文摘

β-还原酶抑制剂的识别、他汀类药物药理调制的代表一个戏剧性的创新高胆固醇血症和相关的心血管疾病。然而,并不是所有的病人都接受他汀类药物实现方案的低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的目标,特别是在高的风险。因此,还有一个尚未被满足的医疗需求开发额外的耐受和有效的代理来降低低密度脂蛋白胆固醇水平。发现proprotein转化酶枯草杆菌蛋白酶/可馨类型9 (PCSK9),一种分泌蛋白,转录后的调控水平的低密度脂蛋白受体(LDLR)诱导其退化,开启了一个新时代的药理调制胆固醇体内平衡。本文总结了当前知识的基本分子机制的监管效果LDLR PCSK9获得的表达式在体外细胞培养研究和分析PCSK9的晶体结构。它还描述了流行病学和实验证据PCSK9的监管效果的低密度脂蛋白胆固醇水平和心血管疾病和总结了不同的药理方法正在开发抑制PCSK9表达式,处理,并与LDLR的交互。

1。发现Proprotein转化酶枯草杆菌蛋白酶/可馨类型9

在特定氨基酸分子内蛋白水解处理网站是一种常见的转译后的修改需要正确处理和/或激活的前体蛋白生物活性形式。人类基因组的分析允许注释共有553个基因编码蛋白酶或蛋白酶同系物1]。蛋白酶通常分类根据活性位点残基的反应机制和本质参与机制丝氨酸蛋白水解作用,半胱氨酸,天门冬氨酰,锌金属蛋白酶。的proprotein转化酶的丝氨酸蛋白酶对蛋白水解处理负责大量的多肽激素,生长因子及其受体、粘附分子,酶和各种蛋白质。这个家庭的蛋白酶是由七个已知基本氨基酸acid-specific蛋白酶(PC1/3、PC2 PC4, PACE4, PC5/6,和PC7)和两个非基本氨基酸acid-specific转化酶,SKI-1和神经apoptosis-regulated convertase-1 (NARC-1)也称为proprotein转化酶枯草杆菌蛋白酶/可馨类型9 (PCSK9) [2]。PCSK9 Seidah博士等人首次被发现通过搜索,与蛋白质爆炸计划,简称守恒的段内的相似性SKI-1催化亚基(3]。这种方法是,考虑到处理网站的存在并不是被已知proprotein转化酶(4]。从专利数据库,一个假定的转化酶识别,以前克隆的两个不同的制药公司,名为神经apoptosis-regulated转化酶1 (NARC-1;千禧年制药、剑桥,妈,专利号我们01/57081 A2)和LP251(礼来,专利号我们02/14358 A2)。

NARC-1 / PCSK9当时显示属于蛋白酶K subtilases亚科,是合成可溶性发酵菌,进行催化分子内处理的内质网(5]。PCSK9编码692个氨基酸糖蛋白与整个域结构类似于其他proprotein转化酶家族成员,包括一个信号肽、prodomain, subtilisin-like催化域和一个变量c端域(称为V-domain)褶皱以前未观察到subtilisin-like丝氨酸蛋白酶(6]。PCSK9包含一个催化三分子(Asp^186年,他的^226年和爵士^386年),添加好其他枯草杆菌蛋白酶的催化三合会(3,7,8]。PCSK9处理发生在分泌通路,autocleavage生成一个稳定PCSK9异质二聚体组成的14-kDa prodomain片段和一个成熟57-kDa片段包含催化和c端域(9]。因此,变异的守恒的丝氨酸(Ser386)催化三分子PCSK9防止自催化裂解导致保留的蛋白质在内质网(8,10]。Coexpression在反式prodomain和催化的片段,WT或催化死突变^386年的分泌,导致PCSK9 [9]。这证据进一步证明了自催化的要求处理和正确关联PCSK9 prodomain和催化领域的一个适当的折叠和分泌的蛋白质。因此,需要prodomain PCSK9分泌,因此正确的折叠作为监护人分子PCSK9 [11- - - - - -13]。

虽然第一次被报道,zymogen-processing PCSK9是位于低浓缩铀^82年 (YVVVlKEETHL,突显出L表示P1乳沟位置),具体方法的microsequencing PCSK9的分泌形式从Hek293 HepG2细胞和SELDI-TOF分析允许在SSVFAQ识别正确的裂解位点^152年 SIP (5]。这些结果被证实在老鼠NARC-1蛋白(8]。

不同于其他成员proprotein转化酶家族,第二个催化裂解是需要发布prodomain和活性的蛋白酶11),没有网站PCSK9的中等解理已被确认。尽管如此,PCSK9被发现被furin催化裂解,灭活的一员proprotein转化酶家族(14,15]。下两个在体外和在活的有机体内实验条件,PCSK9被发现在RFHR裂解^218年 网站内furin暴露和灵活的催化域的循环(7]。这裂导致的蛋白质和超然的prosegment [15]。

本机PCSK9的晶体结构紧密绑定prodomain透露,预计呈现活跃的站点无法访问外源性底物(7,16,17]。事实上,的四个c端氨基酸prodomain(残留149 - 152)结合催化基团,进一步稳定在这个位置在prodomain的n端通过一个扩展。然而,一些蛋白水解活性PCSK9已经检测到细胞溶解产物总量和培养媒体主要鼠肝细胞和人类肝细胞永生化用fluorogenic衬底裂解位点(对应8,18]。分析不适合等离子体的样品一样。PCSK9的催化活性细胞溶解产物或条件媒体大约是100倍高于重组蛋白,这表明prodomain PCSK9可能留下一些访问产生的内生衬底槽(18]。最后一个域(V-domain)是由三个子域链每三个内部稳定的二硫键。这一领域的特殊性,达到组氨酸域。

分析组织PCSK9基因敲除小鼠表示,几乎所有循环PCSK9来源于肝脏(19]。在人类中,PCSK9的血浆水平随非常广泛(~ 100倍)在正常,显然健康个体,从最低33 ng / mL 2988 ng / mL (20.]。平均水平明显高于被发现女性比男性(517 ng / mL) (450 ng / mL) (20.]。很大一部分的循环PCSK9与脂蛋白有关,包括高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)但不是很低密度脂蛋白(VLDL) [21]。

在成年期和组织分布分析个体发生在老鼠和老鼠,北部的屁股和原位杂交组织化学,表明PCSK9 mrna也出现在其他组织包括肾脏、小肠和小脑3,19]。通过定量实时聚合酶链反应(rt - PCR), PCSK9也检测到鼠标perigonadal脂肪组织(水平~ 160倍低于肝脏)(22),在小鼠主动脉(丰富~ 60倍低于肝),和在小鼠胰岛细胞(~ 3重低于肝)23]。PCSK9的存在在胰腺中就证实了免疫组织化学分析和限制pancreatingδ肽和缺席α- - -β肽(23]。在人类的十二指肠和回肠,共焦显微镜分析显示PCSK9表达几乎只在肠上皮细胞和杯状细胞的上皮屏障24]。通过微阵列和实时PCR分析,PCSK9信使rna也发现,尽管在低水平,在人类动脉粥样硬化(25),最近,我们组PCSK9蛋白质在人类动脉粥样硬化斑块的检测报告,通过免疫印迹和免疫组织化学分析(26]。

在培养细胞,PCSK9被证明是高度表达的老鼠和人类肝细胞(主要肝细胞和以下细胞株HepG2 McA-RH7777,或HuH7) (27- - - - - -31日),但也从其他细胞类型不同的起源。考虑到血管系统,既有人类平滑肌细胞(26)和血管内皮细胞(HUVEC)显示表达PCSK9 [26,32),而没有发现PCSK9的检测量通过rt - pcr分析在人类或鼠标单核细胞和巨噬细胞26,30.]。PCSK9的定位也在人类结肠检查,enterocyte-like细胞系,CaCo-2,发现这些细胞内染色主要出现在顶端室(24]。

2。PCSK9与LDLR和驱动其退化

常染色体显性高胆固醇血症(抗利尿激素)是一种脂质代谢的遗传疾病,特点是选择性增加低密度脂蛋白粒子在等离子体(II型高脂蛋白血症),引起肌腱和皮肤黄色瘤,arcus缘,从心血管并发症过早死亡33,34]。Goldstein和布朗确定第一个基因与抗利尿激素,如细胞表面低密度脂蛋白受体(LDLR) [35]。其他基因突变也可以产生类似的表型抗利尿激素,例如,家族性缺陷阿朴脂蛋白(apo) b - 100是由于缺陷飞机观测基因,编码LDLR的配体(36]。第三个基因参与ADH当时位于染色体1 p34.1-p32通过研究一个法国家庭和12个额外的白人家庭来自法国、奥地利、西班牙、比利时和新西兰的参与LDLR和飞机观测是被排除在外的37]。同一地区重叠被发现与严重高胆固醇血症在犹他州家族(38]。2003年Abifadel等人描述了两个PCSK9基因的突变与常染色体显性相关高胆固醇血症(39]。这导致分类PCSK9的第三与家族性常染色体显性高胆固醇血症相关基因,发病率约为2.3%左右,在一起LDLR(~ 67%)发生率和飞机观测(~ 14%)发生率。这两个突变,S127R F216L,确定在法国家庭,被证明是“增益函数”等位基因占主导地位的方式,(5,40]。S127R突变驻留在主前肽和公认的二次发酵菌处理的场所,而F216L位于接近活性部位,这是在他的^226年(39]。三个“丧失功能”无意义突变,Y142X, C679X,和R46L PCSK9被发现的基因分型方法在13761年进行的主题(10045 3716白人和黑人)(41]。血浆总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇明显降低受试者中窝藏PCSK9的无义突变,但高密度脂蛋白胆固醇的水平是相似的在航空公司和非41]。

直接示范表明,PCSK9对低密度脂蛋白胆固醇的影响是依赖的LDLR表达式按规定通过三个独立团体使用在体外和在活的有机体内实验方法。PCSK9的参与脂质代谢与三行是由一个研究老鼠(SREBP-2 SREBP-1a转基因,转基因和基因敲除对SCAP)确认PCSK9的33基因受固醇调节元件结合蛋白(如)转录因子42]。从这些证据,Sahng等人证明PCSK9 HepG2细胞或超表达体内,通过adenoviral注入老鼠体内,强烈会使LDLR表达而不影响飞机观测分泌和处理,如10]。快速蛋白液相色谱(FPLC)血浆胆固醇的老鼠注射一种腺病毒表达PCSK9清晰显示增加低密度脂蛋白分数没有影响高密度脂蛋白;这种效应是LDLR的存在依赖的,因为不影响FPLC概要文件在LDLR空鼠(10]。LDLR的依赖PCSK9的hypercholesterolemic效果超表达当时确认其他团体(28,43],虽然显著增加胆固醇低密度脂蛋白分数LDLR null老鼠也被报道(5]。

在这些实验证据PCSK9 null老鼠生成(44]。PCSK9 null小鼠肝LDLR表达显著高于hypocholesterolemic VLDL,低密度脂蛋白,高密度脂蛋白减少(44]。放射性标记的低密度脂蛋白间隙的测定表明,所需的时间减少了50%^125年I-LDL是12分钟PCSK9零老鼠和超过60分钟在WT老鼠44),这表明PCSK9负面影响低密度脂蛋白小鼠肝摄取。

从这些证据得出PCSK9影响LDLR的表情,但这一行动是否由循环或细胞内PCSK9还待定。这个问题很好地解决了使用转基因小鼠overexpressing人类PCSK9 apoE启动子与WT parabiosed老鼠(下31日]。间生态研究的结果提供了明确的证据表明,PCSK9可以在等离子摧毁LDLR肝脏功能。此外,Lagace等人清楚地证明,通过脉冲追踪实验,PCSK9迅速(2 h)和有效地处理从74 kDa的前体形式成熟催化裂解片段的60 kDa,分泌细胞(31日]。类似的实验也表明,过度的PCSK9并不影响合成的LDLR HepG2细胞(30.]。PCSK9显示,通过coimmunoprecipitation实验,直接与LDLR交互在细胞表面和内化,LDLR,后期endocytic-lysosome亚细胞的隔间(31日,45]。LDLR的PCSK9的内化成endosomal /溶酶体舱PCSK9减少LDLR所需蛋白质的水平,因为这个活动是阻塞在缺乏ARH [31日,45- - - - - -49]。然而,更极端的实验条件下,PCSK9强烈调节由adenoviral感染,记录,第二个为LDLR降解细胞内途径PCSK9 post-ER隔间内可能发生没有涉及到蛋白酶体和溶酶体半胱氨酸蛋白酶(30.]。细胞内途径似乎是独立于功能性ARH蛋白质的存在(10,50]。因此,最多一天两种不同途径PCSK9-dependent LDLR退化已经描述,仍然需要根据它们的相对贡献的病理和生理条件下人类。自然发生比WT PCSK9 PCSK9突变体也可能不同。例如,功能获得突变体D374Y似乎不是那么有效分泌的细胞虽然会使LDLR更有效地比WT (5,31日]。

3所示。结构要求PCSK9-Mediated LDLR的退化

后证明PCSK9直接结合到细胞表面LDLR [31日),进行了进一步的研究,以定义哪些域这两个蛋白的参与互动和pH值的变化如何改变复杂的构象。通过hek - 293细胞中表达LDLR每个配体结合的重复,删除部分和表皮生长因子以重复(EGF), b和c,张等人发现PCSK9结合EGF-A LDLR的域51]。氨基EGF-A重复包含钙ion-binding站点区域协调的残留N^295年E^296年D^310年,Y^315年(52- - - - - -54]。残留D^310年是显示所需的绑定PCSK9 EGF-A。

绑定PCSK9的LDLR被证明是依赖、pH值5.2 pH值要明显高于中性pH值(51]。的值之间的交互PCSK9和LDLR计算在不同pH值(7,55]。PCSK9蛋白的亲和力,WT或突变体,为LDLR pH值5.3是至少150倍高于pH值7.4导致值低摩尔范围(7,55]。VLD和低密度脂蛋白被证明影响PCSK9的LDLR绑定,虽然他们绑定域名是有别于PCSK9的配体结合重复,分别和EGF-A域(55]。如何低密度脂蛋白VLDL干扰PCSK9的亲和力和LDLR仍然需要确定,但它被假定低密度脂蛋白可能导致受体的构象变化(即。别构效应)或减少PCSK9的可访问性对LDLR的结合位点。

这些结果表明,循环低密度脂蛋白的水平可能影响PCSK9-lowering LDLR的表达式。在这方面,值得提到的是,LDLR PCSK9的亲和力是显著降低(= 170 - 628 nM) [7,55]比低密度脂蛋白((=做海里)56- - - - - -58],PCSK9的人血浆浓度(0.3g / mL) (59)远低于低密度脂蛋白(~ 2.8M飞机观测;~ 1500g / mL) (60]。因此低密度脂蛋白似乎主要角色绑定到LDLR PCSK9相比,尽管存在过多的低密度脂蛋白,完全抑制PCSK9绑定已观察到LDLR,表明PCSK9可能得益于coreceptor或细胞表面分子的绑定LDLR [61年]。LDLR绑定的低密度脂蛋白和PCSK9竞争更加复杂,如果我们认为PCSK9可能self-associate形成二聚体和三聚秀LDLR降解活性高于单体PCSK9 [21]。

细胞外的结晶域LDLR的pH值5.3提供了一个可能的解释PCSK9绑定如何干扰受体回收(62年]。LDLR的配体结合重复扩展在中性pH值(开放构型),允许与循环脂蛋白在细胞表面(图1)[62年]。绑定后脂蛋白,receptor-ligand复杂内化并交付给一个核内体(低pH值),在配体结合重复4和5组成一个紧密关联的β上EGF区域前兆同源域(封闭的构象),导致释放粒子的脂蛋白和交付到核内体。LDLR的细胞外领域的孵化PCSK9完全抑制蛋白重排观察到当pH值变化从7.4到6.0,而PCSK9的洗脱模式并非pH值依赖(63年]。

复杂的PCSK9 / LDLR结晶,详细分析了(61年]。LDLR显示一个扩展的构象,L7-EGF (A) egf (B)地区出现设置突出的β与维度上非常类似于脂质重组LDLR观察到中性pH值(64年与封闭环状结构)和对比观察到低pH值(62年]。始终与数据报告的Zhang et al。63年),PCSK9采用相同的结构在任何pH值考虑(7,16,17,61年]。大部分的联系人,在pH值为7.0,PCSK9与LDLR PCSK9之间发生催化域和LDLR EGF-A域,导致大约1000²接口(61年,65年,66年]。扩展到封闭的受体构象之间的转变是由于旋转的残留物^376年,短链接器(一个铰链^373年VGSIA^378年)连接EGF-Bβ上(61年]。因此,一旦进入endosomal低ph值环境,增加亲和力PCSK9 / LDLR的互动减少了复杂的分离(17,55,61年],LDLR配体之间的接触可能会形成约束力的重复和PCSK9 c端域(图1)[67年]。PCSK9,持有的LDLR扩展构象,干扰的形成分子内相互作用- 5单元和β上从而阻碍释放和回收的受体细胞膜(图1)。

证据,因此,符合PCSK9的分泌形式直接绑定到LDLR和导致退化endosomal /溶酶体隔间内的受体,排除PCSK9的参与催化活性。事实上,WT PCSK9和催化死突变S386A可以减少,在相似的程度,LDLR HepG2细胞表达(9]。此外,除了提高亲和力的突变D374Y PCSK9在LDLR的降解效率,改善了催化活性突变PCSK9的容量,降低LDLR。这些证据进一步支持这样的结论:绑定PCSK9的LDLR促进LDLR的退化通过一个机制,不需要PCSK9的蛋白水解活性9]。

EGF前体的总体结构同源域在VLDLR LDLR,类似,尽管有这些类似之处,初步研究表明,PCSK9不绑定到VLDLR在COS-M细胞测定细胞类型(51]。相比之下,一个独立的研究对其他三名细胞系(hek - 293, NIH 3 t3, CHO-A7)清楚地展示了退化VLDR和ApoER2 PCSK9 [68年]。不同培养时间或程控响应,可能由于不同的适配器蛋白质表达水平,比如ARH LDLR和Dab1 ApoER2和VLDLR69年),也许可以解释这个明显的差异。PCSK9的绑定这两个受体随后证实了使用重组蛋白绑定测定游离(放大发光接近同质分析)[70年]。PCSK9的绑定VLDLR或有效地抑制了LDLR EGF-A域,而与ApoER2交互是影响较小70年]。

4所示。自然PCSK9发生变异,与血浆低密度脂蛋白胆固醇的水平

原法国家庭(HC2)窝藏PCSK9突变显示大ADH血统组成三代(39]。所有受影响的成员的特点是总胆固醇水平超过第97.5百分位相比,法国个人年龄和性别相匹配。这两个渊源者分析是确定在17岁和40岁236 mg / dL和312 mg / dL的低密度脂蛋白胆固醇,分别为(39]。定位克隆分析相同的法国家庭导致PCSK9的第一个突变的识别^127年R)与抗利尿激素(39]。通过一个系统的双向测序的12个外显子PCSK9在22个渊源者与抗利尿激素,第二次突变被发现(氨基酸替换F^216年L) (39)(表1)。突变都因此分为功能获得突变体。

PCSK9的机制(S^127年R)蛋白质导致高胆固醇血症已被认为是由一个细胞内绑定LDLR [78年),因为这种氨基酸替换延迟自催化裂解和分泌5,只有适度增加亲和力的LDLR [7,55]。然而,最近的证据表明,PCSK9 (S^127年R)主要功能通过高亲和力LDLR在细胞表面,增加其降解[88年]。不同,F^216年L突变边界LDLR相似的亲和力与野生型PCSK9在pH值(7),这表明存在多个机制,各种功能获得突变体增强PCSK9的活动。在这方面,F^216年L突变已被证明导致的部分损失在主题RFHR furin / PC5/6A处理^218年 导致PCSK9的失活14,15]。然而,它不能被排除在外,除了相对耐furin处理,高胆固醇血症与F表型相关^216年L突变也可能是由于其他还未定义的属性的这个特殊的突变。

两个附加PCSK9基因突变(D^374年Y和N^157年K)被发现在挪威科目家族性高胆固醇血症的临床诊断(84年),在犹他州的血统也观察到同样的突变(83年]。PCSK9 D^374年Y已经广泛的特点,代表了最著名的PCSK9的功能获得突变。其获得的功能属性的结果高亲和力的LDLR生理(pH值7.4)或低pH值(pH值5.0)(7,31日]。不同,获得的功能效应的原因PCSK9 N^157年K变异仍然需要确定(5]。

对胆固醇体内平衡力量PCSK9的角色,更多的基因组分析以识别灭活(损失函数)突变患者血浆低水平的低密度脂蛋白胆固醇(80年]。从达拉斯心脏研究受试者,达拉斯县的概率多民族人口样本(52%的非洲裔美国人,29%欧洲美国“黑色,”,“白色”,西班牙人17%,其他种族2%)(89年]。DNA测序确定了两个无意义突变,替换C^426年G和C^2037年一个非洲裔美国人的主题。两种突变引入停止密码子在142 (Y残渣^142年679 C (X)和残渣^679年X) (80年)(表1)。Y^142年X突变似乎目前只在非裔美国人的发病率为0.4%,而认为没有其他少数民族研究港口同样的突变。C^679年X突变被发现普遍地在非洲裔美国人(1.4%)和不经常在欧洲的美国人(≤0.1%)和西班牙裔(≤0.2%)。类似这些突变的发生率也观察到在不同的人口样本的非裔美国人80年]。有趣的是,一些健康的人是PCSK9无效等位基因纯合子被描述,和其中一个人带着两个厕所功能突变,Y^142年X和R^97年,拥有14 mg / dL的低密度脂蛋白胆固醇水平,是健康的和已经生了两个健康的孩子75年]。受试者的临床特点与这些无意义突变没有影响甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇水平但显著降低低密度脂蛋白胆固醇,尽管并不是所有科目窝藏hypocholesterolemic这些突变。在相同的研究中,当天艳阳高照等人测量了等离子体的水平lathosterol(胆固醇生物合成的标志)和菜油甾醇(胆固醇吸收的标志)90年]。PCSK9基因突变的存在没有显著的变化在两个标记,表明PCSK9突变体不降低循环胆固醇水平降低胆固醇吸收或合成。同一作者扩展研究利用DNA测序和芯片寡核苷酸杂交为了识别PCSK9的额外的变化导致低密度脂蛋白胆固醇水平的差异(82年]。黑人,两个错义突变(L^253年F和一个^443年T)与低的低密度脂蛋白胆固醇水平相关,而H^553年R突变伴随着增加血浆低密度脂蛋白胆固醇的水平。这些突变都是非常罕见的,甚至没有白人。较低的低密度脂蛋白胆固醇相关的所有突变没有诱导肝脏甘油三酯含量,确定使用质子核磁共振光谱(91年,92年]。

额外的损失函数PCSK9基因的突变被发现从意大利病人受到hypobetalipoproteinemia74年]。一个病人有一个单核苷酸缺失外显子1 (c.202delG),导致mRNA的转移,导致过早停止密码子(阿拉巴马州^68年fsLeu^82年X)两个额外的主题,带有相同的突变,也发现了相同的地理起源的意思是血浆总胆固醇和低密度脂蛋白水平类似发现在家族hypobetalipoproteinemia病人。他们都以非常低的血浆低密度脂蛋白胆固醇水平,支持这种突变的损失函数的性质(74年]。日本人口限制,突变R^93年C是与低的低密度脂蛋白胆固醇水平相关,表明收购损失函数的性质(73年]。这种突变存在prodomain的分子,以及它如何影响PCSK9的功能还需要确定。相反,一个更好的特征函数突变(年代的损失^462年挪威科目(P)已被确定在84年,93年]。获得损失函数特征的突变是由于其保留进入内质网,即使它进行催化裂解(93年]。令人惊讶的是,突变被发现在一个主题与高胆固醇血症谁继承了她父亲的突变,显然hypocholesterolemic,符合突变的损失函数。相反,她的母亲高胆固醇血症,这表明主体从母亲身上继承了一个未知的遗传缺陷造成hyper-cholesterolemia。的抵消效果上的多个基因突变和/或多态性低密度脂蛋白胆固醇水平最近观察研究着手探索突变的患病率和影响飞机观测,PCSK9,ANGPTL3,LDLR运营商的致病性常染色体显性和意想不到的低密度脂蛋白胆固醇水平低(高胆固醇血症94年]。有趣的是,失去功能突变R46L显示明显不足以补偿高胆固醇血症引起的LDLR突变313 + 1 g > C / 313 + 2 t > C (2.95 vs更易与L,)[94年]。

类似的情况也观察到与主题窝藏的损失函数突变N^354年我和废除了自催化裂解PCSK9并确定其保留的内质网(79年]。这些证据清楚地表明重要性来确定,通过使用在体外和在活的有机体内实验模型,小说突变的功能的后果,没有结合临床血脂参数的突变。的年代^462年P,两个额外的突变也被证明是保留在内质网和作为损失函数突变体,如G236S [79年)和C679X (75年]。所有三个突变很可能不接受适当的折叠,从而不进入分泌途径。

这些证据后,额外的等位变异已确定和部分特征(表的功能1)。独立的完整列表PCSK9变异与特定疾病相关的收集并公开了利博士等人在伦敦大学学院(http://www.ucl.ac.uk/fh/)。共有101个独特的等位变异PCSK9迄今已报告(95年]。其中,大多数()其实,21 intronic和7中5′和3′未翻译区。报告数据显示27获得的功能变体,其中5需要确认和21损失函数包括突变,突变阻止蛋白质的翻译。剩下的变体是常见的多态性或与表型相关,还需要调查。

5。PCSK9和心血管疾病

心血管疾病是最常见的导致死亡的,在世界范围内,约占所有死亡人数的30%(占96年]。九个常见的心血管疾病的危险因素,血脂异常(定义为高比率的载脂蛋白B:载脂蛋白A1)是最重要的之一,占50%的人口归因心肌梗塞的风险(96年)和25%的中风的人群归因风险(97年]。血脂异常的有效管理对减少心血管疾病的风险是必要的。脂质代谢可以以不同的方式被打扰,导致血浆脂蛋白功能和/或水平的变化。这本身,通过与其他心血管危险因素可能引起动脉粥样硬化的发展,增加心血管疾病的发病率98年]。低密度脂蛋白胆固醇仍然是治疗的主要目标在大多数血脂异常管理的策略。最近的胆固醇治疗实验合作(CTT)几个试验的荟萃分析包括> 170000例确诊的剂量依赖性降低心血管疾病与低密度脂蛋白胆固醇降低99年]。这种分析估计为每个更易/ L (~ 40 mg / dL)减少低密度脂蛋白胆固醇,与他汀类药物治疗,获得相应的心血管死亡率和发病率减少22%实现(99年]。

虽然之间的反比关系的低密度脂蛋白胆固醇水平和冠心病(CHD)的发病率已定义良好,PCSK9的角色在这个背景下开始划定通过研究人口窝藏损失或获得突变体的功能。第一项研究旨在定义PCSK9的角色在冠心病的发病率在黑色主题进行Y突变的损失函数^142年X和C^679年X (41,80年与PCSK9 R)和白色的主题⁴⁶L突变体。前两个无意义突变是指的是低密度脂蛋白胆固醇降低40%,而去年减少21% (80年,82年]。这些标识的研究人群提供了机会来分析具体的影响,终身降低低密度脂蛋白胆固醇水平在冠心病的风险。这ARIC研究于1987年发起,包括心血管事件的报道结果1月,200341]。15-year-follow-up期间,9.7%的黑人受试者没有无义突变经历了冠状动脉事件。相比之下,只有1 85例(1.2%)PCSK9发达冠心病的突变问题一个貌似没有任何意义(41]。计算对冠心病的风险比航空公司比非携带者,年龄和性别,调整后为0.11(95%置信区间,0.02 - 0.81;)。发病率仍显著低也考虑后血压和糖尿病。类似于观察突变问题,貌似没有任何意义的,白色的主题纯合子的R⁴⁶L突变有显著降低血浆总胆固醇水平(9%)和低密度脂蛋白胆固醇(15%)。略高的意思是杂合的患者观察血浆低密度脂蛋白胆固醇水平;因此,这两个人口集中。尽管适度减少患者的低密度脂蛋白胆固醇的R⁴⁶L突变,一个仍然重要保护观察冠心病(6.3%和11.8%)。冠心病的风险比PCSK9 R⁴⁶L载体相对于非承运人,年龄和性别,调整后为0.5(95%置信区间,0.32 - 0.79;)。有趣的是,运营商和非承运人的三个PCSK9等位变异显示显著减少,内膜-中膜厚度的替代测量冠状动脉粥样硬化(Y^142年X和C^679年X:毫米和mm;的R⁴⁶李:与毫米)。从这个分析得出结论,降低低密度脂蛋白胆固醇,由于损失函数PCSK9基因突变,对冠心病有保护作用甚至高于低密度脂蛋白降低试验的预测(One hundred.- - - - - -102年]。强烈的保护心血管事件因此视为终身的结果减少血浆低密度脂蛋白胆固醇在运营商与非承运人相比,尽管非常盛行的其他nonlipid-related心血管疾病的风险因素41]。事实上,超过一半的黑人参与者ARIC研究高血压、吸烟近1/3,而近20%患有糖尿病。不过,心血管保护的程度在受试者观察PCSK9的损失函数突变引起了R46L-encoding等位基因的可能性PCSK9减少冠心病的机制与低密度脂蛋白降低效果。第二项研究可能对这种可能性开放在常染色体显性高胆固醇血症患者进行归因于PCSK9功能获得突变。进行30-year-followup 4无关的英国白人家庭由13个影响个人的D^374年Y PCSK9的突变和家族性高胆固醇血症相比,由于3具体LDLR基因突变。PCSK9患者显著高血清总胆固醇浓度(与更易/ L;)[103年),似乎对他汀类药物治疗相比,杂合的家族性高胆固醇血症患者已知LDLR基因突变。可能是由于这两种表型特征,PCSK9患者受到影响在更早的时候过早冠心病(与年;)[103年]。背后的原因这严重的表型相关PCSK9 D^374年Y突变还没有理解和被建议与飞机观测PCSK9的分泌(一个可能的积极作用103年]。飞机观测分泌PCSK9是最近报道的影响在实验模型中基于腺病毒超表达WT PCSK9的肝脏(27LDLR)和被证明是独立的。PCSK9的直接绑定到飞机观测当时建议保护飞机观测细胞内降解通过自噬小体/溶酶体途径[27]。

因此,假定的收益或损失函数的突变体被发现与增加或减少血浆低密度脂蛋白水平和心血管风险,分别。全基因组关联研究进一步支持PCSK9的重要性之间建立联系的单核苷酸多态性位点附近PCSK9与早发性心肌梗塞(104年]。类似的结果也被证实在南亚和黎巴嫩人口105年- - - - - -107年]。

6。PCSK9和实验性动脉粥样硬化

尽管监管途径和酶参与胆固醇体内平衡的老鼠比人类截然不同的,一些相关信息使用这个实验模型在过去十年中已经出现。第一个证据PCSK9的影响诱导LDLR退化是来源于肝PCSK9 overexpressing注射腺病毒编码的PCSK9 [5,10,28]。PCSK9决定特定的低密度脂蛋白胆固醇增加高密度脂蛋白分数(没有显著的影响28]。令人惊讶的是,注射腺病毒编码的两个人类PCSK9的功能获得突变体(S^127年R和F^216年L)减少了LDLR蛋白质含量比WT PCSK9相似程度(10]。这种明显差异的数据相比已经观察到人类携带这些突变可能是戏剧性的结果后过度PCSK9 adenoviral注入。这两个研究血浆脂质分析注射腺病毒3天后,在一个时间点(7天),Benjannet等人报道的低密度脂蛋白胆固醇也显著增加LDLR空鼠(5]。PCSK9的LDLR-independent效应被认为是由一个积极影响飞机观测PCSK9的生产和分泌5),尽管一些对比的结果这个参数已报告(10]。日常管理各种剂量的3天的人类重组PCSK9从3到300μg /鼠标显示剂量依赖性降低肝LDLR增加血浆低密度脂蛋白胆固醇水平与未成年人对高密度脂蛋白的影响(45]。综合所有这些实验数据在活的有机体内模型清楚地记录循环PCSK9的直接影响肝LDLR表达式,因此血浆胆固醇水平。

2005年PCSK9 null老鼠发表的第一篇论文(44]。PCSK9之间交配^{+ /−}小鼠产生的后代在预期的孟德尔式比例。PCSK9零老鼠是正常的外观相似的身体和肝脏重量比同窝出生仔畜WT老鼠(44]。PCSK9的缺席没有确定重大变化在肝脏中胆固醇和甘油三酯浓度,与WT老鼠相比,虽然PCSK9 null小鼠的血浆胆固醇水平低48%比WT甘油三酯没有区别。虽然正常小鼠血浆包含很少apoB-containing脂蛋白低密度脂蛋白(VLDL)和大多数循环胆固醇与高密度脂蛋白,缺乏PCSK9决定进一步降低低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白降低30%44]。PCSK9对高密度脂蛋白的影响分数很可能将在鼠标的apoE HDL介导绑定到LDLR [44]。通过零老鼠穿越PCSK9 LDLR零老鼠,失去了血脂的变化,表明PCSK9的影响对胆固醇体内平衡依赖于LDLR [19]。此外,PCSK9零老鼠表达高水平的2.8倍比WT老鼠和肝LDLR显著更快的间隙²⁵I-LDL WT。始终与以前的工作相比PCSK9 overexpressing老鼠(5],PCSK9的删除是降低轻微apoB48和apoB100分泌的44]。小鼠肝脏特异性PCSK9 null展览血浆胆固醇水平降低27% 42%的完整的小鼠相比,表明肝外PCSK9的来源可能占三分之一的胆固醇体内平衡的规定(19]。

相反的方法也被描述的代转基因老鼠overexpressing PCSK9 apoE启动子的控制下,肝脏特异性增强器(19,31日]。始终与获得的结果adenoviral PCSK9的过度5,43),转基因PCSK9的过度表达,在等离子体水平从146年到440年不等μg / mL,消除肝LDLR蛋白表达与低密度脂蛋白胆固醇水平较高和轻微影响HDL (19,43]。

WT老鼠食物的饮食并不容易动脉粥样硬化,这使得研究人员多年来开发三个主要研究动脉粥样硬化小鼠模型:(1)高胆固醇饮食(15%的脂肪、胆固醇1.25%和0.5%胆酸),在病灶大小保持小;(2)LDLR零导致血浆低密度脂蛋白胆固醇水平,适度增加,诱发动脉粥样硬化,老鼠必须用西式饮食;(3)apoE零老鼠缺乏所需的主载脂蛋白通过肝脏脂蛋白受体的吸收,导致更大的比LDLR空小鼠血浆胆固醇增加,因此发展动脉粥样硬化在普通食物的饮食,和先进的疾病,当老鼠是西式饮食维护。转基因小鼠overexpressing PCSK9诱导显著增加的低密度脂蛋白胆固醇类似LDLR空小鼠的表型28];因此,它是可能的假设可能影响动脉粥样硬化斑块的发展。为了解决这个假说,赫伯特等人最近生成的转基因小鼠表达,水平与内生PCSK9, WT或功能获得突变体D^374年Y PCSK9 [108年]。特别是,研究选择两种不同菌株的D^374年Y PCSK9转基因小鼠表达低和高水平的外生PCSK9。当食物饮食的情况下,这三个转基因小鼠行显示几乎相同的血脂水平,有轻微增加在apoB-containing总胆固醇LDL分数相比,控制动物。然而,高胆固醇饮食诱导更患血脂在两个D^374年Y线条,大量增加飞机观测和apoE-containing脂蛋白。基金会相关血脂中观察到的低和高D^374年Y PCSK9的小鼠,观察到许多在主动脉病变的发展,虽然没有显著的影响在PCSK9 WT老鼠。这些结果强烈与等离子体proatherogenic的低密度脂蛋白胆固醇的水平,尽管PCSK9的积极影响triglyceride-rich脂蛋白从肝脏也被建议(108年]。

最近PCSK9的角色在动脉粥样化形成在上述所有三个不同的模型评估,如C57BL / 6 WT西方饮食的老鼠,载脂蛋白e^−−/老鼠,LDLR^−−/老鼠(109年]。第一个分析是由比较C57BL / 6小鼠PCSK9 null,和转基因小鼠PCSK9美联储西式饮食(34%,糖21%的脂肪,和0.2%胆固醇)。经过12个月的饮食,PCSK9零小鼠血浆胆固醇水平降低35%,同时增加转基因小鼠显示80%主要与低密度脂蛋白胆固醇水平的分数。动脉粥样硬化斑块的组织学分析表明,只有开发的转基因小鼠动脉粥样硬化可衡量的,与胆固醇酯积累增长2.3倍。相反的效果与PCSK9零老鼠,而不是观察主动脉胆固醇酯降低74%累积达到类似水平通常在WT常规食物饮食的老鼠。这些结果与观察到的在前面的研究中,进行转基因老鼠overexpressing PCSK9 PCSK9 D^374年Y,分析完成后15周的高胆固醇饮食(108年]。

由于hypercholesterolemic饮食的老鼠不发展动脉粥样硬化病变,PCSK9的缺失的潜在有益的影响无法评估。解决这一目标apoE null老鼠穿过PCSK9转基因或零老鼠。这些老鼠被喂食普通食物的饮食为6个月和血浆胆固醇水平测定。正如预期的那样,老鼠apoE背景显示大量积累VLDL和低密度脂蛋白胆固醇,和缺乏或超表达PCSK9并不显著影响血脂。然而,主动脉胆固醇酯PCSK9 null老鼠积累降低了39%,增加了137%在转基因小鼠动脉粥样硬化病变207%大小。有趣的是,PCSK9的缺席不会影响动脉粥样硬化斑块的发展的主动脉瓣和根,组织学分析,确定的apoE零背景。

最后,在LDLR PCSK9的影响决定零hypercholesterolemic饮食的老鼠为3个月。PCSK9 null和转基因老鼠穿过LDLR零小鼠血浆胆固醇水平相似,FPLC形象,主动脉胆固醇酯积累和斑块大小LDLR相比^−−/老鼠。这些数据表明,幽默效果PCSK9胆固醇体内平衡和动脉粥样硬化斑块发展几乎完全依赖的存在LDLR [108年]。然而,PCSK9的影响在动脉粥样硬化斑块成分,而不是大小,仍然需要解决,它将更能反映潜在的对PCSK9 atheroprotective影响治疗。值得注意的是,我们最近报道,PCSK9存在在人类动脉粥样硬化斑块可能局部调节LDLR在巨噬细胞的表达26]。

感兴趣的,抵抗素,一个小蛋白质由人类巨噬细胞和脂肪细胞分泌的啮齿动物(110年),诱导PCSK9表达肝细胞并减少LDLR水平(111年),这表明resistin-mediated upregulation PCSK9的可能导致肥胖和糖尿病血脂异常通常观察到,通常表现为改变所有脂质参数的水平。PCSK9表达式也依赖胰岛素的作用通过激活SREBP-1c [112年]。在糖尿病大鼠也显示PCSK9[表达的改变113年),在血糖肥胖老鼠的LDLR的规定已被证明是PCSK9的控制下,通过参与哺乳动物雷帕霉素靶复杂1 (mTORC1)激酶活性[114年]。在同一模型中,转录因子肝细胞的核因子1α(HNF1α)负责监管PCSK9水平(114年]。这些数据与之前的研究一致表明HNF1绑定网站毗邻甾醇响应要素(行为)是至关重要的监管序列图案,和HNF1α是主要的工作伙伴SREBP2 PCSK9基因的调节(115年]。综上所述,PCSK9的表情似乎是管制不同病理条件下,如糖尿病和肥胖,并可能参与了血脂异常有关。

7所示。新兴证据的肝外PCSK9的函数

虽然大多数的研究集中在肝LDLR PCSK9的规定,应该是认为mRNA PCSK9是检测在许多肝外组织(3]。令人惊讶的是,PCSK9显著影响LDLR表达式在肝脏只有轻微干扰肾和肾上腺LDLR [116年,117年]。这可能是由于当地PCSK9的浓度或降低到所需的不同表达式的代数余子式PCSK9-dependent LDLR退化。尽管如此,在LDLR PCSK9的缺乏影响组织表达合理的PCSK9暗示可能的附加功能PCSK9的监管之外胆固醇体内平衡。

PCSK9在老鼠和人类分离胰岛细胞检测,只有生长抑素阳性δ肽而不是α- - -β肽表达PCSK9 [23]。这些细胞显然不分泌检测PCSK9的水平,尽管他们应对体内PCSK9补充道。因此,胰岛细胞的LDLR似乎监管,几乎完全,肝循环PCSK9的起源23,118年]。PCSK9的存在与否不影响胰岛素分泌评估孵化胰腺胰岛和高葡萄糖浓度较低(23]。此外,PCSK9缺没有改变胰岛素分泌在活的有机体内在基底和体外糖尿病条件下(23]。空腹血浆葡萄糖水平显著升高,相反,在四个月大PCSK9零雄性老鼠相比WT (23]。通过口服葡萄糖耐量试验显著增加胰岛素血症在WT老鼠,虽然没有改变观察PCSK9零老鼠,暗示可能PCSK9的角色在葡萄糖稳态118年]。然而它必须注意到这种效应只有在男性和四个月大的老鼠,因此还需要进一步的证据来证实这个函数。

PCSK9 mRNA显然是检测在小肠和结肠相似的水平,在肝脏中发现(3,24]。通过免疫组织化学分析发现PCSK9是现在几乎只在人类十二指肠和回肠的上皮屏障,在肠上皮细胞和杯状细胞(24]。血浆甘油三酯水平的衡量后在4小时内禁食小鼠胃内的丸橄榄油在餐后triglyceridemia强烈衰减清楚地记录(24]。这种影响不是PCSK9零脂肪吸收不良引起的小鼠更可能减少飞机观测乳糜微粒和分泌。此外,缺乏PCSK9决定近200%比控制WT小鼠肝摄取之内。这两个因素的结合,加上肠道LDLR的可能角色的再吸收新生的粒子,可以解释的强劲减少餐后triglyceridemia观察PCSK9零老鼠。药物抑制PCSK9可能,因此,帮助管理高胆固醇血症和餐后triglyceridemia,两个重要的心血管疾病的危险因素。

一起餐后甘油三酯水平越低,PCSK9 null老鼠也显示腹部脂肪,在脂肪生成暗示作用[22]。详细分析表明PCSK9零老鼠表现出较大的perigonadal(+ 70%)和perirenal(+ 90%)比WT老鼠仓库,平均2.8倍的脂肪细胞的体积增大(22]。LDLR表型被证明是独立的,而是要由VLDLR PCSK9的目标(68年]。从不同的老鼠模型的分析得出结论,循环,而不是当地PCSK9负责蛋白质脂肪VLDLR监管。

通过原位杂交胚胎发育期间的分析已经表明PCSK9是表示在E12.5肝、小肠和端脑。虽然PCSK9是显示没有穿过血脑屏障117年),其本地表达式在额叶皮层调节LDLR水平但没有出现显著改变小脑的发展(3,119年]。PCSK9存在于小脑在产后7天,主要是局部外颗粒层中调节LDLR表达式。这些证据表明可能PCSK9的功能作用在大脑的胆固醇体内平衡3]。在成人的大脑,PCSK9 mRNA表达的只是嗅花梗的吻侧延伸,LDLR的不善表达(3]。通过对比WT和零老鼠发现PCSK9的存在并不影响LDLR表达式和吻侧的总组织扩展的嗅觉花梗和嗅球结构(119年]。在脑损伤的实验模型,如图所示也部分肝切除术后19),24 h和72 h后受伤后PCSK9 mRNA在侧损伤的调节齿状回,1周后消失119年]。鼠标行为和大脑病变大小受伤后WT PCSK9 null老鼠,没有差异新创在齿状回神经发生短暂性大脑中动脉闭塞后并没有改变PCSK9的缺失。然而,缺乏PCSK9的相关影响LDLR表达式在缺血性中风后大脑的损伤侧(119年]。

自VLDLR ApoER2高度表达在中枢神经系统和之前与阿尔茨海默病(120年- - - - - -124年),PCSK9最近调查的作用在活的有机体内(125年]。PCSK9被证实能够绑定VLDLR和ApoER268年),但分析PCSK9零老鼠LDLR的稳态水平没有影响家庭成员在成年小鼠的大脑125年]。尽管先前的研究已经表明,PCSK9影响的表达式β网站淀粉样前体蛋白(APP)裂开酶1 (BACE1),膜蛋白酶负责有毒的生产β淀粉样肽积聚在阿尔茨海默氏症的大脑神经炎的斑块(126年,127年),分析在PCSK9 null和转基因小鼠进行没有证实这些证据125年]。

综上所述,目前的证据在PCSK9的作用在中枢神经系统表明PCSK9抑制不应该干扰大脑发育和形态或缺血性中风后大脑恢复/损害。PCSK9治疗冠状动脉心脏疾病也可能不受潜在的中枢神经系统的影响。

8。抑制PCSK9的治疗方法

PCSK9的治疗动脉粥样硬化的药理目标受到关注后发现至少有三个原因:(1)PCSK9直接会使肝LDLR的表达,进而提高血浆低密度脂蛋白胆固醇水平,心血管疾病风险的主要决定因素99年]。(2)任何特定的抑制PCSK9似乎是安全的因为失去功能突变和女人完全缺乏PCSK9是健康的没有其他明显的代谢缺陷(41,75年,128年]。(3)PCSK9的组合抑制剂与他汀类药物应该结果添加剂,甚至协同hypocholesterolemic效应(44,59,76年,129年]。虽然理论上几个选项可以追求抑制PCSK9 [130年),目前,最先进的治疗方法是基于单克隆抗体(mAb),不过也修改反义寡核苷酸,短干扰RNA (siRNA)、小分子肽,疫苗正在开发(表中2)。

马伯SAR236553 / REGN727,第一次描述了mAb1的名称(131年),现在处于第二阶段。REGN727是非常具体的,完整的人马伯PCSK9,与大量的氨基酸残基的催化域和部分prodomain PCSK9的。通过对比PCSK9: Fab1复杂的mAb1 PCSK9结构绑定到EGF-AB LDLR的域(65年),假定Fab1和EGF-A域绑定到相邻的网站PCSK9和位阻于同时绑定PCSK9蛋白(131年]。因此,通过阻断PCSK9的交互LDLR, mAb1抑制PCSK9-mediated LDLR的退化。注入mAb1承运(10毫克/公斤)在C57BL / 6小鼠显著降低总胆固醇水平的大约20 - 28%从24 h - 144 h postadministration。mAb1治疗肝LDLR增加蛋白质含量高达2.3倍相对于对照组(131年]。没有观察到胆固醇水平的变化在LDLR null老鼠注入mAb1之后,表明LDLR的存在需要mAb1的降低胆固醇的效果。在非人灵长类动物,mAb1导致显著降低血清总胆固醇早在注射后3天,极大降低在动物相比,第十天。低密度脂蛋白胆固醇水平的影响是更引人注目的,最大的减少在第十天。血清甘油三酸酯水平并没有因为mAb1而改变。在第一阶段的临床试验,REGN727评估在三个独立的影响研究(132年]。两个单剂量静脉或皮下注射在健康的志愿者管理和第三multiple-dose皮下接种(132年]。单管理静脉或皮下REGN727后观察剂量依赖性降低低密度脂蛋白胆固醇的实体和持续时间的影响。的高剂量静脉(12毫克/公斤)和皮下(250毫克)确定大约减少了60%的低密度脂蛋白胆固醇,去年64和30天,分别是(132年]。REGN727 multiple-dose研究,皮下注射管理,减少了39.2%的低密度脂蛋白胆固醇(50毫克),53.7%(100毫克),61.0%(150毫克)atorvastatin-treated病人。最引人注目的这项研究的结果是,低密度脂蛋白胆固醇反应是相似的在所有的科目,不管家庭之外是否有家族性高胆固醇血症或他们是否接受阿托伐他汀或修改后的饮食本身。特别是,REGN727和阿托伐他汀在降低低密度脂蛋白胆固醇的影响似乎是添加剂,不会表现为协同作用,因为意味着还原率相似REGN727管理时单独或在主题已经接受阿托伐他汀。REGN727出现的影响还与最大速度比他汀类药物降低低密度脂蛋白胆固醇在2周内,而他汀类药物通常需要更长的时间(145年]。行动的不同机制可能占REGN727更快的效果。不同于他汀类药物和胆汁酸螯合剂,REGN727被减少,尽管不是在所有剂量显著,脂蛋白(a)。最后,管理这马伯anti-PCSK9似乎是安全的,因为我们没有观察到明显的与毒品有关的不良事件。

第二个临床试验,在阿托伐他汀治疗的患者进行,基本上证实了先前的结果与剂量和regimen-dependent LDL胆固醇减少皮下后管理(134年]。低密度脂蛋白胆固醇与100毫克和150毫克每两周大于200毫克和300毫克每四个星期在第12周。在第一阶段试验(133年),还在这个实验中,观察到高密度脂蛋白胆固醇和apo-A1增加的趋势(134年]。再次,REGN727脂蛋白(a)的水平增加了13%到29%在“每两周”方案。原因对该参数和实际影响将需要额外的研究为了得到确认和理解,但这是可能的,大型低密度脂蛋白胆固醇降低,剩下的来自Apo-B和LDLR的竞争很小,使LDLR的吸收lower-affinity Apo-B脂蛋白(a)。REGN727未受影响的低密度脂蛋白降低阿托伐他汀剂量表明,尽管他汀类和PCSK9抑制剂上调LDLR,减少低密度脂蛋白胆固醇是独立的机制。

实验研究表明,他汀类药物可能增加PCSK9水平(44,146年,147年),然而,这种效应并不总是在诊所(59,76年,129年]。研究设计的差异可以解释这些明显的差异。例如,在新的目标(TNT)的治疗试验,在不显著增加PCSK9水平观察与10和80毫克的阿托伐他汀治疗后,所有的病人登记有冠心病史。因此可能statin-naive等离子PCSK9的水平,一个参数,没有测量的研究,高出平均比normolipidemic个人或无症状的患者参与其他研究[87年,148年]。等离子体PCSK9也建立在人类积极与低密度脂蛋白胆固醇(20.,87年,149年,150年]。在患者他汀类药物治疗,这种相关性损失是由于同时upregulation LDLR PCSK9表达式;TNT中可观察到缺乏相关性研究[59]。有趣的是,现有的证据表明不存在显著负相关关系的基线PCSK9和低密度脂蛋白胆固醇的变化以应对他汀类药物(20.,148年]。PCSK9的血浆水平测量开始前他汀类治疗似乎预测未来心血管的结果只有在病人保持10 mg阿托伐他汀uptitrated接受80毫克(而不是病人59]。这些可能的潜在暗示未来发展PCSK9抑制剂,在其使用上的他汀类药物可能有利于增加剂量他汀类药物的病人是不可取的。

虽然大,持久试验需要确定的频率和严重性REGN727任何可能的副作用,从这些简短的研究似乎是耐受性良好。特别是,它没有观察到显著增加肝或肌肉酶。在合规方面的主要问题在于评估,在较大的临床试验中,真正的injection-site-reaction频率通常是温和的,瞬态,nonprogressive [134年]。

二期临床随机对照研究与REGN727然后在家族性高胆固醇血症患者低密度脂蛋白胆固醇的浓度为2.6更易/ L或更高版本(132年]。病人被随机分配接受REGN727 150毫克,200毫克,或300毫克每4周,或150毫克每2周,每2周或安慰剂。皮下REGN727导致管理意味着减少-67.9% - 28.9的低密度脂蛋白胆固醇(从每四周150毫克到150毫克每2周)的低密度脂蛋白胆固醇从基线到第12周,与安慰剂相比减少了10.65%。低密度脂蛋白胆固醇降低的最佳维护效果观察每2周方案相比,每4周。只有群150毫克每2周剂量显著增加高密度脂蛋白胆固醇水平约12.3%。也在这个研究REGN727治疗耐受良好,只有一个病人在300毫克每4周组,注射部位反应终止研究和广义瘙痒被认定为是与研究药物有关。没有增加三倍的上限在肝转氨酶正常,或肌酐激酶,观察。

REGN727的能力在150毫克每2周达到平均约1.3的低密度脂蛋白胆固醇更易与L,进一步减少大于2.6更易与高剂量他汀类药物+ L ezetimibe治疗,并导致超过80%的患者达到一个低密度脂蛋白胆固醇浓度低于1.8 L更易与支持的有效性这一新的治疗家族性高胆固醇血症患者的治疗的机会。

REGN727之外,至少其他两个制药公司(辉瑞公司和默克)目前正在开发马伯指向PCSK9 [136年- - - - - -139年]。特别是,在默克研究实验室已经选择和研究抗体PCSK9 [c端域的138年]。的相关性这一领域最近只欣赏(67年),和这个药理工具的使用有助于阐明PCSK9的作用方式LDLR [138年]。人类的工厂和IgG2 1 g08,结合纯化重组PCSK9亲和力550点。工厂1只g08受到很小的影响(50 - 60%)细胞低密度脂蛋白摄取和只有在外生PCSK9的存在,而IgG2不是有效的。更有趣的是,低密度脂蛋白摄取的变更工厂1 g08不是由于抑制受体PCSK9绑定。相反,1的抑制作用g08 PCSK9似乎是介导细胞功能,至少部分细胞PCSK9的衰减吸收。虽然1 g08工厂很大程度上影响PCSK9功能通过一个新的清楚的作用机制,临床兴趣似乎没有高尤其是免疫球蛋白形式,具有良好的药代动力学特性,显示效果低于工厂(138年]。

更为保守的方法来抑制PCSK9的选择也是由默克公司开发的马伯指示PCSK9的催化域包括整个LDLR EGF-A结合位点(137年]。这种抗体的作用首先是评估在转基因小鼠模型表达人类CETP和人类LDLR (CETP / LDLR-hemi)。在这些动物血浆脂质和PCSK9概要模仿人类的情况,和1 d05-ig2降低,存在剂量依赖的相关性,血浆低密度脂蛋白胆固醇。单注4毫克/公斤的低密度脂蛋白胆固醇水平降低了50%在48 h postdose。的在活的有机体内功效1 d05也是评估在恒河猴。在这个动物模型中,一个输液注射3毫克/公斤导致循环减少高达50%的低密度脂蛋白胆固醇。效果观察给药后24小时内,持续了2周。

第二个高亲和力抗体,结合PCSK9扰乱PCSK9-LDLR交互被识别和开发从同一家公司139年]。1 b20抗体结合人类,老鼠,恒河,和鼠标PCSK9高亲和力0.3,4.5,0.6,分别和1海里。单个1.1毫克/公斤输液剂1 b20诱导29%的低密度脂蛋白胆固醇降低胆固醇酯转运蛋白/ 48 h postdose LDLR-hemi老鼠。正如所料,1 b20诱导持续增加肝LDLR表达式(139年]。胆固醇酯转运蛋白/多剂量研究LDLR-hemi老鼠进行使用3或10毫克/公斤1 b20的剂量。管理1 b20, 14天,确定一个健壮的50 - 70%的低密度脂蛋白降低胆固醇的效果。

皮下以来政府交付的首选路线对于人类来说,一项研究是在健康恒河猴进行评价药代动力学和药效学1 b20后一个皮下或静脉注射剂量的1到10毫克/公斤(139年]。血清1类似b20水平之间的观察皮下或静脉注射剂量的1毫克/公斤,而更高层次观察皮下注射10毫克/公斤。与药动学特征一致,1毫克/公斤剂量决定类似的低密度脂蛋白降低胆固醇的作用,尽管10毫克/公斤的皮下政府比静脉注射剂量更有效。因此,药代动力学和药效学观察剖面之间的直接相关性(139年]。

最后,1 b20的hypocholesterolemic效果评估在一群猴子代谢综合征与他汀类药物治疗。1 b20和辛伐他汀的结合降低低密度脂蛋白胆固醇超过辛伐他汀或仅1 b20,突出的优势anti-PCSK9抗体单独和他汀类药物联合治疗在治疗(139年]。

感兴趣的,在老鼠和猴子的研究[139年),1 b20治疗导致plasma-free减少(释放)PCSK9水平和增加血浆总PCSK9的水平。这种效应可能是由于PCSK9的封存1 b20,哪些块PCSK9吸收和清除肝、PCSK9间隙在人体内的主要器官。类似的结果也被观察到的1 d05抗体[137年)增加,一定程度上,总等离子PCSK9。理解的基本分子机制管理马伯的间隙PCSK9可能有助于改善他们的药动学特征。提到很重要的快速清除PCSK9马伯可能是由于PCSK9的短半衰期时间循环,约5分钟(151年]。这种快速的间隙似乎只是部分依赖LDLR,半衰期增加到15分钟以来LDLR空鼠(151年]。最近,PCSK9的间隙通过LDLR-independent机制已经被直接比较的假设,家族性高胆固醇血症该杂合子,normocholesterolemic科目(152年]。

辉瑞公司也在开发一个人性化的马伯指向PCSK9的LDLR绑定域名153年]。J16抗体导致筛查anti-PCSK9马伯在杂种细胞细胞系生成的融合各种WT和PCSK9 null小鼠的脾脏免疫重组人类PCSK9的蛋白质。从第一个筛选抗体选择歼10,进一步改造成一个人类IgGdeltaA [154年),κ链相比,抗体与抗原的亲和力有所改善,原来J16抗体(153年]。导致人类抗体结合人类PCSK9的重组大约下午5点,猕猴猴低于100点,鼠标PCSK935点。

10毫克/公斤J10管理时,作为一个单一剂量腹腔内,美联储C57BL / 6小鼠正常食物的饮食,血清总胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇水平是最大限度地减少了46%和43%,分别在第七天,甘油三酸酯水平没有影响(153年]。此外,LDLR-dependent J10效果证明了使用LDLR零老鼠,在不影响血脂观察腹腔内注射后10毫克/公斤的J10。重要的是,高脂肪饮食的老鼠(千卡脂肪60%)或高脂肪高胆固醇饮食(40%千卡脂肪2.8毫克/千卡胆固醇)完全抵抗J10。进一步调查这些发现,单一的影响注射3毫克/公斤J16 hypercholesterolemic非人灵长类动物的研究。减少了64%的低密度脂蛋白胆固醇是第三天治疗后,观察到一个非常类似的效果观察猴子吃正常的食物的饮食。此外,J10被证明是添加剂的影响在hypercholesterolemic非人灵长类动物(他汀类药物治疗153年]。

综合一些制药公司目前投资资源对PCSK9马伯具有类似的作用机制,虽然有些差异的能力观察,似乎所有人都希望未来的临床开发。

自PCSK9是肝脏中高度表达,它的主要功能是降低LDLR在肝细胞中,它是一个理想的分子目标反义寡核苷酸技术。作为一个概念证明的药理学方法,首次开展了一系列实验使用mousePCSK9基因的反义寡核苷酸互补和管理在hyperlipidemic老鼠140年]。水溶性嵌合的腹腔内注射2′-O-methoxyethyl phosphorothioate 20-mer反义寡核苷酸(伊希斯394814;每周两次50毫克/公斤)高fat-fed C57BL / 6小鼠减少92%治疗6周后PCSK9 mRNA水平(140年]。这种效应显著增加了2.7倍的肝apoliprotein B信使rna编辑酶催化多肽1 (apobec-1) mRNA和没有变化对其他关键胆固醇和脂肪酸生物合成的基因。影响394814年反义伊希斯apobec-1增加血清apoB-48蛋白质水平和减少飞机观测而不影响apoA-I - 100水平。减少肝LDLR PCSK9表达式决定增加2倍,减少循环总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇53%和38%,分别。不同于马伯PCSK9抑制剂,在这项研究中观察到的一个重要的肝甘油三酯水平降低65%。以前曾有报道称在PCSK9 null老鼠相似的效果44]。与PCSK9的提议机制一致,不影响血浆胆固醇水平在LDLR零老鼠反义ISIS394814政府之后。

第二种方法利用脂质体封装小干扰rna siRNAs注射lipidoid纳米颗粒(LNP) [143年]。不同剂量的lipidoid-formulated PCS-A2通过尾静脉注射到小鼠和大鼠。最大PCSK9信使rna沉默后实现管理5毫克/公斤PCS-A2减少PCSK9 mRNA约60 - 70%,转换成30%对血浆总胆固醇水平降低的影响。降脂效果持续大约20天后一个注射剂量最高的利用(7.5毫克/公斤)。不同于反义的方法(140年),siRNA指向PCSK9没有改变小鼠的肝甘油三酯水平(143年]。这种方法也被验证的PCS-C2指向人类PCSK9小鼠表达人类PCSK9 cDNA apoE启动子(下31日]。一剂5毫克/公斤PCS-A2或PCS-B2导致显著降低低密度脂蛋白胆固醇在剂量后的第三天开始,直到第14天(PCS-A2)和21天(PCS-B2)在非人灵长类动物143年]。

最后的“沉默”的策略是利用高亲和力,单链,未系统地阐述的,12到16核苷酸短锁核酸(放大器)修改gap-mer反义寡核苷酸(141年,142年]。这种方法不需要制定,在老鼠身上试验过。静脉政府决定减少60% PCSK9 mRNA的肝脏,持续超过16天,与两种肝LDLR成倍增加。估计埃德₅₀是9毫克/公斤(142年]。同样的技术是在非人灵长类动物的然后翻译141年]。还在这种情况下,观察到一个非常长久的效果采用寡核苷酸最大降低50%的低密度脂蛋白胆固醇水平在注射后21天,显著影响到56天(141年]。的影响两个寡核苷酸、SPC5001 SPC4061当时检查在multiple-dose的一项研究中,由一个初始负荷剂量20毫克/公斤,紧随其后的是四个每周维护剂量的5毫克/公斤。两种抑制剂,皮下接种在缓冲盐,未系统地阐述的分子产生显著降低血清PCSK9的蛋白质含量(SPC5001−85%)保持对所有研究的持续时间。低密度脂蛋白降低胆固醇的效果是SPC5001平均50%到70%,而SPC4061是比较有效的。肝脏LDLR蛋白质水平,分析了免疫印迹分析,增加了67%在SPC5001treated猴子盐水控制相比,并没有证据表明胆固醇积累在肝脏141年]。

另一种方法来抑制PCSK9 LDLR交互可能是使用的小肽模仿LDLR的EGF-A / B域66年,70年]。也证实了这种方法的有效性使用HepG2细胞overexpressing EGF-A [88年]。PCSK9的内源性抑制剂也被描述和可能导致开发新的药理与anti-PCSK9功能实体(155年]。然而,肽链型方法似乎效果低于马伯至少有两个原因:首先肽有实质性的比抗体亲和力低,除非这可能不是一个问题的低亲和力的LDLR PCSK9中性pH值;第二个小肽通常有一个低血清半衰期需要频繁给药,口服并不合适。发展peptidic抑制剂的潜在的优势仍然是一个相当大的成本优势与抗体相比。

而经典的小分子抑制剂的开发将干扰PCSK9 LDLR交互出现困难,这种类型的药理方法被提出,考虑到运输所需的自催化裂解是PCSK9从内质网到高尔基体成熟蛋白的分泌。因此,通过阻断PCSK9的催化活性小分子会阻止蛋白质加工和分泌影响PCSK9的功能。为了达到一个适当的药物抑制,小分子需要到达内质网,并选择性地抑制PCSK9离开其他proprotein转化酶功能活跃。最近描述的细胞试验测定PCSK9催化活性肯定会有助于确定新的PCSK9抑制剂(18),即使没有晶体结构的活性部位的未加工PCSK9地区更加困难的设计药物的新类。使用小分子作为潜在PCSK9抑制剂类将有利的成本和给药途径。此外,小分子的影响可能会相对较短的时间和很长的马伯和RNAi的药动学特征的方法;因此,任何最终的副作用应该是可逆的短期内,可能和快速剂量调整。

最后,一个有趣的新方法,最近描述涉及对PCSK9的直接免疫(144年]。这种方法是基于发现一个免疫抗原和内源性氨基酸差异蛋白质是足以引起免疫反应和交叉反应的抗体的生成内源性蛋白,将其移出循环(156年,157年]。使用这个系统是观察肝LDLR的患病率增加和减少60%的低密度脂蛋白胆固醇免疫BALB / c小鼠后第14天。通过ELISA测定结果表明,免疫后14天循环PCSK9的浓度降低了66%。这种方法似乎是适合一个特定的抑制特定的靶蛋白的实验设置。需要进一步的研究以便更好地描述这种方法在安全方面,特异性,效率等等之前考虑人类使用。

9。结束语

从当前可用的数据,可以想象得出,由于其功能作为管理者LDLR肝脏中蛋白质表达,PCSK9是最有前途的药理目标治疗心血管疾病的新时代。巨大的利息也证实了这种分子的制药公司目前参与PCSK9抑制剂的发展。然而,当前的方法适用于抑制PCSK9似乎仅限于马伯,阻止LDLR-PCSK9交互。显然这治疗机会抹去一些问题的病人的治疗和合规成本。尽管如此,尽管父母的政府并不是特别吸引人终身治疗,它可以接受高风险的患者无法实现的低密度脂蛋白胆固醇水平的50 mg / dL可用联合疗法或限制他汀类药物副作用或其他降血脂药制剂。的目标人群更有可能将受益于这种类型的患者治疗家族性高胆固醇血症的形式。

确定安全的挑战,口服活性小分子抑制剂PCSK9绝对是一个未来的目标,应该追求强烈。这样的抑制剂,与他汀类药物相结合,可能是很有价值的治疗高胆固醇血症甚至在患者没有风险但次要的高胆固醇血症。时间会告诉我们这种方法是否适用于控制高胆固醇血症。

最后,反义技术无疑是能够与高选择性抑制一个具体的目标,和临床数据支持可能利用这种类型的治疗目标PCSK9;然而,很少对这种方法的安全性。最先进的寡核苷酸反义治疗血脂异常是mipomersen,飞机观测合成抑制剂(158年]。Mipomersen一般耐受性良好,有一个可接受的安全性在第二阶段和第三阶段的研究。最常见的不良事件是注射部位反应,类似流感的症状,增加肝脏功能测试。特别是,注射部位反应,发生在大多数病人(75% - -100%)被认为是一种反义与课堂有关的现象还与其他反义药物,也有可能观察到anti-PCSK9寡核苷酸。尽管这些反应并不被认为是严重的安全问题,但可能会影响病人的依从性。

总之,取得了一个重要的努力为了开发新的PCSK9抑制剂,而且,在未来,疗法能抑制PCSK9表达式(寡核苷酸反义)处理(小分子),和/或与LDLR (mab)可以代表一个真正的好处治疗高胆固醇血症和相关的心血管疾病。