文摘
角膜损伤是一种常见的临床问题导致视力丧失和损害,影响了全世界数以百万计的人。目前,可用的治疗在临床实践中角膜移植,有限的捐助者的可访问性。角膜组织工程角膜修复的似乎是一个不错的选择。然而,当前的角膜组织工程实验策略不足不足导致分化的干细胞,可见,因此不能应用于临床实践。综述,我们旨在澄清的作用和有效性两个生化因素,物理调节,两者的结合诱导干细胞分化成可见。我们还将提出新颖的观点差异化策略,有助于改善角膜组织工程的效率。
1。介绍
的眼睛,角膜是最外层的结构——高度有组织的和专门的透明组织起着至关重要的作用在光的折射到视网膜,保护眼睛免受感染。当角膜受伤,激活,可见角膜基质会转变成纤维母细胞和myofibroblasts随后迁移到伤口组织重构,包括胶原原纤维的排列。然而,在病理生理条件下,可能发生纤维化的过程,导致角膜疤痕形成,包括偏差胶原原纤维。角膜瘢痕形成的病理生理学仍知之甚少,因此当前缺乏治疗恢复胶原原纤维的结构和恢复视力。角膜移植是目前唯一可用的治疗治疗角膜疤痕,但即使在许多发达国家,很难执行移植由于缺乏捐助者。因此,新的治疗方法来治疗角膜瘢痕的形成是必要的。
最近,许多研究已经关注角膜组织工程(1- - - - - -7]。研究主要集中在试图创建人工角膜结构植入临床的病人,可能会解决这个问题的有限的捐助者。在这些尝试,干细胞是常用的和分化成角膜,可见。然而,利用干细胞在组织工程角膜并非没有挑战因为适当的微环境是至关重要的实现专门分化的干细胞转化为可见。
综述,我们旨在澄清的作用和有效性两个生化因素,物理调节,两者的结合诱导干细胞分化成角膜细胞。此外,我们将提出新颖的观点差异化策略,有助于改善角膜组织工程的效率。
2。角膜和角膜损伤
角膜是由五个主要的层由前往后:上皮细胞层,Browman膜,基质层,角膜后弹力层和内皮细胞层(图1)[8]。的无血管的基质占角膜厚度的-85%,80%,这大约是0.4毫米中心向外围逐渐增加厚度(9]。它由可见,胶原蛋白(主要是胶原蛋白I型和V型),粘多糖(笑话),和蛋白聚糖(后卫)8]。维护透明度和基质力学特性是高度依赖于它的正交方向的胶原纤维,排列成束称为薄片,厚度为2μm - 200μm。在片晶之间,稀疏分散collagen-producing可见被发现(10]。可见通常被认为是静止和展览的树突形态过程扩展和互动与邻近细胞的分化和表达集群34 (CD34)和醛脱氢酶3家(ALDH3A1)。可见生产各种重要的动力包括keratocan (KERA) lumican(亮度),mimecan, decorin,实验8]。这些动力由不同的笑料,比如硫酸角质素,硫酸软骨素,dermatan硫酸(9]。此外,可见负责胶原蛋白分子的合成和矩阵metalloporteases(基质金属蛋白酶),这是维持体内平衡的意义角膜基质(9]。
角膜损伤是致盲的主要原因之一,影响了全球数以百万计的人(11]。角膜受伤时,激活角膜基质,可见将不再能够执行其生理功能,而是将转变成纤维母细胞和myofibroblasts病理生理条件下可能导致疤痕形成和失明。的调查显示,全球有超过一百万人患有失明造成眼睛损伤和大约48%的人特别引起角膜损伤(12,13]。目前,主要的角膜损伤的治疗选择是角膜移植。角膜移植的需求逐渐增加,但缺乏访问角膜移植。据报道,大约1270万人在等待角膜移植,但只有1/7可以移植,主要由于缺乏捐助者(8,14]。在2016年做的一项调查显示,平均等待时间是6.5个月前一个合适的眼角膜捐赠用于移植,而在很多国家,患者无法接受移植和失明15]。因此,迫切需要新的策略来解决移植角膜捐献者短缺。
3所示。角膜组织工程
组织工程是一个跨学科的研究领域,旨在恢复或再生受损组织在活的有机体内。更具体地说,细胞从组织分离和扩大在文化在体外。生物材料(支架)和/或生化因素结合细胞植入,随后身体允许叛变组织或器官的再生,提高病人的生活质量(16,17]。到目前为止,已经应用于组织工程杂项组织/器官如肝脏的再生(18- - - - - -20.),脊髓(19,21)、皮肤(22- - - - - -24),软骨(25],和血管[26]。在角膜组织工程领域,研究人员与自体脂肪移植人类脱细胞角膜板msc(对asc)患者角膜缺陷评估其安全性,耐受性和初步疗效。此外,体外培养的人类角膜基质干细胞(cssc)移植到招募病人治疗角膜盲。这些临床试验实现人类角膜的再生和恢复视力一直在总结表1。自临床试验显示有前景的结果,人们很容易相信,可以用来取代受损的角膜组织工程角膜捐献者短缺。
4所示。细胞用于组织工程角膜基质
近年来,已经有大量的研究在角膜组织工程。选择适当的细胞是重要的成功的组织工程和被认为是第一个在组织工程领域的核心因素。尽管,可见正常角膜的主要细胞类型,它不是一个合适的角膜组织工程的细胞类型,因为文化,可见的困难在体外。可见在含有血清培养基中培养时,他们很快就失去了树突形态,减少特定的角膜细胞标记物的表达,而是转变成纤维母细胞和myofibroblast表型(27在类似的方式在角膜受伤。为了防止培养可见的表型漂移,无血清培养基。虽然角膜细胞表型可以保持在无血清培养基培养,增殖率较低很难获得足够的细胞组织工程所需(27]。一些研究人员生成的细胞培养系统,该系统既能确保人类可见的扩张和维护他们的树突形态,培养他们对人类羊膜(27]。然而,过程复杂,需要昂贵的生长因子(27,28]。因此,根据上面提出的论点,可见不适合组织工程角膜基质的细胞。
干细胞,获得杰出的增殖能力和分化成可见的潜力,已广泛应用于组织工程角膜基质。使用的主要类型的干细胞是cssc [29日- - - - - -31日ESCs),胚胎干细胞()(5,32- - - - - -35(msc) [], mesenchymal-derived干细胞27,36- - - - - -38]。msc主要分为两类:骨骨髓来源对asc msc (bmsc)和。cssc可以隔绝人类角膜缘的地区,使用中性蛋白酶dispase。不像,可见,cssc能够接受广泛的扩张在体外而不失去分化为角膜细胞表型的能力(29日]。cssc嵌入到压缩的受伤角膜胶原凝胶已被注入老鼠导致成功再生2周后无疤痕形成(39]。与国内相比,msc更容易获得从骨髓(BMSC)或脂肪组织(ASC),和他们的自我更新能力已被证实。刘等人bmsc注入kera- / -或亮度- / -小鼠模型。发现bmsc能够生存在角膜基质和分化成角膜细胞表型(36]。然而,msc有可能分化成多种细胞类型,如心肌细胞和血管内皮细胞,从而使特定分化成,可见一个挑战[27,29日]。ESCs,来源于人类囊胚的内细胞团,似乎无限寿命和潜在的分化成任何体细胞类型(32]。然而,ESCs需要cocultured与其他细胞,如鼠标尼龙6纤维母细胞行,分化成神经crest-lineage,被认为是可见的起源,被分化成前角膜细胞表型(32]。然而,使用的伦理方面的ESCs妨碍了在角膜组织工程中的应用(40]。由于角膜的深刻探索,可见,研究人员发现,牙齿干细胞(DSC)和可见从神经嵴血统共享相同的起源。此外,DSCs易于接近和相似蛋白多糖分泌形象,可见这让他们承诺为角膜组织工程细胞类型(41,42]。作为一个例子,牙髓干细胞(DPSCs)注入老鼠发现了角膜基质形成基质细胞外基质(ECM)没有拒绝,因此表明它作为一种可能的选择的角膜细胞再生(43]。尽管所有上述干细胞是有前途的角膜组织工程和再生,他们有很大的不确定性,因为他们港口多能干细胞分化的潜能。因此,许多研究试图提高细胞分化的效率对使用各种策略,可见的监管。
5。当前策略诱导干细胞分化成可见
广泛的研究表明,微环境中起着重要作用在调节干细胞的分化命运,包括干细胞在骨髓44)、皮肤(45],肠[46),大脑47),脊髓(48),和其他(49,50]。微环境包括物理(刚度、应力或应变弛豫等)和生物化学因素(生长因子或细胞粘附分子等)(51]。作为一个例子,在骨生成,同时发现(生长因子的传播,即信息联系。,biomechanical factors) and the substrate stiffness (physical environment) played important roles in the differentiation of MSCs towards osteoblasts and are therefore considered important in regeneration of bone [52]。复杂的3 d ECM角膜基质由高度一致的胶原层和多种生长因子包括胰岛素样生长因子(IGF),转化生长因子β(TGF -β),纤维母细胞生长fator-2 (FGF-2) [53,54]。角膜基质细胞也收到各种各样的物理刺激(ECM的刚度,当地的地形,和压力),这是至关重要的发展形态发生,反应眼压波动和伤口愈合的过程,可见(55]。
受微环境,当前的方法被研究者用来区分干细胞对可见包括生化刺激(培养基、生长因子等)、物理调节(穹顶的机械刺激和地形),和系统监管(物理和生化刺激)的结合(图2)。
5.1。生化调控
以前,生化各种类别的干细胞诱导分化成,可见一直得到广泛的研究(1,2,7,27,29日,30.,36,38,41,53,56- - - - - -58),证明有积极的影响。大多数这些研究表明重大upregulation特定的角膜细胞基因表达和一些研究甚至获得与keratocyte-like树突形态分化细胞(57)(表2)。
正如之前提到的,即使可以从角膜,可见,很难维持其形态和功能在体外(59]。一些研究试图实现扩散和角膜细胞表型的维护,培养他们对动物角膜组织(36)或羊膜(AM) (28也有类似的微环境为角膜。公园等人先前获得cornea-like上皮细胞通过msc角膜上皮cell-conditioned介质,这启发他们生成一个类似keratocyte-conditioned介质(KCM)为了刺激人类的分化msc (hMSCs)对,可见27]。KCM是一个媒介,被认为包含特定的生化因素,模拟角膜细胞微环境在活的有机体内因此认为刺激人类干细胞的分化,可见。hMSCs培养在KCM塑料盘子时,角膜细胞的基因表达标记(亮度和ALDH1A1)增加,的表达α光滑的肌肉肌动蛋白(αsma)降低(27]。这个特定的研究是非常重要的,因为它是第一个证明可以刺激干细胞分化成可见在体外它还强调使用生化因素角膜细胞分化的可能性。然而,它是未知的生化因素/因素KCM角膜细胞分化中起到了至关重要的作用[27]。
为了解决这个问题,公园等人培养人bmsc KCM补充与不同浓度的胰岛素样生长因子结合蛋白2 (IGFBP2) 24小时。他们发现增加角膜细胞标记物的表达(KERA和ALDH1A1)和减少myofibroblasts标记的表情αsma,最大效果的补充500 ng / ml IGFBP2 [38]。此外,Kafarnik等人发现,人类cssc暴露于10 ng / ml FGF-2了keratocyte-like形态和表达谱(增加的角膜细胞标记物的表达,减少染色法标记的表达和干细胞标记)(57]。同样,吴等人对待cssc与0.1 ng / ml TGF -β3、10 ng / ml FGF-2,或两者的结合因素9周。这是发现FGF-2和TGF -β3对角膜细胞分化[有协同效应53),导致细胞生存能力优于细胞只有被添加的TGF -β3或FGF-2和细胞表现出类似,可见树突形态。此外,角膜细胞标志物的表达ALDH3A1和碳水化合物sulfotransferase 6 (CHST6)显著增加和myofibroblast的表达(αsma)被抑制。同时刺激FGF-2和TGF -β3对人类cssc也诱导胶原原纤维与二维多层片晶,模仿人类的角膜基质组织,并没有看到当FGF-2或TGF -β3分别给出了(53]。目前,主要有两种典型的角膜细胞分化培养基(股)。一是由先进的DMEM ascorbate-2-phosphate (A2-P) FGF-2, TGF -β3 (41]。其他分化媒体主要是基于先进的DMEM FGF-2, A2-P [2]。这意味着组成和生长因子的浓度在不同的介质可能会稍微不同的不同的研究尽管股的主要成分是相同的。角膜细胞分化的诱导KDM已被证实在各种各样的干细胞,包括对asc [1],bmsc [36),工业,30.),诱导多能干细胞(iPSC) (33,60),和牙周韧带干细胞(PDLSCs) [42]。根据这些研究,KDM对干细胞分化成有积极影响,可见这是支持大幅增加角膜细胞的基因表达标记(包括KERA和亮度)和二维胶原蛋白的沉积3]。
然而,指出keratocyte-like细胞来源于分化干细胞还不同于自然,可见在基因表达水平和表达谱和细胞形态7]。新策略的开发改善角膜细胞分化的效率。
5.2。物理管理
为了获得优越的角膜细胞形态和功能的干细胞,不仅注意力一直集中在生化刺激但角膜基质的物理环境。如前所述,物理刺激当地的地形和压力等角膜细胞行为的监管中扮演重要的角色在活的有机体内。因此,物理机械刺激等监管一直被认为是一个可能的方式刺激干细胞分化成可见。积极的机械刺激对干细胞分化的影响已被广泛研究在其他组织和细胞类型,包括软骨形成(61年]和分化成tenocytes [62年]。与其他组织,角膜基质是由紧张。因此,陈等人应用一个由静态机械刺激,模仿的在活的有机体内角膜,并发现它能够移植的表达ALDH3A1, CD34,烟囱,我上校,上校V PDLSCs [3]。摩门机械刺激也有协同效应结合股。这项研究的结果表明,物理策略是一种很有前途的角膜细胞分化的调节方法。
此外,地形线索细胞微环境调节至关重要的行为在生理和病理条件。安排和ECM组件的长度可以调节范围广泛的细胞行为,例如附着力,形态,和分化55]。角膜基质,高度有组织的环境组成的一个独特的排列的胶原蛋白片已被证明在获得角膜细胞形态学和提供了一个重要的地形线索的分化,可见(63年,64年]。特谢拉等人有教养的人,可见包含凹槽和山脊在硅基板上,从70年到2000海里强烈一致,可见在各向异性的方向模式。代,可见病灶粘连和应力纤维的减少70纳米宽脊相比micron-size模式或光滑的基质。这敏感的观察表明,可见各向异性地形刺激和合适的衬底地形能够影响,可见的行为如keratocyte-myofibroblast分化转移(63年]。此外,hCSSCs培养在对齐和随机聚脲纤维在KDM探讨地形的作用诱导ECM分泌剖面类似于本机角膜基质。吴等人发现hCSSCs分化成,可见播种基质分泌更多的ECM对齐,类似于本机角膜基质(64年]。因此,物理环境的维护是必不可少的功能和可见的行为和为干细胞的分化提供了一个线索对功能可见。
5.3。系统的监管
因为无论是生化调控还是物理调节就能达到预期的效果,研究人员倾向于结合这两种方法来实现更充分分化的结果(表3)。山药等人培养PDLSCs在三维颗粒模型(细胞悬浮在一个球形),随后诱导分化与股(6]。颗粒模型被认为是增加细胞间的相互作用(主要是cadherin-containing和connexin-containing路口)31日)和被接受作为一个适当的模型,因为它促进KERA总胶原蛋白的生产和表达,角膜基质的主要蛋白聚糖(65年]。在山药等人的研究中,他们使用颗粒模型和股更具体地埋头(角膜基质角膜细胞)感应媒体,主要基于FGF-2, TGF -β3,DMEM / F12。他们发现刺激调节keratocyte-specific标记的表达(ALDH3A1 KERA,亮度,CHST6, B3GNT7,和Col8A2)和表达下调基因的表达与纤维化和其他血统6]。一些研究者也诱导全能干细胞(人类万能33ESCs]和[34]),可见通过结合物理和生物化学的方法策略。作为万能和ESCs通常很难分化成专业成熟的细胞,它是在一个两步过程首先诱导成神经嵴谱系分化成之前,可见。奈勒等人进行了两步过程来获得人类万能keratocyte-like细胞。他们首先cocultured人类万能干细胞与骨髓基质细胞系,如尼龙6或5级补充FGF-2为了获得神经嵴细胞谱系(国立)[33]。随后,他们用股的国立细胞科学中心在颗粒模型,这是类似于真正的角膜微环境,或者在种子细胞的巩膜角膜片边缘。角膜细胞的基因表达标记从中心立即使用颗粒模型比对照组高出10倍。该中心立即培养角膜巩膜的钢圈有更高的角膜细胞的基因表达标记和达成表达水平类似发现在人类角膜,可见(33]。陈等人cocultured与尼龙6获得国立细胞科学中心在培养人类ESCs国立细胞科学中心与股颗粒模型,导致调节基因表达的keratocyte-specific标记(包括KERA, AQP1、ALDH3A1 CHST6, B3GNT7,和PTGDS),以及细胞表现出keratocyte-like树突形态表明ESCs的细胞源于人类更有足够的万能(相比32]。香港等人构建一个高度一致的3 d microfibrous脚手架类似于人类角膜的物理结构。cssc培养在支架与化学因素包括血清胰岛素,FGF-2,抗坏血酸为2周,发现一个upregulation角膜细胞特定的基因表达标记纤维化基因的差别,对这些66年]。
6。视角
干细胞分化成关于效率,可见最近经历了巨大的进展,主要是通过应用生化因素,物理规则,或两者的组合。然而,keratocyte-like细胞来源于干细胞分化为角膜组织工程仍不理想keratocyte-specific标记的基因表达水平和蛋白聚糖通常远低于那些土著,可见(6]。此外,目前的研究缺乏一个更精致的系统评价干细胞是否已经完全分化成,可见,在未来需要改进。生成一个更有效的差异化策略,我们提出以下研究领域可能的方向:
首先,小说生化因素需要彻底瓦解。尽管最近的角膜细胞分化培养基,主要由FGF-2和TGF -β3,能够诱导干细胞分化成keratocyte-like细胞,它仍然没有达到表型水平见本机角膜,可见(53]。此外,它是有问题的,因为它通常包括准备KDM几个组件,和干细胞分化成keratocyte-like至少需要14天的细胞。因此,它是极大的兴趣找到小说和更有效的生化因素来改善功效的分化。通过比较角膜组织的表达谱与其他组织为了揭开角膜组织中特异表达,对角膜组织的体内平衡很重要,可能是一个可行的方法来发现和隔离关键生化因素。它也可能是有用的彻底探索角膜基质的胚胎发育过程中映射的关键因素。此外,细胞命运是在多层次的监管,使联合分析multiomics(表观遗传,转录组、蛋白质组学等)一个有前途的方法来更好的发现生化因素刺激干细胞分化成可见。
其次,当涉及到物理的规定,有更多的方面可以被认为模仿本机角膜,可见的微环境,如刚度。先前的研究表明,干细胞将经历lineage-specific分化培养底物时,也有类似的刚度随着原生微环境(67年]。例如,msc能接受上级成骨能力培养在20 kPa衬底相比2 kPa衬底(52]。当涉及到角膜基质,周围的人类角膜的生理刚度24-39 kPa [68年)比常用的软文化大约10板6kPa。陈等人发现25个kPa的衬底刚度,这类似于自然角膜组织,代表着一种积极的影响保持培养可见的表型69年]。因此,使用特定的方法来适应细胞培养基质可能是一个有前途的方法的刚度引起更足够的干细胞分化成可见。进一步推测,结合其他的规定脚手架材料的物理性质(如材料的高度有组织的对齐)与刚度的修改可能会导致协同作用的影响干细胞的分化,可见。
7所示。结论
本文评估角色的生化因素,物理调节,两者的结合在干细胞分化为角膜细胞(图3)。生化方法,细胞因子的组合是用来实现更充分分化的干细胞转化为可见。关于物理规则,试图模拟压力和校准本机角膜胶原纤维的微环境是实现提高干细胞分化成,可见。然而,当前的方法诱导干细胞分化成可见的水平仍有其局限性keratocyte-specific基因和蛋白聚糖的表达低于本地,可见。建议未来的进程是执行尝试寻找新的有效的生化因素通过执行深入分析的因素在角膜组织与其它组织相比解开什么是在角膜组织中特异表达或通过细致的探索因素参与角膜基质的萌芽期的发展。将有价值的方面结合组织物理规定为了完成一个模拟的实验微环境在活的有机体内环境角膜,可见通过调节刚度,地形和其他基质的物理性质实验微环境。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
艾尼张和(音译)的贡献同样这项工作。
确认
这项工作是由中国国家自然科学基金资助(31900962,31900962),江苏省自然科学基金(BK20190354 BK20190356),中央大学的基础研究基金,这些基金Zhishan年轻学者(东南大学)和返回的科学研究基金会学者(1124007113)。