在这项研究中使用的菌株是列在表中 1。裂殖酵母细胞生长在电解加工(爱丁堡基本培养基,日出科学产品、钙、美国)或EMM-N (EMM -氮,日出科学产品)。转化株被镀到MMA(基本培养基琼脂,日出科学产品)或MMA补充亮氨酸为1.25% (120 μL /板)。

大肠杆菌应变DH5 α用于质粒的subcloning准备。

肽和寡核苷酸的合成是由操纵子有限公司(日本东京)。每个肽原液的制备1毫米Milli-Q水和储存在−80°C。

准备转化株对记者分析,我们建立新的记者质粒与温顺和敏感度。记者质粒让这些转化株产生绿色荧光蛋白(GFP)通过Mam2-P-factor信号转导通路(交配途径)。来确定最合适的pheromone-dependent记者地区记者质粒,我们专注于7基因,据报道,大大激活添加p因素( 24, 30.]。这些基因的上游地区被用作GFP的诱导启动子。作为GFP的下游地区,我们使用LPI终结者,并正确地做一个基因裂变酵母细胞的终结者。每一个合成质粒(列在表 2)变成了 sxa2Δ应变,OSP210 ( h−, leu1-32, ura4-D18, sxa2Δ)。的原因 sxa2基因被删除是因为Sxa2蛋白是特定的肽酶p因素。应对1或0 μM p因素的氮饥饿下表所示 2。所有上游地区以外的 dhc1上游地区表达绿色荧光蛋白。的 mam2上游地区的反应比别人更强烈。然而,信号噪声比(信噪比) mam3和 sxa2上游地区是更好的比 mam2上游地区。接下来,我们决定是否更适合一些下游地区3′UTR GFP比LPI终结者,因为据报道,3′UTR mRNA监管它的稳定性和表达水平的影响 31日]。LPI终结者记者地区的每一个质粒与下游地区取代了对应于其上游地区复制本机基因组上下文。的结合 dhc1地区没有回应,表明转录可能定位在开放的重要地区以外的地区或用于本研究。的 spk1下游地区下降背景下p因素的缺失。的 mam2和 mam3下游地区明显降低p因素的响应,而的 sxa2显示小区别LPI终结者。SPBC4.01和 rgs1下游地区提高了响应显著,但很明显 rgs1下游地区提出了不依赖p因素的表达水平。为了准备适当的地区,记者 mam2, mam3,和 sxa2上游地区大概包括强烈pheromone-dependent上游激活序列结合SPBC4.01下游地区。正如我们所料,的结合 sxa2上游和下游SPBC4.01地区提高了背景响应几乎没有增加。因此,最好的信噪比得到这个组合。我们详细地调查了两个记者质粒;一个是pAL7-U mam2-GFP-LPI包括最强烈的地区,另一个是pAL7-U记者 sxa2-GFP-DSPBC4.01的记者地区表现出最好的信噪比。

我们探讨了时间窝藏pAL7-U GFP的生产菌株 mam2-GFP-LPI (OSP210-2)或pAL7-U sxa2-GFP-DSPBC4.01 (OSP210-17)。压力被暴露于1或0 μM p因素在氮饥饿(图 2(a))。应变OSP210-2不仅与强度表现出响应速度,使它能够区分的积极反应后3小时内添加p因素。然而,细胞产生可衡量的GFP蛋白没有添加p因素。相反,pAL7-U sxa2-GFP-DSPBC4.01引起细胞产生小GFP蛋白p因素的缺失。最大值是相对较高的,积极的信号可以歧视后5小时内添加p因素。这些结果与荧光显微镜的观察(图 2(b))。在这两种菌株,发光细胞开始出现时GFP信号被检测到的荧光光谱仪。和细胞的伸长身体形成什穆也观察到,这是典型的接待p因素引发的反应( 23]。奇怪的是,压力OSP210-2开始伸长比应变OSP210-17早大约两小时。我们也探讨了GFP存在剂量依赖的相关性(图生产 2(c))。响应曲线形成清晰的表明,Mam2-P-factor交互定量测量了这些菌株。他们的EC50值不显示菌株之间的显著差异。建议后续的信号转导通路的效率必须保持不受增加质粒的拷贝数的影响。

腺苷酸环化酶编码 cyr1基因是经常在交配通路从试验中删除。的 cyr1Δ应变展览本构饥饿不管氮和碳的存在( 32]。随时准备好接受配体的优势在交配试验系统的途径,所以我们检查的影响 cyr1删除与记者质粒。细胞暴露在1或0 μM p因素下氮的存在与否,和时间响应测量(图 3)。氮的存在下, cyr1Δ应变窝藏pAL7-U mam2-GFP-LPI在12 h (OSP220-2)反应最强烈。压力没有p因素相比,绿色荧光蛋白的差异生产开始出现3 h和完全区分4 h和超越。然而,这些菌株已经表现出高背景在0 h。另一方面, cyr1Δ应变窝藏pAL7-U sxa2-GFP-DSPBC4.01 (OSP220-17)成为区分4 h。此外,压力没有p因素没有产生GFP蛋白。意料之中的是, cyr1+应变窝藏pAL7-U sxa2-GFP-DSPBC4.01 (OSP210-17)有或没有p因素并没有显示在氮的响应。有趣的是, cyr1+应变窝藏pAL7-U mam2-GFP-LPI (OSP210-2)可以应对由12 h p因素通过即使在氮的存在。在没有氮的情况下, cyr1Δ应变OSP220-2是背景,开始产生GFP高约3 h在氮的存在一样。然而,这一毒株没有提高我们预期的响应。的 cyr1Δ应变OSP220-17成为区分早于大约一个小时 cyr1+应变OSP210-17,响应的强度也有所提高。的 cyr1删除很有效的应变OSP220-17不管氮的存在。

作为外源GPCR的模型试验与记者质粒 mam2基因表达ectopically内生其他启动子的控制下 mam2Δ应变,OSP230 ( h−, leu1-32, ura4-D18, sxa2Δ, mam2Δ)。三个推动者被用来表达 mam2基因;第一个是没有消息硫胺素1 ( nmt1)启动子,这是最常见的诱导启动子和展品最强的裂殖酵母中表达 33, 34];第二个是尿嘧啶regulatable 1 ( urg1)启动子,这是一种可诱导的启动子和表达了适度。而 urg1启动子是压抑的去除尿嘧啶的媒介,这是最大限度地引起的尿嘧啶或氮的去除 28];第三是人类巨细胞病毒()血巨细胞病毒启动子强启动子的激活既定的( 35]。的 mam2驱动基因在染色体整合向量的裂殖酵母,pSU1Z向量(或其衍生物)或记者质粒(图 4(a))。转换引入受体和记者同时执行。当父母的应变OSP230 co-transformed 150 ng记者的质粒和150 ng的线性化集成向量,37 ( SD ± 14 )殖民地出现了。暴露于1 μM p因素,充分响应可以检测到5 mam2下面表达式模式6,略有下降,在本机表达式模式(图 4(b))。也许太多的积累Mam2蛋白质阻碍的应变OSP230-17h1 GFP生产 mam2是持续表达的启动子血巨细胞病毒的控制下在高拷贝质粒。另一方面,GFP生产不是由本构抑制染色体表达的 mam2表达式是小于游离表达式。诱导 nmt1启动子的游离和染色体表达毫无区别。在本实验条件下的细胞pre-incubated 20 h, mam2基因诱导表达的强烈 nmt1启动子为2 - 5 h后细胞的胞内硫胺素完全进行了身体。调节pre-incubation时间可能提高响应。尽管硫胺素, nmt1启动子并不是完全压抑。这个结果正好与前面的数据 28]。的 urg1启动子并没有表现出显著差异游离和染色体之间的表达式。在这两种菌株,非常容易操作 urg1子以来,在本实验条件下自动抑制和诱导。虽然我们与pAL7-U遵循同样的步骤 mam2当我们与pAL7-U -GFP-LPI sxa2-GFP-DSPBC4.01,试验已经错了。我们不能分析的原因是没有回应的细胞聚集形成p因素在preculture(图 4(c))。

记者本研究系统构建是相当容易处理。甚至这些记者质粒很容易转换效率高的同时介绍了染色体整合向量。此外,质粒非常灵活,很容易重建;例如,选择标记可以改变根据实验室股票品种的基因型。此外,作为检测产生足够的GFP在这个试验系统,报告基因不必是一个强烈的如lacZ或荧光素酶,需要检测的底物降解敏感的读出。作为一个记者的质粒,我们认为的组合 sxa2上游地区和SPBC4.01下游地区是最适合由于最好的信噪比。细胞应对p因素开始出现在5 h,成为明显的发光6 h,而一些发光细胞出现24 h p因素的缺失。的结合 mam2上游地区和LPI终结者反应最迅速而强烈的反应,开始在3 h,成为绝对的4 h。然而,我们不能推荐使用记者地区,有两个原因:首先,因为过高的背景(许多发光细胞内出现8 h和信噪比不是很好与他人相比),其次是因为非特异性聚合容易形成。

在pAL7-U的结合 sxa2-GFP-DSPBC4.01, cyr1删除有正反两方面的影响。积极方面是,试验介质不是有限的,细胞反应几个小时前。消极方面的 cyr1Δ菌株变得更难对付;例如,它花了很长时间把(最大OSP210-17倍增时间→OSP220-17: 3.20 h→4.76 h在电解加工30°C)和转换效率成为显著降低(约一百)。除了这些缺点,更糟的是发生了什么 cyr1Δ应变窝藏pAL7-U mam2-GFP-LPI。根据氮饥饿, cyr1Δ应变反应那么强烈 cyr1+压力。一种解释可能是,有一个最优差pre-incubation时间最大限度地应对p因素之间的应变OSP220-2和其他菌株。这是暗示为了留住pAL7-U mam2-GFP-LPI,细胞内的条件必须稍微影响(在下面描述)。

外源GPCRs模型,我们表达 mam2基因的三种启动子的控制下 mam2Δ压力。它从根本上方便相关实验记者质粒表达受体基因,尽管巨大的受体表达可能导致问题的回应。的表达式 nmt1和 urg1启动子高拷贝质粒对p因素的接待,几乎没有什么影响,但降低响应的应变 mam2基因结构上所表达的启动子高拷贝质粒血巨细胞病毒。建议太多Mam2生产可能造成的蛋白质反应,而对细胞有害的影响( 36]。因此,它是必不可少的在有丝分裂期间抑制异种GPCR表达式。事实上, nmt1启动子可以繁殖响应尽管展示强大的表达启动子血巨细胞病毒。当试验与 urg1启动子进行,操作非常简单,因为细胞自动压抑和诱导系统。然而,请注意,诱导 urg1启动子可以依赖于细胞内的条件( 28),所以 cyr1Δ应变可能无法压抑的表达 urg1启动子的 cyr1+压力。

Cyr1蛋白质需要通过营养途径感知不是氮而是碳资源( 37]。事实上, cyr1删除使细胞无法感知的碳资源。然而,碳饥饿并不导致自噬的减数分裂,由氮饥饿诱导( 38]。的原因 cyr1删除(碳饥饿模仿)影响交配途径大概是因为它促进的表达 ste11基因通常在几个胞内信号转导途径中发挥着关键作用包括不仅交配通路还营养信号和压力信号通路( 30., 37]。在这项研究中,有一些间接的证据表明这类的 ste11感应的 cyr1+应变窝藏pAL7-U mam2-GFP-LPI (OSP210-2)。应变OSP210-2可以应对p因素即使在氮(图的存在 3)。此外,形态变化大约两个小时前取得进展比应变OSP210-17(图 2(b))。启动子和/或激活区域必须与GFP生产,但地区不太可能影响形态学改变。这是暗示DNA或RNA来自pAL7-U mam2-GFP-LPI了 ste11基因更容易诱导与压力反应和营养情况常常如此饥饿。