记者体系GPCR检测与裂殖酵母粟酒裂殖酵母

摘要

G蛋白偶联受体（GPCR）与各种各样的生物活性有关。酵母通常用作异源GPCR测定的宿主。我们通过其内源性GPCR途径设计了用于裂变酵母的激烈的报道酵母，以产生绿色荧光蛋白（GFP）。作为报告质粒上的GFP表达的控制区域，我们将专注于通过途径特异性活化的七个内源基因。当这些基因的上游区域与LPI终止子组合使用作为诱导型启动子时，mam2在高背景下，上游区域产生GFP的速度最快，强度最大。随后，LPI终止子被相应的下游区域取代。SPBC4.01下游区域以低背景增强响应。此外，结合SPBC4.01下游区域和sxa2上游区域，其信噪比明显优于其他区域。我们还评估了由报告质粒转化的菌株的GFP产生的时间和剂量依赖性。最后，我们建立了在外源启动子控制下表达内源性GPCR的报告质粒的简化GPCR检测模型。

1.介绍

在哺乳动物中，G蛋白偶联受体(GPCRs)是最大和最多样化的蛋白家族。GPCRs被激素、气味、多肽、神经递质等激活[1- - - - - -3.］.不足为奇的是，GPCRs通常与各种疾病有关;GPCRs和酶一样，是最有潜力的药物靶点之一。然而，由于其独特的结构和未知的运输和折叠机制，很难在异体细胞中复制合适的和功能性的GPCR表达。因此，大量GPCRs仍然不能确定相应的配体。今天，已经开发了各种各样的主机及其转换器来解决这些问题[4- - - - - -10.］.

裂殖酵母，粟酒裂殖酵母，是单细胞真核生物和最好的模型生物，尤其是细胞周期。裂变酵母在mRNA剪接，后期修饰等方面与哺乳动物的份额更加相似，而不是其他酵母，包括萌芽酵母，酿酒酵母酿酒酵母［11.］.事实上，许多裂变酵母的基因可以由哺乳动物同源物补充，许多哺乳动物蛋白在裂变酵母细胞中成功表达[12.- - - - - -17.］.虽然裂变酵母在表达外源蛋白方面具有诸多优势，但在GPCR研究中最好不要选择裂变酵母。

内源性分裂酵母遵循两种替代的GPCR途径。一种是营养(葡萄糖)信号通路[18.另一个是交配途径。这种交配途径与哺乳动物细胞中的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径极为相似[19.，20.］.甲裂殖酵母细胞通常是通过在丰富培养基中有丝分裂分裂。然而，暴露于营养饥饿（特别是氮饥饿），细胞有丝分裂转换到减数分裂通过该细胞通过信息素通讯发展成具有相反交配型健壮孢子耐环境应力[20.，21.］.一种交配型，加细胞（h+或p细胞），分泌可扩散的肽信息素，其是由p源编码的Map2.基因。另一种交配型，减去细胞（h- 或M细胞），通过内源性GPCR接收p型，这是由其编码的MAM2蛋白质mam2基因(22.，23.］.信息素接收触发交配特异性基因的顺序和合并激活，这导致形态学的变化，以便以后与相反配合类型的缀合[23.，24.］.

在本研究中，我们提出了用裂变酵母通过内源性交配途径来寻找孤儿GPCRs配体的筛选系统。作为报告基因，密集基因如LacZ或荧光素酶常用于酵母的GPCR检测[8- - - - - -10.，25.，但我们使用绿色荧光蛋白(GFP)，重点是简单和廉价的检测，尽管与强烈基因的信号非常微弱。为了克服这一缺点，我们构建了易于处理的报告质粒。

2。材料和方法

2．1.菌株和媒体

本研究使用的菌株如表所示1．裂变酵母细胞在EMM (Edinburgh Minimal Medium, Sunrise Science Products, CA, USA)或EMM- n (EMM - Nitrogen, Sunrise Science Products, CA, USA)中生长。转化子被镀到MMA(最小培养基琼脂，日出科学产品)或MMA添加1.25%亮氨酸(120μ.L /板)。

大肠杆菌DH5α菌株α用于质粒的亚克隆制备。

肽和寡核苷酸合成是由操纵子有限公司（东京，日本）中进行。Each peptide was prepared as a stock solution of 1 mM in Milli-Q water and stored at −80°C.

2.2。质粒结构和转化

2.2.1。基因破坏

基因破坏通过标准同源重组方法进行。先前描述了用于基因破坏质粒的详细构造[26.］.简单地说，将靶基因5′和3′侧翼序列约1000 bp作为染色体整合区。删除ura4选择标记，ura4gene was sandwiched with about 200 bp of 3′ flanking sequence of the target gene. For negative selection of theura4-细胞，细胞被镀到YES-FOA板(0.5%酵母提取物，3%葡萄糖和SP补充剂，2% Bacto琼脂，0.1% 5-氟硼酸)。结果ura4-细胞可用于随后的基因重组。

2.2.2。基于pAL7记者质粒

的报道质粒工程化基于pAL7这是一个高拷贝质粒用于裂殖酵母[27.］.示意图如图所示1．利用引物pAL7invforward和pAL7invreverse从pAL7中扩增出包括复制起始点和选择标记在内的主要片段。该片段与一系列特定的启动子、GFP和Lipocortin I (LPI)终止子连接。利用引物pAL7invreverse和GFPORFforward对质粒进行反PCR，将启动子区域替换为信息素依赖基因的每个上游区域。为替换LPI终止子，使用引物pAL7invforward和GFPORFreverse进行反PCR。本研究使用的GFP开放阅读框(ORF)来自Monster Green Fluorescent Protein phMGFP Vector (Promega Japan, Tokyo, Japan)。LPI终止子从pSU1Z载体(Asahi Glass Co.， Ltd, Tokyo, Japan)中扩增。从基因组DNA中扩增上、下游区域，引物列于表3.．

（一种）

（b）

（C）

（一种）
（b）
（C）

图1

1 记者的示意图质粒的构建。（a）由pAL7和包括一系列启动子，GFP（实心箭头）和LPI终止子（实心框）的磷酸化片段扩增的片段结扎。所述启动子的（b）转换成任何上游区域（阴影和空心三角形），和LPI终止子的转化成任何下游区域（阴影和空心框）。（c）将上游和下游区域的完成。在表中列出的所有报告质粒都是这样构造的。

2.2.3。mam2基因表达质粒

pSU1Z载体允许在hCMV启动子的控制下表达特定的基因ura4在分裂酵母染色体上的位点。来表达mam2在其他启动子的控制下，我们将hCMV启动子替换为nmt1或者urg1启动子。该地区的nmt1推动者称为Prep1 Vector，以及urg1被瓦特等人报告的区域提交。［28.］.镇压的nmt1发起人，超过15人μ.硫胺素中的m被添加到培养基中。诱使nmt1启动子，将细胞在新鲜的EMM孵育而不硫胺素20小时。在预孵化，urg1启动子是一贯通过不存在尿嘧啶的压制。相反，urg1启动子在试验过程中被氮饥饿激活。

用于质粒构建的所有PCR产物均按照供应商的说明使用KOD-plus-Neo (Toyobo, Osaka, Japan)制备。所有没有复制原点的片段大肠杆菌用T4多核苷酸激酶（东洋纺）和连接反应磷酸化用一个结扎-便利试剂盒（日本基因，东京，日本）中进行。各质粒的序列通过核苷酸序列分析证实。

2.2.4。转型

使用乙酸锂方法转化裂变酵母[27.，29.］.将转化的细胞涂覆到补充亮氨酸的MMA板或MMA平板上。将板在32℃温育2-3天，选择阳性菌落。为了检查正确的整合，使用Sapphireamp Fast PCR主混合物（Takara Bio Inc.，Otsu，Japan）对提取的DNA进行PCR。这项研究中的所有父母株都缺乏两者的功能LEU1+和ura4+。试验之前，leu1-32与源自Pal7（或其衍生物）的Leu2辅成URA4-D18补充了ura4来自PSU1z载体（或其衍生物）衍生的基因。

２.３.分析

2.3.1。时间分析

将细胞在32℃下在EMM中生长24-36小时，接种成5ml新的EMM。然后将细胞在30℃下生长20小时并收获。用无菌水洗涤两次后，将细胞转移到测定培养基中，使初始光学密度为1.5，在600nm处。立即，在最终浓度为1或0时加入p系子 μ.M. 500的细胞μ.L每小时(0-6小时)、2小时(6-12小时)、12小时(12-24小时)服用一次。等价物在500年重新悬挂μ.L为洗涤一次后的Milli-Q水中。在细胞中产生的GFP的荧光强度用日立F-2700荧光分光光度计（日立，日本东京）进行测定。相对荧光强度进行平均，并作为样品，以对照菌株窝藏pAL7代替报告质粒（OSP210-0或OSP220-0）的比率来计算。图像拍摄在Zeiss的Axiovert 200M倒置显微镜通过的AxioVision控制AxioCam MRM电荷耦合照相机。测定法使用独立的转化进行。

2.3.2。剂量依赖性测定

在预孵育后，将细胞转移到EMM-N，以在600nm处给出1.5的初始光学密度。将每个浓度的P型p末端暴露于30℃的细胞24小时，测量荧光强度。标准化数据适合等式：．表示各p因子浓度下的当前响应，．为最大响应。是p因子的浓度，产生半最大响应。γ是山坡系数。

结果

3．1.从pAL7中获得的易处理报告质粒

为了制备报告分析的转化体，我们构建了具有疏忽和敏感性的新报证质粒。记者质粒使那些转化体通过MAM2-P系环信号转导途径（配合途径）产生绿色荧光蛋白（GFP）。为了确定报告质粒上最合适的信息素依赖的报告区，我们专注于先前据报道的7个基因通过添加p族来急剧激活[24.，30.］.这些基因的上游区域用作GFP的诱导型启动子。作为GFP的下游区域，我们使用LPI终止剂，其在裂变酵母细胞中正确地工作为基因终止剂。每个所得质粒（在表中列出）2)变成了SXA2.Δ菌株，OSP210 (h−,leu1-32，URA4-D18，SXA2.Δ)。之所以SXA2.缺失基因是因为SXA2蛋白是p型的特异性肽酶。对1或0的响应 μ.缺氮条件下磷因子M见表2．所有上游区域，除了dhc1上游区域表达GFP。的mam2上游地区比其他地区更强烈地回复。然而，信噪比（SNR）的信号mam3和SXA2.上游区域优于上游区域mam2上游区域。接着，我们确定某些下游区域是否更适合于3'GFP的UTR比LPI终止，因为据报道，3'mRNA的UTR调节其稳定性和对表达水平的效果[31.］.将每种质粒的报告区中的LPI终止子与其上游区域对应的下游区域替代以再现天然基因组背景。的结合dhc1区域没有反应，提示转录的重要区域可能位于ORF或本研究使用的区域的外部。的SPK1.下游区域在没有p系子的情况下降低了背景。的mam2和mam3下游区域对p因子的响应明显降低，而下游区域对p因子的响应明显降低SXA2.显示与LPI终结者的差异很小。SPBC4.01和rgs1下游区域急剧提出了反应，但很清楚rgs1下游区域所提出的表达水平，而不依赖于P-因子。在努力准备相应的记者地区，mam2，mam3,和SXA2.上游区域大概包括激烈的信息素依赖性上游激活序列与SPBC4.01下游区域合并。正如我们所预料的，的组合SXA2.上游和SPBC4.01下游区域的响应均有所提高，背景值增加不大。从而获得了最佳的信噪比。我们间接调查了两个报告质粒;一个是pAL7-Umam2-GFP-LPI包括最密集的报告区域，另一个是pAL7-USXA2.-GFP-DSPBC4.01，报告区域信噪比最高。

我们探讨了含pAL7-U菌株的GFP产生的时间依赖性mam2-GFP-LPI（OSP210-2）或pAL7-USXA2.-GFP-DSPBC4.01 (OSP210-17)。菌株暴露于1或0μ.在氮饥饿下的p因子m（图2(a))。菌株OSP210-2的响应不仅具有强度，而且表现出快速性，这使得它能够在添加p因子后3小时内辨别阳性反应。然而，细胞在不添加P型的情况下产生可测量的GFP蛋白。相反，Pal7-USXA2.-GFP-DSPBC4.01使细胞在无p因子的情况下产生很少的GFP蛋白。最大值较高，加入p因子后5 h内即可识别出阳性信号。这些结果与荧光显微镜观察结果一致(图)2(b))。在这两种菌株中，当荧光光谱仪检测到GFP信号时，发光细胞开始出现。同时观察到细胞体伸长形成shmoos，这是接受p因子引起的典型反应[23.］.奇怪的是，应变OSP210-2已经开始拉长大约早于应变OSP210-17两小时。我们还探讨了剂量依赖性GFP的生产（图2（C））。响应形成的矩形曲线清楚地表明，这些菌株定量可测量的MAM2-P系环相互作用。他们的EC50值没有显示出菌株之间的显着差异。建议，随后的信号转导通路的效率必须通过增加质粒的拷贝数而仍然几乎不受影响。

图2

mam2 SXA2. μ. SXA2. mam2 SXA2. SXA2. μ. μ. SXA2. mam2 SXA2. SXA2. 与报告质粒对p因子的时间和剂量依赖性反应。（a）与pal7-u的p-fact的时间依赖响应-GFP-LPI或pAL7-U-GFP-DSPBC4.01。细胞暴露于1或0m的p因子，每小时（0-6小时），2小时（6-12小时）或12小时（12-24小时）。填充圆圈描绘了OSP210-2（δ，pal7-u-GFP-LPI）+ P系子，开圈描绘OSP210-2-P-P-P-PIP，填充方块描绘OSP210-17（δ，pal7-u-GFP-DSPBC4.01) +P-factor和open square表示OSP210-17−P-factor。这些值是典型实验中三次重复测定的平均值。误差棒表示±标准误差。(b)培养基等价物(2L)安装在载玻片上，荧光显微镜可见。加入p因子后，形态逐渐改变，GFP产量增加。比例尺= 10M， (c)剂量依赖性反应。将细胞暴露于不同浓度的p因子中，加入p因子后孵育24小时。填充圆圈描绘了OSP210-2（δ，pal7-u-GFP-LPI)和填充方框表示OSP210-17 (δ，pal7-u-GFP-DSPBC4.01）。-AXIS表示最大响应的百分比。这些值是典型实验中三次重复测定的平均值。

3.2。的Cyr1.δ菌株报告质粒

腺苷酸环化酶通过编码Cyr1.基因常在交配途径中被删除。的Cyr1.Δ菌株表现出结构性饥饿，而不考虑氮和碳的存在[32.］.作为随时准备接收配体已在检测系统的对接途径的优势，所以我们研究的影响Cyr1.-缺失报告质粒。细胞暴露于1或0μ.根据存在或不存在氮P-因子的M，并且测定响应的依赖性时间（图3.）.在氮存在的情况下Cyr1.δ腐败窝藏Pal7-Umam2-GFP-LPI(OSP220-2) responded most intensely at 12 h. Compared to the strain without P-factor, the difference in GFP production began to appear at 3 h and was completely distinguishable at 4 h and beyond. However, these strains had already exhibited high background at 0 h. On the other hand, theCyr1.δ腐败窝藏Pal7-USXA2.-GFP-DSPBC4.01（OSP220-17）在4小时内变得可区分。此外，没有p系子的菌株根本不会产生GFP蛋白。不出所料，是Cyr1.+菌株含有pAL7-USXA2.-GFP-DSPBC4.01 (OSP210-17)在添加或不添加p因子时均无响应。有趣的是,Cyr1.+菌株含有pAL7-Umam2-GFP-LPI (OSP210-2)即使在氮素存在的情况下也能通过12h响应p因子。在没有氮的情况下Cyr1.δ菌株OSP220-2具有高背景，并且在氮气存在下，在约3小时时开始产生GFP。然而，这种应变并没有按预期提出响应。的Cyr1.Δ菌株OSP220-17比其他菌株早1小时被识别Cyr1.+菌株OSP210-17，响应强度也增加。的Cyr1.-缺失在菌株OSP220-17中是相当有效的，无论氮是否存在。

（一种）

（b）

（一种）
（b）

图3

Cyr1. Cyr1. μ. SXA2. Cyr1. mam2 SXA2. Cyr1. SXA2. SXA2. Cyr1. mam2 SXA2. Cyr1. SXA2. 对比δ和+菌株含有报告质粒。细胞暴露于1p因子M在有氮(a)和无氮(b)时服用，每小时(0-6小时)或6小时(6-12小时)服用一次。填充圆圈描绘了OSP210-2（Δ，+，pal7-u-GFP-LPI）+ P系子，开圈描绘OSP210-2-P-P-P-PIP，填充方块描绘OSP210-17（Δ，+，pal7-u-GFP-DSPBC4.01）+ P因子，开放式方形描绘OSP210-17-P-PIC系数，填充三角形描绘OSP220-2（Δ，δ，pal7-u-GFP-LPI）+ P-因子，空心三角形示出了OSP220-2 -P-因子，实心菱形形状描绘OSP220-17（Δ，δ，pal7-u-GFP-DSPBC4.01）+ P系子，开放式钻石形状描绘了OSP220-17-P-P-POP。这些值是典型实验中三次重复测定的平均值。

３．３．异位的mam2报告质粒在菌株中的表达

作为与报告质粒的异源GPCR测定的模型，mam2基因在内源性启动子控制下异位表达mam2Δ应变，OSP230（h−,leu1-32，URA4-D18，SXA2.Δ,mam2Δ)。用三个启动子表达mam2基因;首先，在硫胺素1中没有信息(nmt1）促进剂是最常见的诱导型启动子，并且在裂变酵母中表现出最强的表达[33.，34.];第二种是尿嘧啶调节1 (urg1)启动子，为诱导启动子，表达适度。而urg1通过从培养基中除去尿嘧啶来压抑启动子，通过添加尿嘧啶或去除氮气来最大地诱导[28.];第三种是人类巨细胞病毒(hCMV)启动子，它是强启动子激活的组成[35.］.的mam2基因在分裂酵母染色体整合载体、pSU1Z载体(或其衍生物)或报告质粒上驱动(图)4(a))。同时进行受体和报告基因导入的转化。当报告质粒的150 ng与线性整合载体的150 ng共转化亲代菌株OSP230时，)殖民地出现了。暴露于1μ.P-因子的M时，响应可以充分地在5检测mam2在6个表达式模式中，它略低于本机表达式模式(图4(b))。也许MAM2蛋白的积累可能会阻碍在何种致残OSP230-17H1中产生的GFP生产mam2在hCMV启动子的控制下，在高拷贝质粒上组成表达。另一方面，GFP的产生不受构成性染色体表达的抑制mam2表达水平高于游离表达小。诱导nmt1启动子表现出异常和染色体表达之间的差异很小。在该实验条件下，将细胞预孵育20小时，mam2基因通过诱导强烈表达nmt1promoter for 2–5 h after the intracellular thiamine was completely carried out of the cell body. Regulating the pre-incubation time might improve the response. In spite of the addition of thiamine, thenmt1启动子没有完全被压抑。此结果与先前的数据恰逢[28.］.的urg1启动子在偶体和染色体表达之间没有显着差异。在这两种菌株中，它都非常容易操作urg1启动子在本实验条件下被自动抑制和诱导。尽管我们对pAL7-U也遵循了同样的程序mam2-GFP-LPI，就像pAL7-U一样SXA2.-GFP-DSPBC4.01，分析出了错。我们之所以不能检测是细胞形成的预培养过程中并没有在所有P-因素响应聚集（图4（C））。

图4

mam2 mam2 mam2 mam2 mam2 ura4 ura4 mam2 ura4 nmt1 urg1 mam2 nmt1 urg1 mam2 μ. nmt1 μ. urg1 mam2 SXA2. mam2 mam2 异位表达Δ压力。(a)异位策略示意图内源性的表达Δ压力。剩下，基因（灰色箭头）被赶出上报告质粒。补充基因，空pSU1Z载体导入染色体上的轨迹。对，基因导入pSU1Z载体轨迹。灰色五角大楼描绘了启动子，这是启动子，启动子或hCMV启动子。这两个质粒（记者受体），同时转化。（b）基因在控制下表达启动子，启动子或hCMV启动子在染色体或报告质粒上。阳性对照为OSP210-17。OSP230-17作为阴性对照，不表达基因在任何启动子的控制下。细胞暴露于1添加p因子后分别孵育0 h(开箱)、3 h(遮荫箱)、6 h(灰箱)、12 h(填充箱)。包括启动子用0(开启)或15(关闭)测定。泰金刚。的促进剂在氮饥饿下组成型活化。这些值是典型实验中三次重复测定的平均值。误差棒表示±标准误差。（c）上部，菌株osp230-17 h2表达的预培育培养基基因在染色体HCMV启动子与Pal7-U的控制下-GFP-DSPBC4.01。较低，表达QUACH230-2 H2的预培育培养基基因在染色体HCMV启动子与Pal7-U的控制下-GFP-LPI。

4.讨论

4．1.新记者系统

本研究中构建的记者系统相当易行。随着染色体整合载体引入染色体积分载体，这些报告质粒易于高效率转化。此外，质粒如此柔韧，易于重建;例如，可以根据实验室菌株的基因型改变选择标记。此外，由于在该测定系统中产生足够的GFP进行检测，报告基因不一定是诸如LacZ或荧光素酶的强烈的，这需要在检测中进行底物降解以进行敏感读数。作为质粒的记者区域，我们得出结合SXA2.上游区域和SPBC4.01下游区域最适宜，信噪比最高。对p因子有反应的细胞在5 h开始出现，6 h发光明显，而在无p因子的情况下，24 h出现少量发光细胞。的结合mam2上游地区和LPI终结者最迅速，最强烈地响应，并开始在3小时内响应，并在4小时内绝对区分。但是，我们无法使用记者区域推荐两个原因：首先是因为过度高的背景（许多发光细胞出现在8小时内，与他人相比，SNR并不是那么好），其次是因为易于形成的非特异性聚集．

4.2。报告质粒的结合和Cyr1.删除

在pAL7-U的组合SXA2.-GFP-DSPBC4.01,Cyr1.-删除既有积极的一面，也有消极的一面。积极的方面是，实验培养基是不受限制的，细胞在几小时前就有了反应。消极的方面是Cyr1.Δ菌株变得更加难以处理;例如，拆分时间变长(30℃时，OSP210-17→OSP220-17的最大加倍时间为3.20 h→4.76 h)，转化效率明显降低(约为百分之一)。除了这些记过之外，更糟糕的是Cyr1.δ腐败窝藏Pal7-Umam2-GFP-LPI。在缺乏氮的情况下Cyr1.Δ的反应不如Cyr1.+菌株。一个解释可以是最佳预孵育时间存在差异，以便最大衡响应菌株OSP220-2和其他菌株之间的P系子。暗示，为了保留Pal7-U.mam2-GFP-LPI，细胞内条件必须略微影响（下文所述）。

4.3。异位mam2表达

作为异源gpcrs的模型，我们表达了mam2在三种启动子控制下的基因mam2Δ压力。在报告质粒上表达受体基因从根本上方便了相关实验，尽管大量的受体表达可能会导致反应中出现问题。表达式由nmt1和urg1高拷贝质粒上的启动子对p因子的接收无明显影响，但对p因子的响应降低mam2基因由HCMV启动子在高拷贝质粒上形成基因。有人提出，太多的MAM2产量可能导致展开的蛋白质反应，对细胞有害影响[36.］.因此，在有丝分裂过程中抑制外源GPCR的表达是必不可少的。事实上,nmt1尽管表现出比HCMV启动子更强的表达，启动子可以恢复良好。当测定时urg1启动子启动后，细胞在该系统中被自动抑制和诱导，操作简单。但是，要注意的是urg1启动子可以取决于细胞内条件[28.]， 所以Cyr1.δtabrese可能无法压制表达式urg1发起人以及Cyr1.+菌株。

4.4。pAL7-U的细胞内影响mam2-GFP-LPI

所述Cyr1蛋白是通过营养物通路所需感知不氮气而是碳资源[37.］.事实上，Cyr1.-缺失使细胞无法感知碳资源。然而，碳饥饿不会导致减数分裂的自噬，而减数分裂是由氮饥饿诱导的[38.］.原因是…Cyr1.- 推荐（碳饥饿模拟）影响配合途径可能是因为它有助于表达ste11基因通常在多种细胞内信号转导通路中起关键作用，不仅包括交配通路，还包括营养信号通路和应激信号通路[30.，37.］.在这项研究中，有一些间接证据表明这样的情况ste11-induction主要出现在Cyr1.+菌株含有pAL7-Umam2-GFP-LPI (OSP210-2)。菌株OSP210-2即使在氮存在的情况下也能对p因子做出响应(图2)3.）.此外，形态变化所取得的进展有关早于该菌株OSP210-17两小时（图2(b))。启动子和/或激活区域必须与GFP生产有关，但该区域不太可能对形态变化产生影响。有人建议源自Pal7-U的DNA和/或RNAmam2-GFP-LPI了ste11基因更有可能被诱导，就像应激反应和营养缺乏一样。

致谢

作者想感谢秀树Tohda博士（旭硝子有限公司，日本神奈川县）提供的技术援助和亲切提供质粒（pAL7和PSU1）和酵母菌株ARC010（h−,leu1-32，URA4-D18），这项研究中的所有菌株来自于此研究。这项工作得到了来自日本促进科学协会的创新科学研究（NO.19GS0418）的补助金提供支持。

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