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干细胞国际
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干细胞国际/2021/文章

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体积 2021 |文章的ID 8825332 | https://doi.org/10.1155/2021/8825332

Sarah Ezquerra, Amparo Zuleta, Rodrigo Arancibia, José Estay, Francisco Aulestia, Flavio Carrion， ＂人源间充质干细胞球形细胞的功能特性:meta分析和系统综述"，干细胞国际， 卷。2021， 文章的ID8825332， 12 页面， 2021． https://doi.org/10.1155/2021/8825332

人源间充质干细胞球形细胞的功能特性:meta分析和系统综述

莎拉Ezquerra，1 帕罗Zuleta，1 罗德里戈Arancibia，1，2 何塞Estay，1，2 旧金山Aulestia，1，2 和 弗拉维奥腐肉3.

1Cellus Medicina Regenerativa S.A, compjo Boulevard Kennedy, Av. president Kennedy, 5741，智利圣地亚哥

2Cellus Biomédica, Parque Tecnológico de León, C/ Julia Morros s/n, 24009, León，西班牙

3.智利阿勒马纳大学医学院Inmunología Traslacional program, Clínica Alemana university del Desarrollo, Santiago 8320000

学术编辑器:幕斯塔法Najimi
收到了 2020年8月23日
修改后的 2021年1月31日
接受 2021年2月12日
发表 05年4月2021年

摘要

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSC)是一种成熟的多能细胞，可从脂肪组织、骨髓、脐带等多种组织中分离得到。它们在以细胞治疗为基础的治疗中显示出巨大的潜力，这就是为什么它们被用于许多疾病的临床试验。然而，安慰剂对照临床试验的成功一直受到限制，因此正在开发新的方法来提高MSC的治疗效果，如将它们组装成三维构象。在这项荟萃分析中，我们综述了脂肪组织、骨髓和脐带来源的间充质干细胞(组装成球状)的聚集形成、体外功能特性和体内治疗潜力。我们使用PubMed和SciELO数据库来寻找符合条件的文章，使用与该主题相关的自由词和MeSH术语，发现28篇已发表的文章符合所有的纳入和排除标准。在选取的文章中，15篇对应于使用骨髓间充质干细胞的研究，10篇来自脂肪组织，3篇来自脐带血或组织。与单层2D培养相比，MSC椭球体特性表现出增强，包括干性、血管生成、分化潜能、细胞因子分泌、旁分泌和免疫调节作用。总体研究表明，MSC球形细胞在体内的应用增强了治疗效果。例如，研究表明，由于免疫调节作用，炎症减少，伤口愈合、闭合、功能恢复和组织修复更快，MSC在受损组织中的移植更好，MSC存活率更高，损伤时的凋亡更少。然而，需要进一步的研究和临床研究，以控制和一致的结果，以了解MSC球形细胞的真正治疗效果。

1.介绍

间充质干细胞(MSC)是从各种成人组织中分离出来的可塑贴壁、成纤维细胞样、非造血祖细胞。MSC具有自我更新能力，可分化为若干组织特异性谱系，包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞和心肌细胞等[1，2]．MSC可以从多种组织中获取，包括骨髓(BM-MSC)、脂肪组织(AT-MSC)、脐带(UC-MSC)、沃顿果冻(WJ-MSC)、牙龈(G-MSC)和软骨组织(C-MSC)等[3.，4]．国际细胞治疗学会(ISCT)建立了识别MSC的三个关键特征:首先，间充质干细胞在标准条件下培养时必须显示出对塑料的粘附。其次，MSC群体必须表达CD105、CD73和CD90(≥95%)，而不表达CD45、CD34、HLA-DR、CD14或CD11b、CD79a或CD19(≤2%)。第三，体外培养的MSC必须具有成骨、成脂和成软骨分化[5]．MSC除了具有多能分化的能力外，主要被认为是免疫回避细胞，可分泌许多促进组织修复和再生的关键营养因子[6- - - - - -8]．因此，MSC似乎是再生医学治疗的一个有吸引力的选择，因为有可能使用这些细胞的异体群体或更分化的谱系[9]．基于MSC分化和成熟为特定表型的能力，它们的免疫调节特性，以及在组织再生过程中独特的迁移和强大的营养效应，其临床应用潜力是显著的[10，11]．

在撰写本文时，目前有874项临床研究报告使用MSC治疗不同的疾病(www.clinicaltrials.gov)．然而，小型临床研究中MSC基础疗法的有益效果往往没有大型随机双盲、安慰剂对照临床试验的证实[12，13]．一些无法达到临床目的的临床研究表明，在骨髓间充质干细胞长时间的体外扩增后，其免疫抑制特性发生变化，移植后存活率不足[14，15]．这意味着有必要了解MSC发挥作用的再生和免疫调节机制。此外，还需要增强MSC功能特性的新方法，目前仅在单层2D培养中进行临床应用。虽然这是一个简单的过程，但在体内的一些基本品质和特征会受到损害或丧失。

因此，3D细胞培养成为一种新的治疗选择，可以更好地保存这些特性，允许更好地模拟体内条件，特别是在胚胎发育期间观察到的细胞自组装，从而增加细胞相互作用[16，17]．为了促进这种相互作用，开发了几种椭球形成技术。与单层培养相反，球形MSC三维培养可引起基因表达模式的显著变化[18，19]．多种研究表明，通过聚集形成，干细胞的功能可以得到改善，细胞注射到靶组织后可以避免不适当的迁移[20.- - - - - -22]．然而，三维构象的确切机制仍不清楚，尽管已经提出了几种信号通路[23- - - - - -28]．例如，已有研究表明，在3D构象培养的MSC中，转录共激活因子yes-associated protein/转录共激活因子与pdz结合基序(YAP/TAZ)的表达降低与肌动蛋白细胞骨架的缺失相关[27，28]．在其他研究中，Zhang等显示缺氧诱导因子(HIF)-1和-2的表达增加α在MSC球状体中，与抗氧化应激引发的凋亡增加有关[23]．本荟萃分析旨在综述脂肪组织、骨髓和脐带来源的间充质干细胞组装成球状的球状体的形成、体外功能特性和体内治疗潜力。

2.材料和方法

2．1．搜索策略

在PubMed和SciELO数据库中，使用特定的免费词和MeSH术语搜索2019年5月之前符合条件的已发表文章。我们使用了以下术语的不同组合:细胞类型:间充质细胞、基质细胞、干细胞、多能细胞、多能细胞;细胞组织:三维、球形、簇状、器官状、聚集状;应用范围:细胞治疗、组织再生、治疗、治疗、功能恢复;病变:骨骼肌、肌肉软骨、肌腱或关节病变;骨关节炎、慢性损伤、免疫疾病、神经退行性疾病、神经病理学、骨病理学;培养条件:缺氧、低氧、无异种、无血清、无动物;特性:分泌体、外泌体、囊泡、免疫调节。在获得的结果中，只包括了用英文发表的文章，并排除了2008年以前发表的与癌症有关的文章。从选定的文章或与该主题相关的评论的参考文献中确定了其他可能的文章。

2．2．选择标准

纳入标准如下:a)人类MSC;b) MSC来源:骨髓、脂肪组织或脐带;C)专注于细胞治疗和再生医学的研究。排除标准如下:a)文章不符合纳入标准;B)复查和病例报告;c)专注于MSC球体在生物工程中的应用和/或使用的工作。

2．3.数据提取

从纳入的文章中提取的数据包括:作者、年份、国家、标题、MSC组织来源、细胞聚集协议、培养条件、球体测量、体外功能特性、上述特性的改变标记、体内治疗效果和使用的研究模型。

２.４.限制

只包括以英文发表的文章，可能不包括以其他语文报道的其他符合条件的出版物。因此，由于数据有限，对结果的解释应谨慎。

3.结果与讨论

3．1.搜索结果

在PubMed (n =131)和SciELO (n =123)中搜索到与MSC三维构像相关的254篇文章后，根据材料与方法中描述的搜索策略，只有71篇文章被评估合格。在这71篇文章中，根据材料和方法中描述的纳入标准(人MSC，从骨髓、脂肪组织或脐带中获取的MSC，以及专注于细胞治疗和再生医学的研究)，只有28篇文章被纳入本meta分析(图)1)．


图1
荟萃分析研究选择。

所选的28篇文章的列表及其基本描述(作者、年份、国家、MSC来源、评估的属性和参数、引用号)如表所示1．
作者(年代) 一年 国家 MSC的来源 对MSC椭球体的性质和参数进行了评估 参考
Alimpertiet al。 2014 美国 骨髓 增殖和分化潜能(成骨，成脂和成时)，表面标记物表达，无血清培养。 ［48]
阿摩司等。 2010 美国 脂肪组织 基因表达和蛋白水平测定，体内治疗潜力(糖尿病创面模型)。 ［29]
Bartosh et al。 2010 美国 骨髓 抗炎和抗肿瘤分子表达，体外和体内治疗潜力(腹膜炎模型)。 ［21]
Bartoshet al。 2013 美国 骨髓 免疫调节因子分泌、IL1信号转导、体外抗炎作用(巨噬细胞免疫实验)、体内MSC球状形成。 ［31]
Bartoshet al。 2014 美国 骨髓 MSC球形表征、免疫调节因子检测、体外巨噬细胞免疫检测。 ［32]
大麻et al。 2012 韩国 脐带血 血管生成因子分泌、凋亡/抗凋亡基因表达、体内治疗潜力(后肢缺血模型)。 ［33]
Cesarz et al。 2016 美国 骨髓 BMP2、IL1与弹性相关信号、生长因子、细胞因子及伤口愈合相关基因表达。 ［19]
程等。 2012 台湾 脂肪组织 茎干、增殖分化潜能、体内移植(裸鼠模型)。 ［51]
程等。 2013 台湾 脂肪组织 干细胞性、血管生成和趋化潜力、成脂和成骨分化潜力、体内治疗潜力(伤口愈合模型)。 ［18]
赵等。 2017 韩国 脂肪组织 凋亡标志物和生长因子表达，体内治疗潜力(弹性蛋白酶诱导的肺气肿模型)。 ［49]
科斯塔等。 2017 葡萄牙 骨髓 氧化应激，血管生成，趋化和伤口愈合潜力，免疫调节因素。 ［40]
Coyle et al。 2019 美国 脂肪组织 葡萄糖，ATP和乳酸评估，代谢底物分析，数学建模。 ［30.]
江等。 2017 中国 骨髓 细胞保存和存活分析，转录组分析，免疫调节活性，体内治疗潜力(结肠炎模型)。 ［34]
金等。 2018 韩国 骨髓 外泌体的产生，MSC球形大小，细胞密度和形态评估。 ［35]
劳伦斯et al。 2019 美国 骨髓 成骨分化潜能、分化标志物表达。 ［36]
李等人。 2016 韩国 脂肪组织 缺氧诱导的血管生成细胞因子和细胞外基质成分的表达，体内增殖潜能(后肢缺血模型)。 ［45]
李et al。 2015 中国 脐带组织 茎干、增殖分化潜能、代谢分析、体内治疗潜能(ccl4诱导急性肝衰竭模型)。 ［50]
Mineda et al ., 2015 日本 脂肪组织 茎干、血管生成和抗炎基因表达标记物、体内治疗潜力(缺血-再灌注损伤，SCID小鼠)。 ［52]
米兰达et al。 2019 葡萄牙 脐带组织 分泌体的产生、细胞因子/趋化因子的分泌、迁移和分化潜能、体内治疗潜能(佐剂诱导关节炎模型)。 ［41]
Oberringeret al。 2018 德国 脂肪组织 细胞因子基因表达和蛋白水平，成脂潜能，组织愈合相关血管生成潜能。 ［46]
公园et al。 2017 韩国 脂肪组织 光生物调节，血管生成潜能，内皮和平滑肌细胞分化潜能，体内治疗潜能(皮瓣模型)。 ［47]
Redondo-Castroet al。 2018 英国 骨髓 白细胞介素-1启动，营养因子和细胞因子分泌，血管生成，再生和免疫调节潜能。 ［44]
徐et al。 2016 中国 脂肪组织 血管生成、抗凋亡、抗氧化因子和细胞因子分泌、体内治疗潜力(缺血-再灌注肾损伤模型)。 ［37]
Ylostaloet al。 2012 美国 骨髓 体外免疫调节潜能(巨噬细胞免疫测定)，条件培养基的产生，抗和促炎细胞因子的分泌。 ［20.]
Ylostaloet al。 2014 美国 骨髓 免疫调节潜能，IL1信号分子表达，癌细胞生长效应。 ［38]
Ylostaloet al。 2017 美国 骨髓 分泌组的产生，抗炎和抗癌因子的分泌，体外和体内免疫调节潜能(急性全身炎症，LPS)。 ［39]
齐默尔曼et al。 2014 美国 骨髓 IFN-g和TNF-a的启动，免疫调节旁分泌因子的分泌，体外免疫调节电位(巨噬细胞免疫试验)。 ［42]
齐默尔曼et al。 2017 美国 骨髓 IFN-g引物、IFN-g微粒传递、免疫因子分泌、体外免疫调节电位(t细胞活化和巨噬细胞免疫检测)。 ［43]
表1
在分析中包含的发表文章的描述。对于每一篇发表的文章，作者(s)、年份、国家、MSC的组织来源、评估的属性和参数，以及参考编号都显示出来。

可以注意到，这篇综述中包含的最早的工作是在2010年5月[29]，最新一期已于2019年4月发表[30.]．2017年发表文章最多(n =5篇)，2014年、2016年和2018年陆续发表文章，各4篇。收集到的文章最多的是在美国进行的工作，共发表了13篇文章，占所有文章的46.4%，其次是韩国，共5篇(17.9%)和中国，3篇(10.7%)1)．在选取的28篇文章中，15篇对应于使用骨髓间充质干细胞的研究，10篇来自脂肪组织，3篇来自脐带血或组织。

总之，评估最多的MSC球体特征是干性、血管生成、分化、细胞因子分泌、旁分泌效应、代谢功能和免疫调节效应(见表)1)．

3．2．细胞聚合协议

形成MSC椭球体的方法和技术有很多，在这里我们发现最常用的方法是悬挂滴法(n = 13) [19- - - - - -21，29，31- - - - - -39]，然后是强制聚合(n = 4) [40- - - - - -43，低依恋(n = 4) [44- - - - - -47，自发集会(n = 4) [30.，48- - - - - -50]，则壳聚糖膜(n = 2) [18，51]，最后是透明质酸凝胶(n = 1) [52)(图2)．悬挂滴技术包括将MSC悬浮液以确定体积的液滴镀在培养皿的盖子上。迅速小心地翻动盖子，并将其放置在盛有溶液的培养板上，以避免液滴蒸发。球体形成于水滴的顶端。这种方法可以产生大小可控的球体，由每一滴细胞的数量与细胞悬液的浓度和液滴的体积决定，而且不需要专门和昂贵的设备[32，38]．尽管这项技术显示了许多优势，但它仍然为大规模生产用于治疗的MSC球形体提出了一个问题[53，54]．用于形成MSC球状体的其他技术是强制聚集法，该方法通过施加离心力，在有无生物材料存在的情况下使用微孔板诱导MSC在体外聚集[40，42，43]．另一方面，已有研究表明，间充质干细胞的免疫调节活性似乎不是自发的，但需要间充质干细胞通过炎症微环境的“许可”来发挥其作用[11，55]．在这一研究中，Krampera和Ren证明了MSC介导的免疫抑制需要免疫细胞通过分泌促炎细胞因子IFN-g，单独或与TNF-a、IL-1a或IL-1b共同激活MSC [56，57]．在本综述中，选取28篇文章中的4篇使用细胞因子启动来改善MSC的功能特性(图)2)[29，42- - - - - -44]．


图2
细胞聚集协议，培养条件和球形直径选定的物品MSC来源。文章引用号在括号中。
3．3.培养条件

对于符合临床应用资格的MSC球体，它们需要是无异种的(不含任何动物源性成分)。含血清的培养基可能携带病毒或支原体污染的意外物质[48]．因此，在不含胎牛血清的培养基中形成球状是至关重要的。在这项分析中，我们发现28篇文章中有8篇在细胞聚集协议中使用无血清培养基(图)2)．FBS在椭球体形成过程中细胞聚集的重要性被高度重视，与椭球体表现出更快的组装和更明确的边缘相关。用于替代胎牛血清的一些策略包括使用化学定义的培养基，其中所有成分都已知，成分可以控制，或用患者来源的血清或人血清白蛋白补充培养基[39]．

此外，在椭球体装配过程中控制氧气水平也会有有益的效果。三篇文章使用了缺氧作为间充质干细胞聚集物的启动方法[30.，33，46)(图2)．有研究指出，细胞聚集过程中的缺氧条件可以改善MSC的性能。例如，由于IL-6、IL-8和MCP-1水平升高，旁分泌效应增强[46]．从生理学角度来看，在缺氧条件下培养的MSC可以更好地为损伤组织典型的缺血环境准备细胞。

3．4．球体直径

令人惊讶的是，球体大小似乎并不均匀，6篇文章显示相似的直径范围为200-500μM、4条物品直径范围在100-200之间μM，直径在0-50之间μM, 1的椭球直径在50-100之间μM，最后1条为球形直径> 500μm(图2)．另一种用于描述球体大小的测量方法是球体内细胞的数量，5个样本显示了10000 - 25000个细胞/球体，3个样本显示200- 1000个细胞/球体，1个样本显示细胞浓度大于> 25000个细胞/球体(图)2)．这是聚集过程开始时细胞的初始数量。有些文章(n = 4)未提及MSC球体直径或大小(图)2)．球体的大小很重要，因为直径可以决定营养和氧气的可用性，以及MSC间细胞间接触产生的机械力，调节基因表达[58]．

3．5．MSC球形细胞的体外特性

评估MSC功能特性的不同方法可以从选定的作品中识别出来。这些性状可以通过基因表达、蛋白质分泌、表面标记表达、培养和差异染色的变化来研究。Stemness通常通过转录因子Nanog、Oct-3/4、Sox-2、Klf4、c-Myc、STAT3的表达来评估，同时也通过表面标记CD105、CD90、CD73、CD34等来评估[16，18，50]．MSC对血管生成的影响主要通过VEGF和HGF等因子的表达来评估(表)2)．作为间充质干细胞的一个特征特征，对几种组织的分化潜能也进行了研究，通常通过不同的染色技术，如茜素红、阿利新蓝和油红O染色，分别确定成骨、成软骨和成脂肪分化。MSC分泌的细胞因子和可溶性因子具有显著的治疗效果。分析的细胞因子包括生长因子、趋化因子、白细胞介素等1和2)．也有证据表明旁分泌MSC具有抗癌、抗凋亡和抗氧化应激的作用(见表)1和2)．似乎MSC的免疫调节作用受到了很大的关注，因此通常评估TSG-6、PGE2、LIF、IDO、STC1、IL-6、IL-8等的表达，以及MSC降低TNF-水平的能力α(表2)．
MSC的来源 功能性质
骨髓(ref) 体外 主要发现
48 无血清球体维持MSC表型。高分化潜力(3D与2D培养条件下)。 表面标记物(CD105、CD90、CD73、CD34)阳性。具有较高的成骨、成时和成脂分化能力。
21 高分泌抗炎和抗肿瘤因子(3D vs 2D)。从球体中提取的MSC保留了二维MSC的特性。在小鼠巨噬细胞免疫试验中具有高的抗炎作用(3D vs 2D)。 TSG-6、STC1、LIF、IL-24、TRAIL分泌增多。相似的增殖、免疫表型和分化潜能。高抑制巨噬细胞分泌TNF-a。
31 小鼠腹腔内注射黏附MSC后，MSC形成球状结构。抗炎因子和IL1以及notch信号分子的高基因表达。caspase依赖的IL1信号通路的激活(3D vs 2D)。il - 1信号激活后抗炎作用高。 COX2, TSG6, STC1基因高表达。TSG-6、COX 2、STC1、IL1及notch相关分子上调。IL1a, IL1b分泌增多。PGE2分泌增多及对LPS刺激巨噬细胞的免疫调节作用。
32 MSC椭球体制备方案。 使用悬滴培养高效的MSC球体形成。
19 免疫、血管生成和生长因子的高基因表达和蛋白水平(3D vs 2D)。BMP2处理后免疫调节因子表达减少。IL1B处理后免疫调节因子和生长因子基因高表达。 IL1B、IL8、PTGS2/COX2、TNFAIP6、SOD2、CXCL1、CXCL2、CCL2、CCL7、BMP2、BMP6高表达。IL1B、IL8、PTGS2/COX2、TNFAIP6、SOD2、CXCL1、CXCL2、CCL2、CCL7表达较低。BMP2、IL1B、IL8、LIF、PTGS2/COX2、TNFAIP6、SOD2高表达。
40 条件培养基诱导的趋化潜能增加(3D，海藻酸盐包被3D相对于2D)。增强免疫调节的潜力。增强的血管生成潜力(海藻酸盐包裹的3D与2D)。 在海藻酸盐包裹的球形细胞存在下纤维母细胞的更高迁移。TSG-6在囊化和非囊化球体中表达较高。高proangiogenic潜力。
34 环境条件下的存活率提高(hESC衍生的msc, 3D vs 2D)。环境条件下的低细胞代谢和增殖-恢复的MSC。环境条件下恢复的MSC保留了2D MSC的特性。 更高的MSC生存。较低的细胞代谢和增殖与生存率的提高相关。相似的基因表达，免疫表型，分化和免疫抑制潜能。
35 分泌组分泌增强(3D vs 2D)。 在较大的球体中外泌体产生的更高效率。
36 高软骨/钙沉积。增强的成骨细胞分化(3D vs 2D)。 存在纤维和矿化的细胞外基质，微钙化沉积物。更高的成骨分化能力。
44 用促炎细胞因子启动后，细胞因子的高分泌(3D vs 2D)。诱导IL1后细胞因子分泌旺盛。诱导IL1后球形条件培养基的高免疫调节作用。il - 1启动后的有效免疫谱(3D vs 2D)。 G-CSF、IL-1Ra、VEGF分泌增多。24小时条件培养基中IL-6和G-CSF分泌增加。LPS处理的BV2小胶质细胞中TNF-a分泌减少。MCSF、TNF-b、CC7/MCP3、Gro-a-CXCL1、CCL22、TNF-a、CCL23、IL-6、IL-19、IL-8、MIG/CXCL9和G-CSF高表达。
20. 高免疫调节效应(球形、球形来源的细胞及其条件培养基相对于2D)。条件培养基具有较高的免疫抑制效果(3D vs 2D)。高的抗炎活性。 有效抑制lps刺激的巨噬细胞TNF-a分泌。TNF-a、CXCL2、IL-6、il - 12p40、IL-23减少，IL-10、IL1ra分泌增加。PGE2高分泌，依赖于COX-2，由EP4受体介导。
38 在含HSA的无异种培养基中增强特性。高抗炎作用(条件培养基)。免疫调节和抗癌相关分子的高基因表达(3D vs 2D)。体外抗癌效果高(球形条件培养基)。 细胞活力高，细胞产量高，细胞体积小。减少肿瘤坏死因子αlps刺激的巨噬细胞IL-10分泌增加。高PGE2和TSG-6分泌。PGE2、TSG-6、TRAIL、IL-24高表达，TNF-a低表达。减少前列腺癌细胞生长(LNCaP细胞)。
39 抗炎和抗癌分子的高表达。高的抗炎和抗癌作用(条件培养基)。 PGE2、TSG-6、TRIAL和IL-24上调。减少肿瘤坏死因子αlps刺激的巨噬细胞IL-10分泌增加。减少cd3刺激的脾细胞产生IFN-g。减少前列腺癌细胞生长(LNCaP细胞)。
42 免疫调节旁分泌因子的高分泌(3D vs 2D)。TNF-a和/或IFN-g授权后免疫调节因子的高分泌(3D vs 2D和两种不同的细胞培养基)。TNF-a和/或IFN-g许可后具有高免疫抑制效果(3D vs 2D)。 PGE2、TGF-分泌增多β1、IL-6和IDO活性相似。FBS培养基培养的球形细胞PGE-2、IL-6和IDO活性升高。tnf /IFN-g启动后，lps刺激的巨噬细胞对TNF-a分泌的更高抑制。
43 高持续免疫调节活性(微粒子递送的球状IFN-g)。在小鼠巨噬细胞实验中具有高的抗炎作用。 高持续性IDO表达，增强t细胞活化和增殖抑制。减少肿瘤坏死因子α巨噬细胞分泌IL-10增加。
脂肪组织
29 血管生成、增殖、迁移和ECM沉积相关蛋白的高表达(3D vs 2D)。 纤维连接蛋白、纤维蛋白原、TIMP1、MMP2、TGF表达增高β1、FGFb、IGFBP-1、EGF、HGF、VEGF、MMP14、tenascin C和collagen VI - 3。
51 高细胞存活率和ECM分子分泌(在壳聚糖膜上形成球形，3D和2D)。增强茎干，增殖和分化潜能(3D vs 2D)。 更高的活力和层粘连蛋白和纤维连接蛋白的分泌。Nanog基因表达和蛋白水平较高，Sox-2, 10月4日。具有较高的增殖效率、菌落形成活性和成骨、成脂分化及转分化能力。
18 增强茎干、血管生成和趋化潜能(3D vs 2D)。 更高的细胞生长速度和更低的衰老。Sox2、Oct4、Nanog、HGF、VEGF基因表达及蛋白水平较高。CXCR4、MMP-9和MMP-13高表达。
49 增强细胞凋亡抗性和生长因子分泌(3D vs 2D)。 BCL2, FGF-2, VEGF表达增高。bcl - 2 /伯灵顿比率更高。更高的VEGF蛋白水平。
30. 不同葡萄糖和氧气浓度下的球形生存潜力(数学模型)。 球状葡萄糖利用率和生存能力之间高度线性相关。
45 高血管生成潜力(3D vs 2D)。增强了对anoikis的抵抗力(3D vs 2D)。 VEGF、HGF、SDF-1、HIF-1a、纤连蛋白、层粘连蛋白表达增高。AKT磷酸化水平升高，PARP-1和cleaved caspase-3表达降低。
52 增强茎干，血管生成和抗炎潜力(在HA凝胶制备的球形相对于2D)。 VEGFA、VEGF B、HGF、PDGFA、PDGFC、IL1RN、IL11和NANOG、OCT3/4、STAT3标记物基因表达较高。高表达SSEA-3干细胞标记物。
46 增强旁分泌和再生作用。 在缺氧反应中IL-6、IL-8和VEGF的高基因表达。
47 光生物调节照射后的高血管生成和组织再生潜力(3D vs 2D)。 FGF、vegf和HGF分泌增多。CD34、CD31、KDR阳性。
37 高再生，抗凋亡和抗氧化潜能(3D, 3D来源的细胞相对于2D)。细胞因子和免疫调节因子的分泌增强(3D, 3D来源的细胞vs 2D)。 I型胶原蛋白，纤维连接蛋白，层粘连蛋白分泌增多。过氧化氢酶、SOD-1、Bcl-2、P-akt表达水平升高，cleaved Caspase3表达水平降低。VEGF、EGF、IGF、bFGF、HGF、TSG-6分泌增多。
脐带
33 增强成骨和抗凋亡潜能。低氧条件下高存活率和抗凋亡作用(3D vs 2D)。 高表达CEGF, FGF2, HGF和Bcl-2。更高的细胞活力和Bcl-2表达。
50 增强茎干，增殖和分化潜能(3D vs 2D)。 高的表达Klf-4原癌基因。具有较高的成骨和成脂分化潜能。
41 高的抗炎作用条件培养基(3D vs 2D)。条件培养基对小鼠软骨细胞的高运动效应(3D vs 2D)。 高水平的抗炎和营养因子(IL-10, LIF, PDGF-BB, FGF-2, I-309, SCF, GM-CSF)。更高的软骨细胞迁移能力。
表2
在体外MSC球体的功能特性。
3.6。MSC球形细胞的体内治疗作用

在所有被回顾的文章中，只有13篇评估了MSC球形细胞在体内的治疗效果(见表)3.)， 2件使用BM-MSC, 8件使用AT-MSC, 3件使用UC-MSC。用于研究体内效应的研究模型有多种，如伤口愈合或促炎疾病模型，但主要使用的是缺血动物模型(见表)3.)．在体内的研究包括球形移植或应用从球形培养得到的条件培养基到目标组织。整体研究表明，与单层二维培养相比，MSC球形细胞在体内的应用可增强治疗效果。研究显示，3D构象的MSC效果更好，包括减少炎症、加快伤口愈合和闭合、功能恢复和组织修复(由于免疫调节作用)、更好的MSC在受损组织中的植入、更高的MSC存活率和更少的损伤凋亡(表)3.)．
MSC的来源 治疗效果 动物实验模型
体内主要发现
骨髓(ref)
21 3D比2D具有更高的抗炎作用(球体治疗可降低中性粒细胞活性，以及TNF-a、IL-1b、CXCL2/MIP2和PGE2水平)。 小鼠zymosan-induced腹膜炎。
34 环境条件下恢复的MSC保留治疗效果(3D vs 2D)。 DSS和tnbs诱导的小鼠结肠炎模型。
39 抗炎作用强(PGE-2、IL-10升高，TNF-a降低)。 lps诱导小鼠全身炎症。
脂肪组织
29 增强创面愈合(3D与2D创面愈合速度相比更快)，更高的tenascin C、胶原VI a3、纤维连接蛋白、MMP2、MMP14和HGF的生成。 糖尿病小鼠创面模型。
51 高的治疗效果。后肢肌内注射后细胞滞留率较高(3D vs 2D)。 裸小鼠模型。
18 更高的再生能力(3D相对于2D)。增强皮肤伤口愈合，细胞移植和血管生成。 创面愈合裸鼠模型。
49 增强therapeutic再生效果(3D vs 2D)。更大的肺组织再生和更高的FGF2和HGF表达。 弹性蛋白酶致肺气肿小鼠模型。
45 在缺血组织中更高的细胞存活率和增殖(3D vs 2D)。 小鼠后肢缺血模型。
52 增强治疗和再生效果(3D vs 2D)。球状体促进组织修复，减少最后的萎缩。 SCID小鼠的缺血再灌注损伤。
47 提高生存率和治疗效果(3D vs 2D)。更高的存活率，血管生成功效和分化成上皮细胞。对缺血皮瓣功能恢复效果更佳。 小鼠缺血皮瓣模型。
37 提高生存率、旁分泌和治疗效果(3D vs 2D)。VEGF、HGF、TSG-6分泌增多。损伤部位细胞凋亡和组织损伤少，血管化程度高。 大鼠肾脏缺血再灌注损伤。
脐带
33 高再生和治疗效果(3D vs 2D)。增强细胞存活，血管生成和细胞粘附分子和生长因子(VEGF, FGF2, ICAM, VCAM和NG2)的表达。球形移植可改善肢体挽救性和减轻纤维化。 小鼠后肢缺血模型。
50 增强再生和治疗效果(3D vs 2D)。ALT、AST、总胆红素下降较快。球形治疗可提高血清IFN-g和IL-6水平，降低TNF-a水平。 ccl4诱导的急性肝衰竭小鼠模型。
41 条件培养液(3d vs 2D)治疗效果更高，球形条件培养液减轻组织破坏，减少滑膜炎症和骨侵蚀。 佐剂诱导的wistar大鼠关节炎。
表3
在活的有机体内MSC球形细胞的治疗效果。
3.7。本研究的局限性

这项研究有一些局限性。首先，在细胞来源和用于制造MSC球体的技术上存在一定程度的异质性。第二，由于技术因素，有许多出版物被排除在外，但仍然持有可能与本研究相关的结论。最后，在大规模随机对照试验中检验MSC真正益处的临床研究仍然缺乏。

4.结论

根据文献回顾，我们可以得出结论，骨髓是产生球状体的最常用来源，其次是脂肪组织和脐带。虽然MSC可以从骨髓、脂肪组织、脐带、胎盘等许多成人组织中获得，但由于供体的不同、广泛的体外细胞培养扩展和临床试验结果不一致，这些来源存在一定的局限性[14，59]．在这一领域，来自人类诱导多能干细胞(iPSC)的间充质干细胞在过去十年中作为一种极好的治疗策略出现，以克服间充质干细胞来源和供体间的局限性可变性、衰老及培养[60- - - - - -62]．人ipsc来源的MSC具有更高的增殖潜能和端粒酶活性以及免疫调节和血管生成特性，这些特性已在不同的疾病临床前模型和临床试验中得到证实[61，63- - - - - -66]．有趣的是，Ding等人在小鼠心脏移植模型中证实，在封装的3D球体中培养的小鼠- ipsc来源的MSC显示出更强的免疫调节[67]．

最常用的细胞聚集方案是悬挂滴技术，其次是强制聚集，低附着，自发组装，然后是壳聚糖膜和透明质酸凝胶。

这里的证据表明，MSC的特征通过3D培养得到增强。选取的28篇文章的结果表明，MSC呈球状时表现出更好的干性、血管生成、分化潜能、细胞因子分泌、旁分泌和免疫调节作用。在进行这篇综述时，在美国国立卫生研究院(NIH)的网站上还没有发现使用MSC球体的人体试验。

在此背景下，基因工程MSC或三维培养，表达和分泌重要的旁分泌和免疫调节因子，如IDO、PGE2和TSG-6，提示这可能增加MSC的体内治疗效果[23，31，42，43]．

与单层培养相比，三维形态的间充质干细胞作为一种有吸引力的治疗应用。然而，MSC球状体的实际治疗效果以及相关机制和途径还需要更多的研究来评估。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

作者要感谢Cellus Medicina Regenerativa的Anibal Romero和纽约大学牙科学院的Martin Pendola提供的意见，帮助改进了这份手稿。本研究由Corporación de Fomento de la Producción CORFO 17PIDE-80689资助Cellus Medicina Regenerativa S.A和Cellus Biomedica。

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