机场核心计划 分析细胞病理学 2210 - 7185 2210 - 7177 Hindawi出版公司 10.1155 / 2015/326385 326385年 研究文章 一个简单的方法来评估 在活的有机体内在肺血管增殖EdU: MMC-Induced PVOD老鼠 法布里斯 Antigny 1、2、3 Benoit Ranchoux 1、2、3 瓦莱丽 Nadeau 4 刘 埃德蒙 1、2、3 赛 阀盖 4 弗雷德里克 Perros 1、2、3、4 采场 马蒂亚斯 1 将进医学院学习 大学因为 比塞特尔勒 法国 u-psud.fr 2 AP-HP 中心de参考de l 'Hypertension Pulmonaire严重 Hospitalo-Universitaire(东华大学)胸腔创新 服务de Pneumologie Respiratoire复活 友谊医院Bicetre 比塞特尔勒 法国 aphp.fr 3 umr 999 INSERM和大学因为 Laboratoire d 'Excellence (LabEx)在精心设计的关于药剂et l 'Innovation Therapeutique (LERMIT) 中心Chirurgical玛丽Lannelongue Le Plessis-Robinson 法国 ccml.fr 4 Groupe de高血压Pulmonaire精心设计的 中心de矫揉造作的de l 'Institut德大学医疗Cardiologie et de Pneumologie de魁北克 质量控制 加拿大 iucpq.qc.ca 2015年 9 8 2015年 2015年 26 05年 2015年 26 07年 2015年 28 07年 2015年 9 8 2015年 2015年 版权©2015 Antigny法布里斯et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

5-Ethynyl-2′脱氧尿苷(EdU)合并成为黄金标准方法 在体外和 在活的有机体内可视化的增殖细胞。小号的荧光叠氮化用于检测结果的高度的标本渗透。它可以用来轻松检测DNA复制在大型组织样本或器官移植组织细胞增殖和营业额较低的前被认为是“终端”状态的分化。在这里,我们描述一个协议增殖细胞的定位和识别在静止或受伤的肺血管模型的肺静脉阻塞疾病(PVOD)。PVOD是一种罕见的肺动脉高压,其特征是小肺静脉的进步的阻碍。我们以前报道,mitomycin-C (MMC)治疗与PVOD人类有关。我们证明了MMC诱发PVOD在老鼠,目前是唯一的动物模型,概括人类PVOD病变。使用EdU分析,我们证明了MMC-exposed肺显示区域的微血管内皮细胞增殖的模拟肺毛细管hemangiomatosis人类PVOD的病理特征之一。 在活的有机体内肺细胞增殖测定代表了一个有趣的方法来调查的潜在功效疗法针对病理angioproliferation正常化。

 1。介绍

2008年,积盐和Mitchison [ 1)开发了一种方法来检测在增殖细胞中DNA合成基于整合5-ethynyl-2′脱氧尿苷(EdU)及其后续检测通过荧光叠氮化铜(I)催化[3 + 2]环加成反应(“点击“化学)。这种方法是革命性的,因为检测的EdU标签是高度敏感的,可以在几分钟内完成。EdU的胸苷是一种核苷模拟纳入DNA在活跃的DNA合成,类似于5-bromodeoxyuridine (BrdU)。与BrdU化验,EdU方法不需要苛刻的化学或酶螺旋DNA结构的破坏,使细胞s阶段的直接测量。取消这个需求导致螺旋DNA结构的保护和其他细胞表面抗原表位,形态结构的保护,增加了再现性( 2]。小尺寸的荧光叠氮化用于检测结果标本的高度渗透,使染色的大型组织和器官移植组织包埋的准备。这种方法一直使用几种细胞系和测试是优于传统BrdU检测,因为它是更敏感,允许多色流式细胞术和多元分析和成像( 3]。因此,这种方法可以用来量化在培养细胞增殖以及整个动物的器官( 1]。由于这些原因,埃杜在动物的使用越来越多,在肿瘤疾病的实验模型( 4- - - - - - 11)、心血管和代谢疾病 12- - - - - - 15),neuroimmunologic发展( 13, 15, 16]。

正常的内皮通常被认为是一个遗传稳定,静细胞系( 17]。这意味着有很低的扩散和内皮细胞(EC)的营业额。在正常状态,很难测量扩散的方法,利用检测与细胞周期激活相关的蛋白质(如PCNA、Ki67)在一个单一的时间点(即。,动物祭祀或组织取样的时间)。相比之下, 在活的有机体内标签与EdU DNA-duplicating增殖细胞数小时甚至数天允许检测增殖的罕见事件。出于这个原因,我们使用这种技术来追踪EC扩散控制和动物疾病影响肺部静脉阻塞(PVOD)。

PVOD是一种罕见的和毁灭性的肺动脉高压(PH)的原因。特发性或家族性肺动脉高压(PAH)的特点是主要改造前毛细管的小肺动脉(< 500 μ米)和典型复杂病变,丛状的病灶,而PVOD优先影响postcapillary静脉肺血管( 18- - - - - - 20.]。PVOD与PAH共享许多相似之处,从危险因素临床或血流动力学表现,这很容易导致误诊这两个条件。然而,PVOD特点是预后不良和发展严重肺水肿的可能性与特定的PAH疗法。PVOD的病理特征包括纤维内膜的扩散至隔膜前小静脉与隔静脉和毛细血管增殖肺泡隔内(也称为肺毛细管hemangiomatosis)。

然而,PVOD的病理生理机制仍知之甚少,特别是由于缺少PVOD动物模型,很少有研究解决这个非常罕见的疾病在人类的病理学 21]。由于biallelic PVOD可能遗传突变 EIF2AK4蛋白质编码基因一般控制nonderepressible 2 (GCN2) [ 22]。药物暴露也可以诱发PVOD和法国PH值的网络最近的一项研究表明,化疗可以触发烷基化剂的发展PVOD [ 23, 24]。某些情况下的严重PVOD已报告与mitomycin-C治疗后(MMC)。符合这些观测,我们最近证实MMC和人类PVOD之间的因果关系,开发了一个模型大鼠诱导的PVOD MMC管理( 25]。

在老鼠,MMC暴露诱导优惠重塑肺部静脉和毛细血管的隔间,代表目前PVOD的唯一动物模型。MMC-induced PVOD在老鼠身上也表现为明显的毛细血管增生肺泡隔内模仿人类状况。

 2。材料和方法 2.1。道德

老鼠被安置在药房学院Chatenay-Malabry (ANIMEX平台、Chatenay-Malabry、法国)。实验按照欧盟规定(86/609 EEC指令)动物实验和动物保健和遵守我们机构的指导方针处理。动物设施许可由法国农业部(数量b92协议- 019 - 01)。本研究通过动物实验的伦理委员会Sud CEEA26帽。动物实验是由弗雷德里克博士监督Perros(协议由法国外交部顺着a92号农业动物实验数量的白线- 392)。所有的努力都是尽量减少动物痛苦。

 2.2。MMC-Induced PVOD

PVOD诱导在女性纯种老鼠MMC(100克),如前所述[ 25]。

 2.3。体内<斜体> < /斜体>细胞增殖试验

评价细胞增殖的老鼠,我们可视化的体内提供5-ethynyl-2′脱氧尿苷(EdU),识别细胞进行DNA复制。

EdU腹腔内注入大鼠在50毫克/公斤,牺牲前24小时。

血流动力学测量后,河鼠通过主动脉穿刺抽血。然后,增加肺部 通过气管cryoprotector介质(10.24%酒精聚乙烯醇,4.26%聚乙二醇)在PBS稀释(1:1)。结扎肺部的气管和快速冷冻2-methylbutane预冷/干冰。

减少6 μm肺部分使用cryotome和空气干燥。

修复干肺部分与多聚甲醛(PFA) 4% 10分钟在室温和淬火免费醛组与50 mM NH PFA固定4Cl的解决方案。

Permeabilize Triton 3%,浸透了组织人力(10%)和PBS的鼠血清(10%)在室温下1小时。

使用点击它检测EdU EdU成像设备(C10337,生命技术、Saint-Aubin法国)根据制造商的指示。

执行双重免疫染色对内皮细胞标记、成纤维细胞和平滑肌细胞标记。肺成纤维细胞可以识别使用抗体Vimentin-TRITC(圣克鲁斯生物技术克隆V9),肺微血管内皮细胞可以使用抗体标记CD34(克隆QBEnd 10, Dako)和平滑肌细胞可以使用抗体标记 αsma(克隆1 a4)如前所述,Ranchoux和合作者 26]。

荧光显微镜下分析肺部分量化EdU-positive细胞的数量。

2.4。组织学

五 μ石蜡包埋的m部分大鼠肺组织沾着马森的三色的如前所述[ 27]。

 3所示。代表性的结果 3.1。MMC诱发大鼠肺血管重建,与肺部静脉和毛细血管病变模仿毛细管Hemangiomatosis PVOD病人中找到

最近,我们首先描述了有关动物模型PVOD MMC暴露引起的( 25]。我们在这里描述的精细分析MMC-induced PVOD病变沾马森的三色的。而控制动脉和静脉(图 1(一)),我们观察到严重的肺血管重建在老鼠MMC-induced PVOD。这个重构的特点是平滑肌细胞肥大和增生肺动脉和肺静脉的内膜的增厚(数字 1 (b)和 1 (c))。我们还观察到neomuscularization和外膜炎症的小远端动脉和小静脉(数字 1 (e)和 1 (f)),通常不是muscularized控制老鼠(图 1 (d))。有焦点的肺泡壁增厚提示肺毛细管hemangiomatosis(数字 1 (g)和 1 (h))。最后我们观察到病灶性肺水肿和毛细管炎(图 1(我))。肺泡壁增厚的小静脉的改造与焦点,肺部水肿,毛细管炎在MMC老鼠非常类似于PVOD病变观察到在人类患者肺部。

MMC诱发大鼠肺血管重建,与肺部静脉和毛细血管病变模仿毛细管hemangiomatosis PVOD病人中找到。((a)和(d))控制肺。((b) - (c)、(e) - (i)) MMC-exposed肺。(一)控制肺动脉(Ar)和静脉(V)靠近支气管(Br)。((b) - (c))重建的肺支气管动脉和静脉近distality的两个层次。(d)控制远端微血管(小动脉和小静脉是无法区分)(箭头)。(e)改制的远端肺小动脉由明显的分隔开的内部和外部的弹力(蓝染色)(箭头所指)。(f)改造由单一弹力分隔开的远端肺小静脉(蓝染色)(箭头所指)。((g) - (h))焦点的肺泡壁增厚提示肺毛细管hemangiomatosis(虚线区域)。(我)焦点肺水肿(箭头)和毛细管炎(箭头)。 ((a)–(i)) Masson’s trichrome stained paraffin-embedded tissue sections: muscle fibers (red), collagen (blue), light red/pink (cytoplasm), and cell nuclei (dark brown/black). Red scale bar = 100  μ= 50 m。黑色标度酒吧 μm。

 3.2。MMC-Exposed鼠肺显示区域的微血管内皮细胞增殖

为了检查细胞增殖的老鼠,我们可视化的外生EdU识别细胞进行DNA复制。如图 2,我们观察到很少EdU-positive细胞在肺实质控制(图 2(a))。MMC-exposed肺中,我们观察到许多焦点的微血管内皮细胞增殖(数字 2(b)和 2(c))(实质CD34 + EdU +细胞)。我们也观察到外膜细胞增殖在改制的肺微血管(数字 2(d) - 2(f))。对成纤维细胞标记(使用co-immunostaining波形蛋白,用红色(数字 2(h)和 2(我)))和EdU =增殖细胞核(白色),我们确认外膜成纤维细胞的异常增殖(波形蛋白阳性细胞)MMC-exposed老鼠(图 2(h))相比,控制老鼠(图 2(我))。整个肺部细胞增殖显著增加(图 2(g)) ( P < 0.001 )。这些观察结果证实一个活跃的微血管内皮细胞和成纤维细胞的增殖观察病变。这些病变类似PVOD病变观察到病人肺部并提供确认MMC-exposed人类PVOD的老鼠是一个有前途的动物模型。

MMC-exposed鼠肺显示区域的微血管内皮细胞增殖。Immunofluorescent染色的冷冻大鼠肺部分和共焦成像。红色:CD34(内皮细胞)。怀特: α光滑的肌肉肌动蛋白(平滑肌细胞)。格林:点击它EdU染色(细胞核增殖细胞)。复染色= 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。(一)控制老鼠的肺。((b) - (f)) MMC-exposed鼠肺。(一)控制鼠肺实质显示很少的微血管内皮细胞增殖。注意单个内皮细胞在增殖(箭头所指)。((b) - (c))肺毛细管hemangiomatosis像焦点从MMC-exposed老鼠显示强烈的微血管内皮细胞增殖。(d)外膜成纤维细胞增殖在小改制的肺动脉。((e) - (f))外膜成纤维细胞增殖在小装修好的肺静脉。 (g) Quantification of the percentage of lung proliferating cells. ((h)-(i)) Exuberant adventitial fibroblast cell proliferation in MMC-exposed rats (i) compared to control rats (h) (Vimentin+EdU+ cells). Adventitial fibroblast cells were stained with antibody against Vimentin (fibroblast marker in red) and proliferative cells with click-it EdU (white nuclei = EdU positive nuclei = proliferating cells). Vessel media and adventitia (Adv) were delimited by the yellow dotted line area. P ∗ ∗ ∗ < 0.001 。红酒吧= 100 μ= 50 m。白色规模酒吧 μm。

 4所示。讨论

细胞增殖的评估分析是至关重要的改变细胞生长和细胞分化,这让人想起许多疾病,包括多环芳烃,PVOD,癌症,系统性高血压和动脉硬化。细胞增殖分析也有助于评估毒性或/和分子治疗的潜在功效。我们最近表明,两种化疗药物(MMC和环磷酰胺)可能诱发PVOD老鼠(图 1)。PVOD主要是由于进步的阻塞肺postcapillary床由于血管细胞的异常增殖。使用EdU结合古典疣状,我们能够很容易地分辨出增殖细胞群( 25]。如图 2、MMC-exposed肺显示区域的微血管内皮细胞增殖,模仿人类PVOD毛细管hemangiomatosis发现。我们还观察到外膜成纤维细胞细胞增殖的改造这些动物的肺微血管。这些观察突出微血管内皮细胞的关键作用和外膜成纤维细胞在PVOD的发病机理。 在活的有机体内肺细胞增殖测定与EdU染色法是一种重要的技术调查的潜在疗效的治疗干预旨在扭转病理angioproliferation。

与EdU公司相比,BrdU染色方法的主要缺点是要求DNA变性步骤,通常由盐酸处理或加热,为了揭露合并BrdU anti-BrdU抗体。这些恶劣的染色条件可以破坏组织结构和潜在的破坏细胞抗原表位( 1, 2]。与我们的EdU公司协议,我们很容易能够执行三染色,增加immunofluorescent染色 αsma、CD34和波形蛋白,除了EdU染色。

在我们的研究中,埃杜在腹腔内注入老鼠50毫克/公斤,牺牲前24小时。然而,根据细胞类型,感兴趣的器官,或其他疾病的动物模型和参数,协议需要精细胞增殖的最佳评估。一些作者发现EdU(+)细胞的数量与EdU浓度、培养时间,点击反应溶液的体积( 28]。例如,郭et al。 12)使用EdU模型中导管球囊损伤后新生内膜形成的门将和Wistar鼠。EdU的GK大鼠进行染色越来越剂量的5毫克/公斤,25毫克/公斤,50毫克/公斤,100毫克/公斤和200毫克/公斤(i.p)。更好的染色结果与多个EdU注射在100毫克/公斤,没有更好的结果和200毫克/公斤。在成年人的神经系统,曾庆红et al。( 29日]发现EdU剂量反应数据显示EdU-labeled细胞数量略有增加EdU剂量从10增加到200毫克/公斤(i.p)。50毫克/公斤剂量的EdU附近导致饱和标签的增殖细胞海马齿状回的。天野之弥等人也给老鼠EdU饮用水中含有1毫克/毫升EdU [ 13]。细化所必需的时间标签增殖细胞 在活的有机体内也是必需的。例如,在器官如肠细胞汰换率高,短时间内的标签(2小时)足以指定一个基线的位置增殖隐窝细胞( 30.]。在某些情况下,用户必须注意该方法的潜在毒性。事实上,安徒生et al。 31日)表明,干细胞生存严重受损后EdU公司即使在EdU浓度较低。

EdU也可以用来追踪细胞增殖。硅铝质和Mitchison 1EdU)用于图像细胞营业额在小肠绒毛。EdU染色细胞中可以检测到强出席肠道绒毛的基地,这是细胞分裂最活跃的位置。EdU脉冲后九十六小时,标记细胞增多和远侧地迁移,远离的绒毛对他们的技巧 1]。同样,浅野et al。 32双与BrdU标记和EdU)用于评估小肠上皮细胞迁移速度。细胞迁移率计算除以平均细胞的位置之间的距离的分布BrdU——和EdU-positive细胞注入BrdU和EdU之间的时间。利用这种双重标记技术,他们估计大约9和5 μm / h的细胞迁移率绒毛在空肠和回肠,分别为( 32]。因此,BrdU和EdU,与此同时,提供了一个简单的和健壮的方法来执行double-DNA标签。曾庆红et al。( 29日这种双重染色法)用于跟踪两个种群生成的神经元在不同的时间点。最后,撒利族的和Mitchison [ 1说EdU应该促进细胞染色质的高分辨率的电子显微镜研究。EdU-labeling方法的确会适合细胞DNA纳米分辨率的光学成像。

 利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

 确认

支持Ranchoux Benoit LabEx LERMIT。从Aviesan Antigny法布里斯支持博士后格兰特(ITMO IHP)。Perros Frederic从国家获得资金资助研究机构(ANR)(批准ANR - 13 - jsv1 - 001)。

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