特 p D。 Wittamer V。 贝特朗 j . Y。 特拉弗 D。 Litman g·W。 发展和组织NITRs的表情 免疫遗传学 2010年 62年 2 117年 122年 2 - s2.0 - 76249113234 10.1007 / s00251 - 009 - 0416 - 5 魏 年代。 周 人类。 陈 X。 沙阿 r . N。 刘 J。 奥克特 t M。 特拉弗 D。 Djeu j . Y。 Litman g·W。 约 j . A。 斑马鱼激活免疫受体通过Dap12 Nitr9信号 免疫遗传学 2007年 59 10 813年 821年 2 - s2.0 - 35348911948 10.1007 / s00251 - 007 - 0250 - 6 岛 D D。 沙阿 r . N。 奥克特 t M。 Joshi D。 法律 j . M。 Litman g·W。 Trede n S。 约 j . A。 增强的补充和凝固基因转录缺乏适应性免疫 分子免疫学 2009年 46 7 1505年 1516年 2 - s2.0 - 62549097704 10.1016 / j.molimm.2008.12.021 约 j . A。 奥克特 t M。 特拉弗 D。 Litman g·W。 适配器的结构特点的斑马鱼直接同源分子与跨膜免疫受体 基因 2007年 401年 1 - 2 154年 164年 2 - s2.0 - 34548501297 10.1016 / j.gene.2007.07.014 Livak k·J。 Schmittgen t D。 分析相对用实时定量PCR和基因表达数据 2 − Δ Δ C T 方法 方法 2001年 25 4 402年 408年 2 - s2.0 - 0035710746 10.1006 / meth.2001.1262