一个简单的评估方法在活的有机体内用EdU诱导肺血管增生:mmc诱导的大鼠PVOD病例

摘要

5-乙基-2 ' -脱氧尿苷(EdU)掺入法已成为金标准方法在体外和在活的有机体内增殖细胞的可视化。用于检测的荧光叠氮化物尺寸小，样品渗透程度高。它可以很容易地用于检测大的组织样本或器官外植体的DNA复制，这些组织样本或器官外植体的细胞增殖和周转率较低，以前被认为是处于“末端”分化状态。在这里，我们描述了一种在静止或受损的肺血管系统中定位和识别增殖细胞的方案，在肺静脉闭塞疾病(PVOD)模型中。PVOD是一种罕见的肺动脉高压形式，其特征是小肺静脉的进行性梗阻。我们之前报道了丝裂霉素c (MMC)治疗与人PVOD有关。我们证明了MMC可以诱导大鼠发生PVOD，这是目前唯一能再现人类PVOD病变的动物模型。使用EdU实验，我们证明mmc暴露的肺显示出旺盛的微血管内皮细胞增殖区域，模拟肺毛细血管瘤病，这是人类PVOD的病理标志之一。在活的有机体内肺细胞增殖测量代表了一个有趣的方法，以调查潜在疗效的治疗旨在正常化病理血管增殖。

1.介绍

2008年，Salic和Mitchison [1]基于5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）的掺入及其随后通过Cu（I）催化的[3+2]环加成反应（点击化学）通过荧光叠氮化物的检测，开发了一种检测增殖细胞中DNA合成的方法。这种方法是革命性的，因为EdU标签的检测是高度敏感的，可以在几分钟内完成。EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，在活跃的DNA合成过程中并入DNA，类似于5-溴脱氧尿苷（BrdU）。与BrdU分析相比，EdU方法不需要对螺旋DNA结构进行剧烈的化学或酶破坏，从而能够直接测量S期细胞。消除这一要求可保留螺旋DNA结构和其他细胞表面表位，保留形态结构，并提高再现性[2]．用于检测的荧光叠氮化物体积小，可使标本渗透程度高，允许对大组织和器官外植体的全组装制备进行染色。该方法已经使用多个细胞系进行了测试，优于传统BrdU检测，因为它更敏感，允许在流式细胞术和成像中进行多颜色和多重分析[3.]．因此，该方法可用于量化培养细胞和整个动物器官的增殖[1]．由于这些原因，在动物中使用EdU的情况越来越多，并已在肿瘤疾病的实验模型中报道[4- - - - - -11]、心血管及代谢疾病[12- - - - - -15和神经免疫发育[13，15，16]．

正常的内皮细胞通常被认为是一种遗传上稳定、静止的细胞系[17]．这意味着内皮细胞(EC)的增殖和周转非常低。在这种正常情况下，利用单个时间点(即动物牺牲或组织取样的时间)检测细胞周期激活相关蛋白的方法(如PCNA、Ki67)可能很难测量增殖。相比之下,在活的有机体内在数小时甚至数天内用EdU标记dna复制增殖细胞，可以检测到罕见的增殖事件。因此，我们使用这种技术来跟踪在对照组和受肺静脉闭塞疾病(PVOD)影响的动物中EC的增殖。

PVOD是一种罕见的和破坏性的原因肺动脉高压(PH)。特发性或家族性肺动脉高压(PAH)的特征是毛细血管前小肺动脉(<500)的主要重构μm)典型的复杂病变、丛状病变，而PVOD优先影响毛细血管后的肺静脉血管[18- - - - - -20.]．PVOD与PAH有许多相似之处，从危险因素到临床或血流动力学表现，这很容易导致两者之间的误诊。然而，PVOD的特点是预后不良，并有可能发展为严重的肺水肿的特异性PAH治疗。PVOD的病理特征包括隔膜静脉和隔膜前小静脉的纤维内膜增生与肺泡隔膜内毛细血管增生(也称为肺毛细血管瘤)。

然而，对PVOD的病理生理机制仍然知之甚少，特别是由于缺乏PVOD动物模型，而且很少有研究涉及这种非常罕见的人类疾病的病理生物学[21]．PVOD可能是遗传的，由于双等位基因突变EIF2AK4编码一般控制不可抑制蛋白2 (GCN2)的基因[22]．药物暴露也可以诱发PVOD，法国PH网络最近的一项研究表明，化疗烷基化剂可以触发PVOD的发展[23，24]根据这些观察结果，我们最近证实了丝裂霉素C（MMC）与人类PVOD之间的因果关系，并建立了MMC给药诱导的大鼠PVOD模型[25]．

在大鼠中，MMC暴露诱导肺静脉和毛细血管室优先重构，是目前唯一的PVOD动物模型。mmc诱导的大鼠PVOD也表现为肺泡间隔内明显的毛细血管增生，模拟人类情况。

2.材料和方法

２.１.道德

大鼠被安置在Châtenay-Malabry药学院(ANIMEX平台，Châtenay-Malabry，法国)。实验按照欧盟动物实验法规(Directive 86/609 EEC)进行，并符合我们机构的动物护理和处理指南。动物设施是由法国农业部许可的(协议编号B92-019-01)。本研究得到了动物实验伦理委员会CEEA26 CAP Sud的批准。动物实验由Frederic Perros博士监督(法国农业部动物实验协议编号A92-392)。所有的努力都是为了减少动物的痛苦。

２.２.MMC-Induced PVOD

MMC诱导雌性Wistar大鼠(100 g)发生PVOD，如前所述[25]．

2．3.在活的有机体内细胞增殖实验

为了评估大鼠的细胞增殖，我们观察了外源性提供的5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）的掺入，以鉴定正在进行DNA复制的细胞。(3.1)大鼠处死前24小时腹腔注射EdU，剂量为50 mg/kg。(3.2)血流动力学测量后，大白鼠经主动脉穿刺放血。然后给肺充气通过气管用用PBS(1:1)稀释的冷冻保护剂(10.24%酒精聚乙烯醇，4.26%聚乙二醇)。结扎气管，用2-甲基丁烷冷冻肺部用干冰预冷。(3.3)减少6μM肺切片，冷冻干燥。(3.4)用4%的多聚甲醛(PFA)在室温下固定干燥的肺切片10分钟，用50mm的nhh熄灭PFA固定后的游离醛₄氯溶液。(3.5)用Triton 3%渗透，用PBS将人(10%)和大鼠(10%)血清浸透组织，室温1小时。(3．6)使用click-iT EdU成像套件(C10337, Life Technologies, Saint-Aubin, France)根据制造商的说明检测EdU。(3.7)对内皮细胞标志物、成纤维细胞标志物和平滑肌细胞标志物进行双重免疫染色。肺成纤维细胞可用抗Vimentin-TRITC抗体(Santa Cruz Biotechnology克隆V9)鉴定，肺微血管内皮细胞可用抗CD34抗体标记(克隆QBEnd 10, Dako)，平滑肌细胞可用抗CD34抗体标记α-SMA（克隆1A4），如Ranchoux及其合作者之前所述[26]．(3.8)在荧光显微镜下分析肺切片，定量edu阳性细胞的数量。

2.4.组织学

五个μ如前所述，石蜡包埋的大鼠肺组织切片被Masson三色染色[27]．

3.代表性的结果

３．１．MMC诱导大鼠肺血管重塑，在PVOD患者中发现类似毛细血管瘤病的肺静脉和毛细血管病变

最近，我们描述了第一个由MMC暴露诱导的PVOD相关动物模型[25]．我们在此详细分析了mmc诱导的Masson三色染色的PVOD病变。与对照动脉和静脉相比(图1(一))，观察mmc诱导PVOD大鼠严重肺血管重构。这种重构的特征是肺动脉平滑肌细胞肥大/增生和肺静脉内膜增厚(图)1 (b)和1 (c))我们还观察到远端小动脉和小静脉的新生肌形成和外膜炎症（图1 (e)和1 (f))，而对照组的大鼠通常没有肌肉(图1 (d))．可见肺泡壁增厚灶，提示肺毛细血管瘤(图)1 (g)和1（h）)．最后我们观察肺水肿灶和毛细血管炎(图)1（i）)．在MMC大鼠中观察到的肺泡壁增厚、肺水肿和毛细血管炎的小静脉重塑与在人类患者肺中观察到的PVOD病变非常相似。

(一)

(b)

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(h)

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图1

MMC诱导大鼠肺血管重塑，在PVOD患者中发现类似毛细血管瘤病的肺静脉和毛细血管病变。(a)和(d)对照肺。((b)-(c)， (e) -(i)) mmc暴露肺。(a)控制靠近支气管的肺动脉(Ar)和静脉(V)。((b)-(c))靠近支气管的肺动脉和静脉的两级远端重塑。(d)控制远端微血管(小动脉和小静脉难以区分)(箭头)。(e)由明显的内外弹性纤维划分的远端肺小动脉重塑(蓝色)(箭头)。(f)由单个弹性组织划定的远端肺小静脉重塑(蓝色)(箭头)。(g)-(h)肺泡壁增厚灶，提示肺毛细血管瘤(虚线区域)。(i)肺水肿灶(箭头)和毛细血管炎(箭头)。 ((a)–(i)) Masson’s trichrome stained paraffin-embedded tissue sections: muscle fibers (red), collagen (blue), light red/pink (cytoplasm), and cell nuclei (dark brown/black). Red scale bar = 100 μm.黑色标尺= 50μm。

３.２．mmc暴露的大鼠肺微血管内皮细胞增殖显示区

为了检测大鼠的细胞增殖，我们可视化了外源性EdU的掺入，以识别正在进行DNA复制的细胞。如图所示2，我们在对照肺实质中观察到很少的edu阳性细胞(图2（a） 在MMC暴露的肺中，我们观察到大量的微血管内皮细胞增生灶（图2(b)和2（c） ）（实质CD34+EdU+细胞）。我们还观察到重塑肺微血管中的外膜细胞增殖（图2（d） –2(f))。对成纤维细胞标记物(Vimentin，红色)进行共免疫染色2(h)和2(i))和EdU(白色核=增殖细胞)，我们证实了mmc暴露大鼠外膜成纤维细胞(Vimentin阳性细胞)的异常增殖(图)2(h))比较对照组大鼠(图2(我))。肺细胞增殖总体显著增加(图)2(g)) ()．这些观察证实了在观察到的病变中微血管内皮细胞和成纤维细胞的活跃增殖。这些病变与患者肺中观察到的PVOD病变相似，证实mmc暴露的大鼠是一种有前景的人类PVOD动物模型。

图2

mmc暴露的大鼠肺显示微血管内皮细胞增殖强烈的区域。大鼠冰冻肺切片的免疫荧光染色及共聚焦成像。红色:CD34(内皮细胞)。怀特:α-平滑肌动蛋白(平滑肌细胞)。绿色:点击- it EdU染色(增殖细胞核)。复染= 4 '，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)。(a)对照大鼠肺。(b) - (f) mmc暴露的大鼠肺。(a)对照组大鼠肺实质微血管内皮细胞增殖很少。可见单个内皮细胞增殖(箭头)。((b)-(c)) mmc暴露大鼠肺毛细血管瘤样病灶显示强烈的微血管内皮细胞增殖。(d)小重塑肺动脉外膜成纤维细胞增殖。(e)-(f)小重塑肺静脉外膜成纤维细胞增殖。 (g) Quantification of the percentage of lung proliferating cells. ((h)-(i)) Exuberant adventitial fibroblast cell proliferation in MMC-exposed rats (i) compared to control rats (h) (Vimentin+EdU+ cells). Adventitial fibroblast cells were stained with antibody against Vimentin (fibroblast marker in red) and proliferative cells with click-it EdU (white nuclei = EdU positive nuclei = proliferating cells). Vessel media and adventitia (Adv) were delimited by the yellow dotted line area..红色刻度条=100 μm.白色标尺= 50μm。

4.讨论

细胞增殖分析对于评估细胞生长和细胞分化的改变至关重要，这让人想起许多疾病，包括多环芳烃、PVOD、癌症、系统性高血压和动脉硬化。细胞增殖分析也有助于评估治疗分子的毒性或/和潜在疗效。我们最近证明两种化疗药物（MMC和环磷酰胺）可诱导大鼠PVOD（图1).PVOD主要是由于血管细胞的异常增殖导致肺毛细血管后床的进行性闭塞。使用EdU结合经典免疫染色，我们能够轻松识别增殖细胞群[25]．如图所示2， mmc暴露的肺显示出强烈的血管内皮细胞增殖区域，类似于在人PVOD中发现的毛细血管瘤病。我们还观察到这些动物的肺微血管外膜成纤维细胞增殖。这些观察强调了微血管内皮细胞和外膜成纤维细胞在PVOD发病机制中的重要作用。在活的有机体内用EdU染色测量肺细胞增殖是一项重要的技术，用于研究治疗干预的潜在疗效，旨在逆转病制性血管增殖。

与EdU掺入法相比，BrdU染色法的一个主要缺点是，为了使掺入的BrdU暴露于抗BrdU抗体，需要一个DNA变性步骤，通常是通过盐酸处理或加热。这些严酷的染色条件会破坏组织结构，并可能破坏细胞表位[1，2].通过我们的EdU掺入方案，我们很容易进行三重染色，添加免疫荧光染色α-SMA, CD34和Vimentin，以及EdU染色。

在我们的研究中，EdU在50℃时腹腔注射到大鼠体内 mg/kg，24 然而，根据细胞类型、感兴趣的器官或疾病模型的动物物种和其他参数，需要对方案进行改进，以优化细胞增殖评估。一些作者发现EdU（+）的数量细胞与EdU浓度、培养时间和click反应溶液的体积有关[28]例如，郭等人[12[关键词]大鼠，血管内皮损伤，内皮细胞以5 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg剂量对GK大鼠进行EdU染色。以100 mg/kg剂量多次注射EdU染色效果较好，以200 mg/kg剂量多次注射EdU染色效果较好。在成人神经系统中，Zeng等[29]发现，EdU剂量反应数据显示，EdU标记的细胞数量随着EdU剂量从10 mg/kg增加到200 mg/kg (i.p.)而略有增加。50 mg/kg剂量的EdU导致海马齿状回增殖细胞接近饱和标记。Amano等人还在含有1 mg/mL EdU的饮用水中给小鼠注射了EdU [13]．精确标记增殖细胞所需的时间在活的有机体内也是必需的。例如，在肠等细胞更替率高的器官中，短时间的标记(2小时)就足以确定增殖隐窝细胞的基线位置[30.]．在某些情况下，用户必须注意这种方法的潜在毒性。确实，Andersen等人[31表明，即使在低浓度的EdU条件下，也会严重影响干细胞的存活。

EdU还可用于追踪增殖细胞。Salic和Mitchison [1]用EdU成像小肠绒毛细胞的翻转。在肠绒毛基底部的细胞中，可以强烈检测到EdU染色，这是分裂最活跃的细胞位置。EdU脉冲96小时后，标记细胞增殖并向远端迁移，从绒毛的基部向绒毛的顶端迁移[1]．类似地，Asano等人[32]采用BrdU和EdU双重标记估算小肠上皮细胞迁移率。用BrdU-和EdU阳性细胞分布的中位细胞位置与注射BrdU和EdU的时间间隔的距离除以细胞迁移率。使用这种双重标记技术，他们估计大约是9点和5点μM /h分别为空肠和回肠绒毛细胞迁移率[32]．因此，BrdU和EdU的结合为双dna标记提供了一种简单而可靠的方法。Zeng等[29]用这种双染色方法追踪在不同时间点产生的两组神经元。最后，Salic和Mitchison [1]指出，EdU应有助于细胞染色质的高分辨率电子显微镜研究。电子标记方法确实非常适合于纳米分辨率的细胞DNA光学成像。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

Ranchoux Benoit由LabEx LERMIT支持。Antigny Fabrice获得了阿维桑(ITMO IHP)的博士后资助。Perros Frédéric获得了国家研究资助局(ANR)的资助(Grant ANR-13- jsv1 -001)。

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